Гемофилия B (HB) является X-сцепленным нарушением, возникающим 1:25000 рождений мальчиков, вызывается дефицитом каогуляционного фактора IX (FIX). При тяжелых формах (менее 1% активности FIX), она может приводить к частым кровотечениям, снижению качества жизни и ранней гибели, если остается не леченной.¹ Сегодня лечение базируется на внутривенных (IV) введениях происходящего из плазмы или рекомбинантного FIX концентрата. Осложнения в форме нейтрализующих антител (ингибиторов) к введенному белку могут возникать у 1.5%-3% пациентов с HB.^{2, 3} Хотя частота появления ингибитора низкая, угрожающие жизни осложнения, такие как аллергическая и анафилактическая реакции чато ассоциируют с появлением ингибиторов.^{4, 5} Сегодня фокус смещается на альтернативные подходы по предупреждению или воздействию на ингибиторы.⁶

Lentiviral vectors (LVs), происходящие из HIV-1, являются мощными гено-терапевтическими устройствами для трансдукции и долговременной стабильной экспрессии в широком диапазоне делящихся и неделящихся клеток in vitro и in vivo. Как и у др. векторов для генотерапии узким местом у лентивирусов остаются безопасность, специфичность и эффективность. Частично это связано с препятствиями, вызываемыми интеграцией γ-ретровирусных векторов в геном клетки мишени, системы третьего поколения упаковки лентивирусов подверглись сильной оптимизации конструкции и разработке self-inactivating long terminal repeats (SIN-LTRs) и гетерологичных промоторов, минимизирующих риски компетентности к репликации, инсерциональному мутагенезу или аберрантной экспрессии соседних кодирующих регионов клетки.^7-9 Терапия с помощью гематопоэтических стволовых клеток, которые включают эти новые вектора, тестировалась на нескольких болезнях человека (Wiskott-Aldrich syndrome, X-linked severe combined immunodeficiency, β-thalassaemia, adrenoleukodystrophy, metachromatic leukodystrophy, etc).^{8, 10}

Большинство синтетических LVs псевдотипированы с альтернативным оболочечным гликопротеином, таким как VSV-G (VSV-LV) для повышения стабильности и широкого клеточного тропизма. Для большей части использования in vivo, однако, необходима клеточная избирательность. Хотя псевдотипирование с помощью специфических оболочечных гликопротеинов может изменить тропизм в направлении определенного типа клеток, таких как макрофаги или нейроны, ¹¹ имеется риск доставки гена вне мишени, что может приводить к аномальной экспрессии или иммунной реакции на трансген или вектор. Стратегии, такие как использование элементов ткане-специфических промоторов или базирующегося на microRNA (miRNA) направлении мимо цели в не имеющих значения типах клеток, могут ограничить экспрессию генов типом клеток, важных для конкретного терапевтического использования, но ограничены немногими мишенями.^{12, 13}

B клетки являются важными мишенями для иммунотерапии.^{14, 15} Однако, преимущественно покоящиеся B клетки, подобно др. арестованным в G0 молчащим клеткам гематологической системы, нуждаются в cytokine- или CD40-обусловленной стимуляции в G1 фазу, чтобы стать эффективно трансдуцированными с помощью обычных лентивирусных или ретровирусных векторов, которые нежелательны для использования in vivo или для изучения толерантности.^16-18 Measles virus (MV) hemagglutinin (H) и fusion (F) псевдотипированный по оболочечному белку LVs (MV-LV), как было установлено, эффективно проникает и интегрируется в не активированные B и T лимфоциты.¹⁹ Важно, что MV-LV может быть также использован для генерации целенаправленных векторов, которые ограничивают доставку генов клетками, выбранными по уровню проникновения в клетки.^{20, 21} Эта стратегия использует мутантные сайты связывания рецепторов в H белке и слияние single chain variable fragment (scFv), специфичного для выбора рецептора мишени. Среди прочих, сгенерированы LVs поставляемые гены в лимфоциты с беспрецедентной избирательностью. ²² Будучи нацеленной на CD19 и CD20, была достигнута избирательная доставка генов в покоящиеся B лимфоциты человека. ^21-25

В данном исследовании были расширены предыдущие исследования с использованием CD20 (hCD20) человека в качестве антигене мишени для связывания scFv с B клетками в MV-LV векторной системе. Удалось подтвердить, что MV-LV с рецепторной специфичностью к CD20 (CD20-LVGFP) эффективно трансдуцирует покоящиеся B лимфоциты человека или трансгенные (tg) мышиные B клетки, экспрессирующие hCD20. Дикого типа (WT) мышиные B клетки не подвергались целенаправленному воздействию этого вектора, даже после активации с помощью lipopolysaccharide (LPS), демонстрируя удивительную специфичность этого подхода. CD20-LVGFP был использован, чтобы упаковать immunoglobulin G (IgG) тяжелую цепь, конъюгированной FIX кассеты человека (CD20-LVhFIX-IgG), и аутологичные ген-модифицированные hCD20-tg B клетки был перенесены, чтобы обеспечить иммунную толерантность к FIX in у мышей, моделирующих HB. Использование покоящихся B клеток в качестве вызывающих толерантность антиген-презентирующих клеток (APCs), в комбинации с IgG fusion кассетой, чтобы вызывать толерантность,^{26, 27} приводило к достоверному предупреждению развития антител к FIX. Далее было показано, что ex vivo лентивирусная трансдукция B клеток человека не приводит к обнаружимому подъему воспалительных цитокинов, подтверждая минимальную иммунную реакцию при этом подходе.

Итак, с модифицированным геном B клетки, экспрессирующие immunoglobulin G (IgG) слитые белки, вызывают толерантность к некоторым аутоиммунным и др. моделям болезней. Была разработана IgG-human factor IX (hFIX) лентивирусная слитая конструкция, нацеленная специфически трансдуцировать клетки, экспрессирующие человеческий CD20 (hCD20). Специфичное для рецептора повторное целенаправленное воздействие с помощью мутантного оболочечного гликопротеина из measles virus (MV)-лентивирусного вектора (LV) и добавление одиночной цепи вариабельного, специфичного к hCD20, вызывало доставку гена в первичные человеческие и трансгенные hCD20 мышиные B клетки с высокой специфичностью. Этот протокол не требует и не нуждается в индуцированной активации В клеток. Используя эту стратегию, мы продемонстрировали индукцию гуморальной толерантности в результате супрессии продукции анител против hFIX у мышей, моделирующих hemophilia B (HB). Это многообещающий метод разработки терапии В клеток для индукции антиген-специфичной толерантности при болезнях человека.