Доминантно наследуемое, мультисистемное заболевание myotonic dystrophy type I (DM1) вызывается увеличением повторов триплетов CTG в гене DMPK и является довольно распространенной формой мышечной дистрофии с началом болезни у взрослых. Устранение токсических, повторяющихся CUG РНК является терапией для данной болезни. Мы описали нацеленную на РНК Cas9 (RCas9) систему, которая обеспечила эффективное устранение проявлений DM1 путем доставки в мышцы взрослых мышей poly(CUG) DM1, используя adeno-associated virus (AAV). Мы наблюдали элиминацию CUG РНК, восстановление с CUG фокусами ассоциированного белка Mbnl1 в дикого типа субклеточной локализации, исправление паттернов DM1-типа альтернативного сплайсинга в генах кандидатах, включая напряжением управляемые chloride channel 1 (Clcn1), ответственные за проявления миотонии, восстановление окрашивания Clcn1 и уменьшение ядер в центре мышечного волокна. Полученные результаты подтверждают, что RCas9 является мощным долговременным in vivo терапевтическим средством для DM1.
Миотоническая дистрофия типа 1 это аутосомно наследуемое нарушение, характеризующееся увеличение CTG повторов в гене DMPK. Повторяющиеся РНК, продуцируемые этим локусом образуют ядерные фокусы РНК (1), которые секвестрируют РНК-связывающие белки, такие как MBNL1 (2, 3) и устраняют их активность по гомеостатическому процессингу РНК (4, 5). Возникающая в результате потеря функции MBNL1 связана с сотнями дефектами сплайсинга, вызывающими миотонию и прогрессирующую мышечную дегенерацию (4, 6, 7). Поскольку DMPK широко экспрессируется, то DM1 патология является мультисистемной, приводящей к субкапсулярной катаракте, когнитивным дефектам и дефектам проводимости в сердце, которые вносят вклад в ассоциированную с DM1 смертность (8). На сегодня доступное лечение DM1 не является адресным, нацеленным на этиологию болезни, затрагивающей только в США более 30000 пациентов, а недавний провал в клинике многообещающих antisense oligonucleotide (ASO), нацеленных на CUG повторяющи еся РНК (clinicaltrials.gov identifier: NCT02312011) подчеркивают необходимость новых терапевтических подходов. Исследуются технологии, нацеленные на увеличение связанных с DM1 повторов на уровне ДНК и РНК. Хотя удаление этих крупных треков из ДНК, сопровождаемое репарацией в их отсутствие, возможно (9), этот подход по геномному инженерингу пока не реализуется с высокой эффективностью. ASOs предоставляют способ привлечение патогенных РНК непосредственно, но они д. постоянно и повторно вводиться в течение жизни и обнаруживают слабое распределение по мышцам в клинике. RNA interference (RNAi) может быть закодировано в аденоассоциированном вирусном векторе, чтобы поддерживать долговременную, целенаправленную доставку в ткани человека (10), но обычно не затрагивает эффективно повторяющиеся РНК.
С помощью переориентирования CRISPR/Cas9 системы преобразования генома, мы недавно продемонстрировали способность Cas9 эффективно воздействовать на РНК (11) и устранять экспансию микросателлитных повторяющихся РНК [Batra et al, 2017] в клетках человека. Используя nuclease-null Cas9 (dCas9), слитую с РНК эндонуклеазой, эта специфичная к РНК CRISPR система не обнаруживает риска наследственного редактирования генома вне мишени (12). Она доступна как CC-BY-NC-ND 4.0 International license. bioRxiv preprint first posted online Sep. 4, 2017; doi: http://dx.doi.org/10.1101/184408. В этой предварительной публикации (13) оценивалась эффективность различных терапевтических подходов, таких как ASOs (14-16) и Mbnl1 генотерапия (4). Mbnl1 нокаутные модели обнаруживают сходные фенотипы в мышцах (17), когда poly(CUG) связывают и секвестрируют Mbnl1, что приводит к нарушению его физиологического альтернативного сплайсинга и активности по полиаденилированию. Такое Mbnl1-обусловленное нарушение процессинга РНК прямо связано с фенотипическими характеристиками, включая миотонию. Мы упаковали нацеленную на РНК Cas9 систему, состоящую из dCas9, слитую с PIN RNA эндонуклеазой, в AAV-9 и сконструировали второй вектор, несущий U6 промотором управляемую single guide RNA (sgRNA) (18) с CMV-управляемым GFP (Figure 1A). rAAV-9, содержащий PIN-dCas9 , был скомбинирован или с rAAV9, несущим нацеленную на CUG (RCas9-CUG) или не нацеленную sgRNA (RCas9-NT) и вводили (2.5x 1010 vg each) в контр-латеральную tibialis anterior (TA) мышцу 8-нед. HSALR poly(CUG) мышам (N=3), которые экспрессировали 250 CTG повторов, расположенных ниже промотора human skeletal actin (HSA) в мышцах (Figure 1B) (13). TA была исследована спустя 3 недели после инъекции при отсутствии очевидных признаков воспаления (data not shown). Мы наблюдали эффективную элиминацию характерных особенностей CUG повторяющихся фокусов РНК (Figure S1A) и флюоресценции РНК при гибридизации in situ (FISH) (Figure 1C-D) в мышцах, в которые были введена CUG-нацеленная RCas9 система. Этот результат согласуется с предыдущими на миобластах от пациентов с DM1, которые показали сходную последовательность-специфичную элиминацию CUG повторяющейся РНК [Batra et al 2017]. Затем мы предприняли попытку оценить последствия эффективной и специфической элиминации CUG повторяющихся фокусов РНК на фенотипические проявления DM1. Семейство белков MBNL представлено РНК-связывающими белками, ответственными за онтогенетическую регуляцию сотен событий процессинга РНК в разных тканях (5, 19-21). Потеря функции MBNL из-за секвестрации с помощью CUGexp приводит к аномальному сплайсингу многих из его РНК мишеней, включая вставку экзона 7a (содержит кодон преждевременного окончания) в chloride voltage-gated channel 1 (CLCN1), что приводит к распаду, обусловленному бессмысленной последовательностью. Возникающее в результате уменьшение уровня белка CLCN1 вызывает DM1's миотонию. Чтобы оценить потенциал RCas9 по устранению этой DM1-сцепленной spliceopathy, мы впервые оценили локализацию белка MBNL1 в мышечной ткани мышей и наблюдали, что после обработки с помощью CUG-нацеленной RCas9 системы обнаруживается диффузная ядерная локализация MBNL1, сходная с таковой у мышей дикого типа (Figure 2A). Чтобы оценить, действительно ли известные вызванные MBNL1 дефекты сплайсинга уменьшаются, мы проводили RT-PCR с праймерами, фланкирующими альтернативно сплайсируемые экзоны в Clcn1 (Exon 7a), Atp2a1 (Exon 22), Tnnt3 (Exon F) и Ldb3 (известен также как Zasp or Cypher, Exon 11; Figure 2B; N=3). CUG-нацеленная RCas9 способствовала устранению дефектов сплайсинга, так что обнаруживался дикого типа паттерн, как и контралатеральная мышца после введения non-targeting RCas9 системы).
Полученные результаты показывают, что RCas9 поддерживает устранение признаков молекулярных дефектов, ассоциированных с DM1 в мышцах взрослых мышей. Аномальный сплайсинг CLCN1 посредством включения экзона 7a вызывает потерю белка CLCN1 путем включения кодона преждевременного окончания или генерации доминантно-негативного укороченного белка (22, 23). HSALR мыши обнаруживают снижение окрашивания Clcn1 в мышцах (13) это коррелирует с миотонией. Мы наблюдали, что CUG-нацеленные RCas9 устраняют эту потерю белка Clcn1 (Figure 2C), подтверждая восстановление важного генного продукта, важного для патологии DM1. Повреждения мышц и возникающий в результате оборот миофибрилл у HSALR вызывает увеличение фракции центральной нуклеации (4). Этот признак начала регенерации мышц снижается системой RCas9 (Figure 2D-E), указывая, что оборот мышц снижен. Затем мы попытались оценить восстановление альтернативного сплайсинга по всему геному и эффектов вне мишени системы RCas9. Предыдущая работа с использованием RCas9 нацеливания poly(CUG) в миобластах пациентов показала, что RCas9 исправляет ~93% всех событий аномального сплайсинга в мышечных трубках DM1 [Batra et al, 2017]. Мы пришли к аналогичному измерению в мышцах мышей с помощью RNA-seq. В соответствии с RCas9 системой в мышечныъ трубках DM1 людей, система RCas9 в скелетных мышцах мышей способствовала, по крайней мере, частично восстановлению 86% от всех случаев DM1-обусловленного аномального сплайсинга (61% устранено полностью и 25% частично, Figure 3A-B, Supplementary Table 1, N=3), приводя к иерархическому образованию кластеров по всему транскриптому изменений альтернативного сплайсинга в Mbnl1-обработанных мышцах (Figure 3A). Геномное отслеживание треков Clasp1 обнаруживает устранение неправильного сплайсинга экзона 20 в присутствии RCas9 и избыточной экспрессии Mbnl1 (Figure 3C). Более того, специфичная для мышц экспрессия генов специфически активируется (Figure 3D, Supplementary Table 2E) в RCas9- и Mbnl1-обработанных TA мышцах. Эти результаты указывают на то, что RCas9 обеспечивает высоко эффективное устранение основных молекулярных дефектов, ассоциированных с DM1 и вызывает экспрессию мышечных маркеров, указывая на восстановление дифференцировки дисфункциональных мышц, ассоциированных с этой болезнью (24). Нацеленная на РНК терапия, базирующаяся на спаривании оснований нуклеиновых кислот, несет риск альтераций вне мишени в транскриптоме. Ранее мы показали, что элиминация CUG повторяющихся РНК в миобластах пациентов вызывало минимальные эффекты вне мишени на экспрессию генов и была специфической по отношению к крупным повторяющимся РНК, но не затрагивала непатогенные повторы. Чтобы оценить эффекты вне мишени RCas9 in vivo, мы оценивали изменения по всему транскриптому и выявили сотни генов, обнаруживающих изменения в уровнях экспрессии (Figure 3E, Supplementary Table 2). Поразительно, анализ gene ontology (GO) (Supplementary Table 3) с использованием DAVID (25) показал, что топовыми категориями GO выступают изменения экспрессии генов, связанных с "клеточной адгезией", "ангиогенезом" и "адгезией клетка-матрикс" (Figure 3F). Отсутствие эффектов вне мишени, наблюдаемые in vitro, и известные дефекты, связанные с клеточной адгезией, адгезией внеклеточного матрикса (7), и миогенезом (26) при DM1 указывает на то, что эти изменения, скорее всего, обусловленные реверсией DM1-ассоциированной патологии с помощью RCas9 системы. Далее мы оценивали потенциал эффектов вне мишени, оценивая экспрессию Dmpk . Мы не наблюдали отличий в уровнях Dmpk РНК(Figure S1B), это согласуется с исследованиями in vitro, показавшими специфичность RCas9 к длинным poly(CUG) трекам [Batra et al 2017]. Иммунная реакция на Cas9, участвующей в AAV-обеспечиваемой долговременной экспрессии в ткани, является главным соображением для переноса каких-либо базирующихся на CRISPR терапевтических подходов. Недавние попытки доставки Cas9 во взрослые мышцы обнаруживали иммунные реакции в разной степени (27, 28), а детальные оценки выявили адаптивную иммунную реакцию на Cas9 (29). Мы оценивали изменения генной экспрессии между RCas9- и Mbnl-обработанными мышами, чобы определить иммунную реакцию на Cas9 белок и наблюдали обогащение генов, связанных с адаптивной иммунной реакцией (Figure 3G) и не наблюдали существенных отклонений в экспрессии генов, связанных с врожденным иммунитетом (Figure S2). В соответствии с предыдущими исследованиями (29), мы не наблюдали одновременных изменений в морфологии и патологии мышц (Figure 2E) в терминах целостности мышечных фибрилл и центральной нуклеации миофибрилл. Это указывает, что или иммунная реакция на систему RCas9 недостаточна, чтобы вызывать существенные изменения в ткани, или что некоторая степень изменений затушёвывается улучшениями здоровья мышц, вызываемой системой RCas9. Поскольку терапевтический эффект RCas9 доминирует в наших наблюдениях, то будущие исследования д. включать др. модельных животных, лучше воспроизводящих адаптивный иммунный ответ человека. Экспансия микросателлитных повторов вызывает у человека болезни (30, 31), которые часто появляются в результате токсической избыточной функции на уровне повторяющихся РНК и/или аберрантного белка. Поскольку мы не наблюдали мышечных повреждений, вызываемых присутствием системы RCas9, эффективность долговременных исследований и иммунной реакции на систему RCas9 необходимы. Необходимы дальнейшие исследования и в отношении др. болезней экспансии микросателлитных повторов.
