Посещений:
БОЛЕЗНЬ ГЕНТИНГТОНА



Терапевтические подходы

RNAi mechanisms in Huntington’s disease therapy: siRNA versus shRNA
• Sebastian AguiarEmail • Bram van der Gaag and • Francesco Albert Bosco Cortese
Translational Neurodegeneration20176:30 https://doi.org/10.1186/s40035-017-0101-9

Huntington's Disease (HD) is a genetically dominant trinucleotide repeat disorder resulting from CAG repeats within the Huntingtin (HTT) gene exceeding a normal range (>?36 CAGs). Symptoms of the disease manifest in middle age and include chorea, dystonia, and cognitive decline. Typical latency from diagnosis to death is 20 years. There are currently no disease-modifying therapies available to HD patients. RNAi is a potentially curative therapy for HD. A popular line of research employs siRNA or antisense oligonucleotides (ASO) to knock down mutant Huntingtin mRNA (mHTT). Unfortunately, this modality requires repeated dosing, commonly exhibit off target effects (OTEs), and exert renal and hepatic toxicity. In contrast, a single AAV-mediated short-hairpin RNA (shRNA) dose can last years with low toxicity. In addition, we highlight research indicating that shRNA elicits fewer OTEs than siRNA when tested head-to-head. Despite this promise, shRNA therapy has been held back by difficulties controlling expression (oversaturating cells with toxic levels of RNA construct). In this review, we compare RNAi modalities for HD and propose novel methods of optimizing shRNA expression and on-target fidelity.
Huntington's Disease (HD) является генетическим доминантным нарушением тринуклеотидных повторов, вызываемым CAG повторами в гене Huntingtin (HTT) (хромосома 4p16.3) превышающими нормальные пределы (> 36 CAGs). Повторы CAG известны как polyglutamine (polyQ) участок и его длина предопределяет тяжесть и возрастное начало фенотипических отклонений. Величина популяционного возникновения составляет 7 на 100000 у людей европейского происхождения. Симптомы болезни проявляются в среднем возрасте и включают хорею, дистонию, снижение познавательной способности и поведенческие нарушения. Обычно латентное состояние от диагностики до смерти составляет 20 лет.
Характер наследования болезни аутосомно доминантный с 50% риском, если родитель является носителем. Возраст начала и тяжесть может быть модифицирована внешними условиями и др. модифицирующими генами.
PolyQ повторы нестабильны во время репликации и нестабильность повышается с увеличением количества повторов (28-35), потомки могут получать наивысшую копию с полной пенетрантностью. Этот феномен известен как генетическое ожидание, при котором возраст начала наступает раньше в последующих генерациях.
Несмотря на развязное поведение, увеличивающее репродуктивную способность у затронутых индивидов, нет доказательств, что они имеют больше детей. Мутантный ген HTT не оказывает какого-либо благоприятного эффекта кроме как пониженного показателя раковых опухолей из-за активированного p53 при HD [1, 2] Fig. 1.

Huntingtin mutation and basal ganglia. Huntington's results from an expanded polyglutamine tract, encoded by CAG repeats. The basal ganglia is the most severely affected region in HD

Pathology


Точная молекулярная патология болезни Гентингтона пока в начале исследований. HTT экспрессируется во всех клетках млекопитающих и, как известно, взаимодействует с более чем 100 генами. Наивысшие уровни экспрессии наблюдаются в головном мозге и яичках [3]. Хотя гомозиготная делеция гена для HD является эмбриональной леталью у млекопитающих, люди, гетерозиготные (+/-) по этому гену нормальные [4].
Сплайсинг оставляет после себя некоторые polyQ пептиды, которые формируют H-мостики и агрегируют. Затем они образуют внутриклеточные включения, ранний признак патологии [5]. HD обнаруживает повышенную excitotoxicity, активацию глии и увеличение астроцитов [6], а также изменения в эпигенетической картине [7]. HTT может вмешиваться в межклеточные взаимодействия, подобно трофической поддержке и может улучшать свое поведение с помощью эктопического BDNF [8]. Мутантный HTT подавляет аксональный транспорт BDNF-содержащих пузырьков в нейронах между корой и полосатым телом (corticostriatal) [9].
Не совсем понятно, почему, но HTT воздействует избирательно на клетки определенного типа - особенно на нейроны базальных ганглиев и striatal medium spiny нейроны, где цитотоксичность проявляется раньше всего. Др. затрагиваемые области включают черную субстанцию и слои 3, 5 и 6 коры головного мозга [10].

Therapeutic strategies


Большинство терапевтических вмешательств при HD нацелено на нижестоящие последствия и симптомы, вызываемые патогенными мутациями гена Huntingtin (HTT), тогда как лишь немногие терапевтические воздействия нацелены на сам mHTT (see Table 1) [11]. Единственным разрешенным лекарством является tetrabenzene, который облегчает моторные аномалии. Отсутствует болезнь-модифицирующая терапия у пациентов на сегодня. Известно, что зависимое от условий замалчивание трансгенного мутантного HTT (mHTT) устраняет HD у мышей, демонстрируя, что mHTT необходим для прогрессирования болезни HD [12].

Table 1

Disease Modifying Experimental Therapies for HTT



Вмешательство малых молекул при HD является волнующим (хотя в основном паллиативным) но оно находится вне рамок данного обзора [13-20]. Целенаправленное воздействие на первичную причину HD становится возможным в последние годы благодаря улучшениям в интерференции РНК с помощью small noncoding RNAs (sncRNAs), таких как synthetic siRNA и shRNA [21]. Несмотря на вариации конструкций RNAi, все они действуют путем соединения с мРНК гена мишени, чтобы или блокировать транскрипцию или вызывать деградацию транскриптов Fig. 2.



Fig. 2 Mechanisms of siRNA versus shRNA. shRNA may be episomal or integrate into the genome via lentiviral transfection for greater stability. Both pathways converge at the RISC complex shRNA is a synthetic RNA molecule with a short hairpin secondary structure. Because it is delivered on a DNA plasmid rather than as double stranded RNA (e.g., siRNA), shRNA can be continually expressed for months or years.

После транскрипции продукт напоминает pri-microRNA и подвергается процессингу с помощью Drosha, чтобы давать pre-shRNA, которая экспортируется из ядра с помощью Exportin 5. Затем pre-shRNA преобразуется с помощью Dicer и соединяется с комплексом RISC. Пассажирская нить деградирует, а анти-смысловая наводящая (guide) нить направляет RISC, чтобы деградировать комплементарную мРНК мишень (такую как HTT).
Большая часть HD RNAi терапии, кстати, базируется синтетических siRNAs или antisense oligonucleotides (ASOs), доставляемых голыми, сконъюгированными с холестеролом или с lipofectamine. К сожалению, эти лекарства нуждаются в повторных введениях, обчно обнаруживают эффекты вне мишени и вызывают почечную и печеночную токсичность [21] Fig. 3.



Fig. 3 Comparison of shRNA and siRNA. Notably, shRNA does not require regular dosing that siRNA-based therapeutics do

Off-target effects (OTEs): shRNA vs siRNA


Достоверность эффектов вне мишени для shRNA в противовес siRNA - открытый вопрос. Некоторые исследования указывают, что siRNA вызывают больше OTEs, чем shRNA.
Mehaffey et al. [22] обрабатывали клетки карциномы HCT-116 или дуплексной siRNA или индуцибельной shRNA одной и той же стержневой последовательности, нацеленной на ген TP53 и анализировали изменения в экспрессии гена спустя 24 ч воздействия microarray hybridization. Они установили достоверно более высокую пропорцию активированных вне мишени генов в клетках, обработанных siRNA, чем shRNA. Степень попадания в мишень была сравнима.
Затем Klinghoffer et al. [23] из Merck & Co повторили этот эксперимент, включив дополнительные мРНК мишени: CDKN1A, E2F1, EZH2, FDXR. shRNA оказалась сравнимой с siRNA в разных концентрациях, авт. использовали также стабильную клеточную линию, экспрессирующую их конструкции, чтобы проконтролировать дифференциальную эффективность трансфекции. Результаты подтвердили предыдущую работу, показавшую как более существенный нокдаун с помощью shRNA, так и меньшее количество побочных эффектов (Для CDKN1A, 470 транскриптов подавлялись siRNA в противовес19 с помощью shRNA - из которых 2 были общими). Трансдуцируемая с помощью лентивируса или экспрессируемая в стабильно индуцибельной клеточной линии, shRNA обнаруживала значительно меньше OTEs, чем при трансфекции siRNA с той же самой19-mer стержневой последовательностью. Использование более низких доз siRNA не достигала того же самого соотношения меэжду сигналом и шумами, как при shRNA. Авт. использовали одиночный промотор (H1) - но попытки использования промоторов варьирующей силы могло бы дать более урожайную и контролируемую систему.
Сравнение крупно-масштабных скринов RNAi , двух с использованием shRNA [24, 25] и одно с использованием siRNA [26], показало, что скрины shRNA обнаруживают минимум OTEs, тогда как скрины siRNA обнаруживали преобладание OTEs.
Др. группа установила, что shRNA достоверно более мощные, чем siRNA на молярной основе [27]. Дифференциальный потенциал и аккуратность shRNA в противовес siRNA может быть объяснена несколькими факторами: shRNA воздействует, скорее всего, подобно эндогенно возникающим pri-miRNA шпилькам - транскрипт shRNA, управляемый промотором, таким как RNA polymerase II (вместо обычно используемого промотора RNA PolIII ) полиаденилируется, преобразуется с помощью Drosha в ядре, становится предметом нормально экспорта из ядра и загружается на RISC комплекс в цитоплазме [28].
siRNA не подвергается подобному преобразованию, нуждается в более высоких концентрациях и частых введениях, чтобы достичь сравнимого нокдауна. Незащищенная siRNA в цитоплазме может быть подвержена деградации и модификациям, которые снижают её связывание с мишенью.
shRNA может быть ещё больше оптимизирована в форму искусственных pri-miRNA транскриптов. Это достигается с помощью внедрения последовательности shRNA в контекст miRNA, такой как miR-30 stem loop предшественница. Этот метод был использован для произвольного контроля уровней p35 in vitro и in vivo, даже когда конструкция присутствовала в виде одиночной геномной копии [29]. Базируясь на этой искусственной стратегии pri-miRNA датская компания по генотерапии UniQure достигала мутантного HTT аллеля путем специфического целенаправленного воздействия посредством AAV5 на гуманизированную мышиную модель HD [30].

Tough decoy RNAs (TuDs)


Независимо от действительной степени событий вне мишени для shRNA, появляются комплементарные стратегии, чтобы минимизировать (хотя и относительно низкие) shRNA OTEs. Одной из таких стратегий по снижению пертурбаций генов вне мишени, является использование "tough decoy RNAs" (TuDs), котрая преимущественно затрагивает РНК с высокой комплементарностью для смысловой нити shRNA. Такие TuDs разработаны, чтобы связывать смысловые нити shRNA прежде, чем они получат возможность ассоциировать с генами вне мишени.
Mockenhaupt et al. [31] использовали TuDs совместно экспрессируется с shRNAs, предназначенными целенаправленно воздействовать на AAV-поставляемый вирус hepatitis C, чтобы одновременно снизить эффекты вне мишени shRNA и усилить подавление вне мишени, вызывая уменьшение количества генов вне мишени с 334 без использования TuD, до 186 генов при одновременной экспрессии TuD. Очевидно. что этот подход может быть применен к существующим конструкциям shRNA в противовес всем ранее предложенным стратегиям, которые требуют конструкции de novo shRNAs, оптимизированных в отношении специфичности к смысловой нити.

Further shRNA considerations


shRNA осуществляет более длительное воздействие, но доставка представляет проблему. shRNA может доставляться in vivo, используя вирусный вектор. Adenoviral-associated viruses (AAVs) являются векторами, выбираемыми для клинических испытаний благодаря их низкой иммуногенности, многочисленным тканеспецифическим серотипам и очень низкой доле интеграции в хромосомы (предохраняет от инсерционного мутагенеза) [32].
Ключом надежности AAVs является то, что конструкция ими доставляемая остается эписомной. В последнее время, две базирующихся на AAV терапии были одобрены (GlaxoSmithKline's SCID терапия и uniQure's lipoprotein lipase deficiency терапия), при этом очень многие AAV-базирующиеся терапии проходят клинические испытания [33].
Исследователи HD также забросили shRNA, поскольку ранние исследования показали превышение дозы, когда аппарат не кодирующих РНК оказывался перенасыщен экзогенными shRNA и эндогенными ncRNAs, которые не могли конкурировать [34]. В др. исследовании бвло обнаружено драматическое, продолжительное улучшение при разных дозах используемых shRNA [35].
siRNA, как было установлено, снижает HD патологию in vivo [36]. shRNA обеспечивает длительно длящийся нокдаун и снижение печеночной и почечной токсичности. Основной проблемой, касающейся shRNA, является внутриклеточная overdose - clogging up аппарата процессинга miRNA. Изменение силы экспрессии конструкции shRNA может стать решением этой проблемы.

Modulating promoter strength


Сила промотора является критическим фактором эффективности нокдауна с помощью shRNA и токсичности трансфицируемых клеток. Промоторы Class III polymerase, такие как U6, обычно используются при применении siRNA, поскольку они являются более сильными промоторами, способными к мощному нокдауну Fig. 4.



Fig. 4 Construct design for promoter modulation. Various promoters can be coupled with mHTT variants for alle-specific silencing (and compared to a control such as dRho). An IRES followed by GFP may be used to confirm construct expression. The "special" promoters include the HTT promoter itself, and the PGC1-a promoter which is activated by TFAM when HTT aggregates induce autophagy or lysosome formation

Однако, избыточная экспрессия shRNA с промоторов class III может приводить к цитотоксичности, активации реакций врожденного иммунитета и может даже оказаться фатальным in vivo уже после 1 мес. устойчивой экспрессии.
Одно из исследований Grimm et al. [34] продемонстрировало, что shRNA, нацеленная на печень, вызывает цитотоксичность печени из-за высокого уровня устойчивой экспрессии у мышей (аустые AAV вектора не были токсичными в используемых дозах). Болезненность зависела от последовательности shRNA и была связана с подавлением эндогенных miRNAs, указывая на конкуренцию с эндогенными shRNA за доступ к ограниченному источнику аппарата РНК, участвующего в процессинге РНК, таком как ядерный karyopherin exportin-5, который легко насыщается (токсичность оказывалась сниженной после избыточной экспрессии exportin-5).
Авт. оказались способны разрешить проблему с феноменом передозировки путем оптимизации дозы shRNA в вирусном векторе и путем ослабления промоторной последовательности, успешно используя этот метод для ослабления hepatitis B у мышиной модели in vivo.
Множественные shRNAs могут быть клонированы в доступных векторах, содержащих разные промоторы, такие как: U6, H1, CMV, PGK и UbiC. Эти промоторы варьируют по своей прирожденной силе, обусловленной различиями в CpGs проксимальнее TATA box, эо определяет сродство к РНК полимеразе. Кроме того, сила промотора варьирует как функция специфичных для типов клеток программ транскрипции [37].

Negative feedback-driven oscillating promoters


Рис. 5 показывает, что shRNA против mHTT д. быть стоихометрически эквивалентна промотору HTT человека и может быть использована для управления экспрессией конструкций shRNA. Всякий раз, когда клетки экспрессируют HTT эндогенно, то конструкция shRNA также д. экспрессироваться со сходной частотой. Это может быть результатом паттерна осцилляторной экспрессии, которая удерживает уровни HTT относительно низкими.



Fig. 5 Negative feedback loop mechanism. If the promoter of HTT is used to drive the shRNA construct, a stoichiometric equivalent of shRNA may be expressed to neutralize mHTT levels. A similar strategy may be employed for constructs activated during autophagy and lysosomal biogenesis, such as PGC1a. Then, the shRNA will be expressed when HTT aggregates have formed to induce autophagy or clearance - shRNA on demand and only when required by the cell



TFEB is a transcription factor and master regulator of lysosomal biogenesis and autophagy.


TFEBэкспрессируется во время аберрантных лизосомных состояний, подобных lysosomal storage diseases (LSDs), амилоидные болезни (Alzheimer's, Lewy Body dementia) и болезнь Гентингтона. Избыточная экспрессия TFEB редуцирует патогенные эффекты mHTT in vitro [38]. TFEB активируется с помощью PGC1a, и TET-on кондиционной индукции PGC-1a и, как было установлено, ослабляет HD патологию у мышей путем элиминации агрегатов из mHTT белка и оксидативных стрессов посредством TFEB [39]. Кроме того, CLEAR-box последовательность (5'-GTCACGTGAC-3' присутствует в регуляторном регионе лизосомных генов) в промоторе PGC-1a (известный сайт связывания для TFEB) может быть использован для управления экспрессией экспериментальных shRNA.
Клетки с включением телец mHTT обнаруживают повышенную аутофагию и активность TFEB. Теоретически, TFEB д. экспрессироваться на высоком уровне только, когда агрегаты mHTT достаточны и вызывают компенсаторную аутофагию. Аутофагия и shRNA нокдаун mHTT будут также возникать, потенциально редуцируя патогенные скопления mHTT вследствие редукции экспрессии TFEB, проявления аутофагии и экспрессии конструкции shRNA. Такой механизм осцилляции может действовать как негативная петля обратной связи, обеспечивая, чтобы shRNA не экспрессировались в повреждающей степени , а только когда необходимы Fig. 6.



>span class=ari8> Fig. 6 Mechanism of TFEB at the PGC1-a promoter. The PGC1a promoter contains a CLEAR-box that is known to be bound by TFEB, a transcription factor induced during autophagy and lysosomal biogenesis. A construct being the PGC1a promoter CLEAR-box would be induced by TFEB under conditions of intracellular proteotoxicity due to HTT aggregation. By this mechanism, on-demand suppression of HTT could be achieved



Targeting the CNS


Blood-Brain Barrier (BBB) является существенной проблемой для доставки лекарств в WYC/ Плотные соединения между эндотелиальными клетками, выстилающими капилляры в головном мозге, образуют надежный защитный барьер, делающий возможным только транспорт или небольших растворимых в липидах молекул, или крупных молекул, транспортируемых благодаря носителям или благодаря рецепторам [40]. Поэтому проблематична разработка стратегий лечения RNAi, принимая во внимание, что терапевтические siRNA и shRNA молекулы обычно слишком велики, чтобы проникать через BBB. Обычные генотерапевтические воздействия поэтому часто используют прямое стереотаксическое хирургическое вмешательство, которое позволяет инъецировать вирусные ДНК конструкции непосредственно в интересующее место [41]. Эта техника крайне инвазивна, и приводит только к локальному действию лечения в месте инъекции, жто может иногда казаться соблазнительным, но обычно целью большинства терапевтических стратегий является воздействие на весь головной мозг. Недавние успехи, однако, в технологии вирусных и не вирусных векторов открыли новые возможности генотерапии в ЦНС посредством сосудистой сети, включая RNAi. shRNA и siRNA, могут быть доставлены в головной мозг следующими путями: вирусными векторами (в основном, AAV) и экзосомами/липосомами.
В отношении вирусной генотерапии, иммуногенность AAVs в отличие, напр., от лентивирусов) была практически минимальной [42]. AAVs не интегрируются (конструкция остается эписомной), снижение интеграции в хромосомы уменьшает риск возникновения рака, который испортил два предыдущих клинические испытания генотерапии с помощью ретровирусов. Оптимизация силы экспрессии конструкции, которая является др. препятствие на пути. Трансдукционная эффективность AAV, ключевой барьер на пути терапии, быстро увеличивается благодаря целенаправленной эволюции капсид, осуществленной компаниями, такими как 4D Molecular Therapeutics [43] (в самом деле, в последнее время EMA разрешила три генотерапии -- первой стала UniQure's lipoprotein lipase Glybera в 2012, которая оказалась коммерческим провалом, но с клиническим успехом) [44].
UniQure достигла преклинической проверки концепции в отношении генотерапии болезни Гентингтона (AMT-130), которая состоит из AAV (серотип 5) вектора, несущего искусственную микро-РНК. Группа инъецировала AAV5-miRNA билатерально в полосатое тело гуманизированных MTT мышей, выявила достоверный нокдаун и ослабление патологии [45]. UniQure и исследователи из UCSF продемонстрировали, что введение в паренхиму AAV5 (1 х 1013 vector genomes per milliliter) не человекообразных приматов приводит к обширной экспрессии по всему головному мозгу, подчеркивая антероградную трансфекционную эффективность [46]. В обоих случаях применение AAV требовало инвазивного введения в подкорковые структуры головного мозга. Недавние успехи с AAVs выявили перспективу системного и intrathecal введения.
Липосомы, экзосомы и сравнимые с ними наночастицы обладают потенциальны преимуществом над вирусными векторами. Эти наночастицы обнаруживают меньшую иммуногенность, чем вирусы, и они пригодны для модификаций и искусственных изменений (таких как PEGylation, конъюгация с пептидами, проникающими в клетки, и самонаводящиеся пептиды с тканевым тропизмом). Однако, их трансдукционная эффективность сильно отстает по сравнению с вирусными векторами. Kumar et al., [47] продемонстрировали доставку через кровеносные сосуды siRNA в головной мозг, соединив siRNA c rabies virus glycoprotein (RVG), который отвечает in vivo за защиту от фатального вирусного энцефалита у мышей и галавным образом нацелен на нейроны, благодаря специфическому связыванию с ацетилхолиновыми рецепторам. Недавнее исследование, в котором использовали эту технику, было продемонстрирован высоко эффективный нокдаун (62% уменьшение белка) характерной для б. Алцгеймера мишени BACE1с помощью системных инъекций целенаправленных экзосом, несущих RVG [48].
Лр. терапевтическая стратегия по доставке желаемых агентов через BBB может заключаться в 'разрыхлении' плотных соединений, которое может быть достигнуто путём целенаправленного на плотные соединения воздействия claudin-5, сопровождаемое проникновением siRNA, что повышало проницаемость барьера BBB [49].
Системное введение нацеленных на ЦНС векторов было продемонстрировано, но эффективность оставалась низкой. Кроме того, периферические ткани, не мишени, (особенно печень) подвергались действию лекарства, обнаруживали риски потенциально токсичности и нуждались в больших количествах лекарства, что очень затратно. Системная доставка векторов в ЦНС рассмотрена Boudenx et al. [50].
Intrathecal введение в CSF ограничивает риски вне мишени из-за ограниченного воздействия на периферические ткани лекарства и требует более низких доз лекарства. Bey et al. [51] продемонстрировали, что доставка в спинномозговую жидкость AAV9 приводит к мощной экспрессии конструкции, несущей промотор для нейрон-специфического synapsin 1, управляющего GFP. Эта работа дополняет результаты Hordeaux et al. 2017, пытавшихся осуществить intrathecal введение AAV9/10, несущих acid-α-glucosidase (GAA), ген, отвечающий за болезнь Pompe. Наблюдалось драматическое исправление симптомов Pompe у GAA-KO мышей, моделирующих болезнь Pompe [52]. Прогресс в AAV-зависимой генотерапии для многочисленных болезней ЦНС рассмотрен в работе Hocquemiller et al. [53].

Conclusion


There are currently no disease-modifying treatments for Huntington's disease. RNAi is an exciting area of therapeutic development that offers substantial patient benefit and even a cure. Recently, most research in HD RNAi has focused on synthetic siRNA and antisense oligonucleotides. Despite their advantages, these molecules have several drawbacks: frequent, high dosing results in toxicity and the drugs are not targeted specifically to the brain. In contrast, shRNA delivered by AAV can be a small single dose treatment offering long-lasting expression.
Gene therapy itself was slowed dramatically after the tragic deaths of several patients in clinical trials. In recent years, gene therapy has advanced dramatically due to innovations in the efficiency of non-integrating viral vectors (e.g., AAVs). Similarly, shRNA was held back by limitations in control over shRNA dosage per cell. By using promoters of different strength, it may be possible to finely tune and optimize shRNA expression to minimize toxicity while maximizing target knockdown. This line of research is relevant to many diseases amenable to RNAi therapy in which aberrant gene expression is a causal factor.