Посещений:
ГЕНОТЕРПИЯ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА



Поиск защитных гид РНК и активируемых ею генов с помощью CRISPR

Ying-Chou Chen, Fahim Farzadfard, Nava Gharaei, William C.W. Chen, Jicong Cao, Timothy K. Lu. Randomized CRISPR-Cas Transcriptional Perturbation Screening Reveals Protective Genes against Alpha-Synuclein Toxicity. Molecular Cell, 2017; 68 (1): 247 DOI:10.1016/j.molcel.2017.09.014
Используя модифицированную версию системы редактирования генома CRISPR исследователи из MIT разработали новый способ поиска генов, которые защищают от специфических болезней.
CRISPR обычно используется, чтобы редактировать или делетировать гены в живых клетках. Однако, исследователи из MIT приспособили её, чтобы случайно включать и выключать определенные наборы генов в крупной популяции клеток, что позволяет исследователям идентифицировать гены, которые защищают клетки от белка, ассоциированного с болезнью Паркинсона.
"Состояние мастерства уже прямо сейчас позволяет целенаправленно воздействовать на два или три гена одновременно и затем наблюдать эффекты, но мы полагаем, что вообще-то необходимо модулировать набор генов, чтобы вызывать некоторые из этих болезней, число которых велико," говорит Lu.

Turning genes on or off


Система редактирования генома CRISPR состоит из фермента, разрезающего ДНК, наз. Cas9, и короткой нити РНК гида, которая нацелена на специфические последовательности генома, сообщающая Cas9, где необходимо сделать разрез. Используя этот процесс, ученые целенаправленно продуцируют мутации в геноме живых животных или делетируя, или вставляя новые гены.
Ученые из MIT устраняли способность к разрезанию Cas9's и преобразовывали белок так, что после соединения с мишенью он привлекал транскрипционные факторы (белки, необходимые для включения генов).
После доставки этой версии Cas9 вместе с РНК гидом в одиночные клетки, ученые смогли целенаправлено воздействовать на одну генетическую последовательность на клетку. Каждая гид РНК может воздействовать на один ген или множественные гены в зависимости от специфической последовательности гид РНК. Это позволило исследователям случайно производить поиск по всему геному генов, которые затрагивают жизнеспособность клеток.
"То что мы решили предпринять стало полностью беспристрастным подходом, где вместо целенаправленного воздействия на интересующие индивидуальные гены, мы осуществляли рандомизированный поиск генов внутри клетки," говорит Lu. "Используя этот подход мы смогли осуществлять скрининг гид РНК, с необычно сильной защитной активностью в модели нейродегенеративной болезни."
Исследователи применили эту технологию к дрожжевым клеткам, которые были генетически преобразованы, чтобы избыточно продуцировать белок, ассоциирующийся с болезнью Паркинсона, известный как alpha-synuclein. Этот белок, который образует глыбки в головном мозге пациентов с болезнью Паркинсона, обычно токсичен в дрожжевых клетках.
Используя такой скрининг, ученые из MIT идентифицировали одну нить гид РНК, которая оказывала очень мощный эффект, сохраняя клетки живыми более эффективно, чем любой индивидуальный ген, которые ранее были найдены для защиты такого типа дрожжевых клеток.
Дальнейший генетический скрининг выявил, что многие гены, включающиеся с помощью этой гид РНК, являются белками шаперонами (chaperone), которые помогают др. белкам укладываться в правильную форму. Исследователи предположили, что эти шапероновые белки могут помогать и соотв. образом укладываться alpha synuclein, что д. предотвращать образование глыбок.
Др. гены, активируемые с помощью этой гид РНК, кодируют белки митохондрий, которые помогают клеткам регулировать их энергетический метаболизм и доставку белков, участвующих в упаковке и транспортировке др. белков. Исследователи теперь изучают, может ли гид РНК включать каждый из этих генов индивидуально или она активирует один или более регуляторных генов, которые затем включают др.

Protective effects


Как только исследователи идентифицировали эти гены дрожжей, они проверили эквивалентные гены нейронов человека, растущих в лаб. чашках, которые также избыточно продуцировали alpha synuclein. Эти гены человека также оказались защищающими от гибели, вызываемой alpha-synuclein, подтвердив, что они могут быть проверены в качестве генотерапии болезни Паркинсона.
Лаб. Lu's теперь использует этот подход к др. нарушениям и исследователи уже идентифицировали некоторые гены, которые, по-видимому, защищают от определенных эффектов, вызываемых старением.

TAxelsen, Tobias M.a | Woldbye, David P.D.

Gene Therapy for Parkinson's Disease, An Update. Journal of Parkinson's Disease, vol. 8, no. 2, pp. 195-215, 2018



Современное лечение Parkinson's disease (PD) заключается в заместительной терапии dopamine, который помимо помимо нескольких побочных эффектов, не задерживает прогрессирование болезни. Область генотерапии открывает потенциальный способ улучшить совр. лечение. Модифицирующие и не модифицирующие болезнь трансгены были протестированы применительно к PD генотерапии на животных и человеке. Не модифицирующие болезнь воздействия действуют целенаправленно на dopamine или синтез GABA , улучшая симптоматику PD при рандомизированных клеинических испытаниях, но остается необходимым тестирование перед использованием для стандартного клинтического использования.Тогда как болезнь модифицирующие мишени, которые теоретичсески обладают возможностью замедлять прогрессирование болезни, некоторые нейротрофные факторы обнаруживают обнадеживающие результаты на преклинических моделях (e.g., neurturin, GDNF, BDNF, CDNF, VEGF-A). Однако, клинические испытания были использованы только для neurturin, и, к сожалению, ни одно испытание не смогло удовлетворить его конечную точку (primary endpoint). Дальнейшие клинические испытания с нейротрофными факторами безусловно заслуживают проверки в отношении действительного замедления болезненного процесса PD. Альтернативным типом генотерапии, опто- и химиогенетика может стать в дальнейшем использование для лечения PD нового геномного редактирования, применимого к индивищдуализированной генотерапии PD.

Titze-de-Almeida, Ricardo; Titze-de-Almeida, Simoneide S.

miR-7 Replacement Therapy in Parkinson's Disease. Current Gene Therapy, Volume 18, Number 3, June 2018, pp. 143-153(11)



В обзоре исследуется вопрос, действительно ли microRNA 7 (miR-7) обладает потенциалом замедлять ход развития болезни Паркинсона (PD). Во-первых, аккуратная экспрессия miR-7 делает возможным нормальное развитие, физиологию и нейрогенез в ЦНС, а также удерживает alpha-synuclein (α-Syn) на физиологическом уровне. Во-вторых, пациенты с PD и parkinsonian MPTP-индуцированные животные обнаруживают достоверное снижение miR-7 в регионах головного мозга, ассоциированных с дегенерацией допаминергических нейронов. Истощение miR-7 в substantia nigra клинических выборок связано с накоплением α-Syn, потерей допаминергических клеток и снижением dopamine в striatum. Следовательно целью заместительной miR-7 терапии является подавление α-Syn и др. связанных с PD генов, достижение успеха для многих мишеней касательно оксидативных стрессов, здоровья митохондрий, гликолиза клеток, апоптоза и подавления активации inflammasome. Заместительная терапия miR-7 обнаруживает поразительный потенциал против критических механизмов нейропатологии. Такое новаторское воздействие может снижать накопление α-Syn в тельцах Lewy и сохранять нейроны жизнеспособными, оставшиеся к моменту диагностики, тем самым происходит замедление прогрессирования болезни на ранней фазе PD, характеризующейся относительно умеренными нарушениями двигательной активности.