Посещений:
ГЕНОМНОЕ И ЭПИГЕНОМНОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ



Нарушения гематопоэтической системы

Genome and Epigenome Editing to Treat Disorders of the Hematopoietic System
Mussolino Claudio, Alzubi Jamal, Pennucci Valentina, Turchiano Giandomenico, and Cathomen Toni
Human Gene Therapy. November 2017, 28(11): 1105-1115. https://doi.org/10.1089/hum.2017.149

The possibility of editing complex genomes in a targeted fashion has revolutionized basic research as well as biomedical and biotechnological applications in the last 5 years. The targeted introduction of genetic changes has allowed researchers to create smart model systems for basic research, bio-engineers to modify crops and farm animals, and translational scientists to develop novel treatment approaches for inherited and acquired disorders for which curative treatment options are not yet available. With the rapid development of genome editing tools, in particular zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the CRISPR-Cas system, a wide range of therapeutic options have been-and will be-developed at an unprecedented speed, which will change the clinical routine of various disciplines in a revolutionary way. This review summarizes the fundamentals of genome editing and the current state of research. It particularly focuses on the advances made in employing engineered nucleases in hematopoietic stem cells for the treatment of primary immunodeficiencies and hemoglobinopathies, provides a perspective of combining gene editing with the chimeric antigen receptor T cell technology, and concludes by presenting targeted epigenome editing as a novel potential treatment option.
Идея модификации геномных комплексов по желанию давнишняя мечта науки, воплотившаяся в реальность с разработкой программируемых нуклеаз. Разные классы сконструированных нуклеаз используются для целенаправленного редактирования генома человека. Клинически значимыми являются zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector (TALE) нуклеазы (TALENs) и CRISPR-Cas система (recently reviewed by Cornu et al.1). В принципе эти программируемые нуклеазы состоят из чрезвычайно специфичной связывающей ДНК части и неспецифического нуклеазного домена.2 Разные системы отличаются в терминах сложности их проекта и осуществляемых процессов, с одной стороны, и их активности и специфичности с др. ZFNs и TALENs состоят из искусственно созданного домена связывания ДНК, дающих модуль цинковых пальчиков или TALE, соотв., которые сливаются с FokI эндонуклеазным доменом. Поскольку FokI домен активен только после димеризации, то два противоположным образом расположенные ZFN или TALEN мономеры используются для внесения разрывов в двойную нить ДНК в сайте мишени. Многообещающей альтернативой ZFNs и TALENs стали РНК-наводимые нуклеазы, лежащие в основе CRISPR-Cas систем. Разработка CRISPR-Cas9 в качестве инструмента генетического инженеринга в 20123,4 привела к беспрецедентно быстрому развитию процедуры редактирования генов. Успех в основном обусловлен простотой системы и коротким и прямым дизайном процессов. Как показывает название, РНК-наводимые нуклеазы отличаются от ZFNs и TALENs по т. наз. гид (guide) RNA (gRNA), ответственной за распознавание последовательностей мишени. Преимуществом этой системы является простое многократное использование (multiplexing), при этом некоторые последовательности генетических мишеней могут быть модифицированы одновременно путем внесения нескольких gRNAs в ходе одного подхода.5 CRISPR-Cas9 нуклеазы, происходящие из Streptococcus pyogenes пока наиболее часто используемая платформа, но низкая специфичность, описанная в некоторых публикациях, толкает к новым улучшениям платформы.6 Более того, введение обоих ортологов CRISPR-Cas9 системы7 и новой CRISPR-Cpf1 платформы8 является примечательным. В частности по сравнению с CRISPR-Cas9, система CRISPR-Cpf1 обнаруживает несколько преимуществ для переноса в клинику, особенно в терминах специфичности. Кроме того, меньший размер Cpf1 упрощает упаковку в клинически проверенных векторных системах, а липкие концы, генерируемые во время разрезания ДНК могут повышать эффективность некоторых процедур редактирования генов.
Сконструированные нуклеазы способны к терапевтическому редактированию генома путем разрезания ДНК на предопределенных местах генома человека.1 Возникающие в результате разрывы двойной нити ДНК активируют аппарат репарации ДНК клетки, который репарирует разрезы ДНК или с помощью non-homologous end-joining (NHEJ) или homology-directed repair (HDR). Оба механизма могут быть использованы для целенаправленного редактирования генома. NHEJ репарирует разрывы двойной нити путем соединения (ligating) двух нитей ДНК непосредственно без необходимости матрицы для репарации. Хотя репарация может быть аккуратной, но NHEJ часто вставляет или устраняет несколько нуклеотидов в месте разрыва, приводя к т. наз. indel мутациям. Как результат, NHEJ преимущественно используется для инактивации генов мишеней. HDR, с др. стороны, нуждается в присутствии матрицы для репарации ДНК. В естественном контексте эта роль исполняется сестринскими хроматидами. Однако, аппарат HDR также использует экзогенную ДНК , если она содержит достаточную гомологию последовательностей с мишенью. Для HDR-обеспечиваемого геномного редактирования экзогенная ДНК "донорская" матрица вносится в клетки в форме однонитчатой или двунитчатой ДНК и обычно используется для коррекции мутаций, вызывающих болезнь, в геноме.
Ключом успеха подхода генного редактирования является эффективное введение инструментов редактирования генов в интересующий тип клеток.1 Однако, в клиническом аспекте не только эффективность переноса, но и также связанная с переносом токсичность и генотоксичность являются критическими. Для клеток крови и иммунной системы становится всё более приемлемым введение искусственных нуклеаз с помощью электропортации или в виде белка или его копии (blueprint) в форме мРНК. Этот метод имеет несколько преимуществ: с одной стороны, нуклеаза становится быстро доступной клеткам; с др. стороны, продолжительное воздействие на геном высокими концентрациями нуклеаз устраняется благодаря относительно быстрой деградации белков или мРНК. Для стратегии, базирующейся на HDR, донор д. вноситься одновременно в клетку. В целом, системы вирусных векторов, базирующиеся на adeno-associated virus type 6 (AAV6) или integrase-deficient lentiviral (IDLV) векторах используются с этой целью.
Помимо своей активности на последовательность мишени спроектированные нуклеазы могут активировать т.наз. сайты вне мишени, т.е. сайты генома, которые имеют очень сходные последовательности с мишенью.6 В идеале нуклеазная активность вне мишени д. быть минимальной и не вызывать побочных эффектов. Однако, в наихудшем случае клетка может подвергаться трансформации, сайт вне мишени расположен в кодирующей области гена опухолевого супрессора или в критическом цис-регуляторном элементе. Следовательно, специфичность искусственно созданных нуклеаз д. быть определена тщательно прежде клинического использования. Т.к. количество преклинических исследований, использующих ZFNs, TALENs и CRISPR-Cas систему постоянно увеличивается, то ряд клинических испытаний геномного редактирования, как ожидается возрастет в будущем ещё больше, поэтому разработка нуклеазных платформ д. быть управляемой.

Genome Editing Strategies to Treat Primary Immunodeficiencies


Primary immunodeficiencies (PIDs) - это гетерогенная группа нарушений, характеризующаяся варьирующей чувствительностью к инфекциям из-за наследственных дефектов в иммунной системе. Даже если классификация громоздкая, PIDs относятся к крупной группе болезней, исходя из лежащих в основе дефектов и симптомов. Количество идентифицированных мутаций, ответственных за PIDs быстро увеличивается благодаря улучшению технологий секвенирования, при этом описано пока более 300 генетических дефектов.9 Severe combined immunodeficiencies (SCIDs) принадлежат к наиболее худшим формам PIDs и характеризуются дейицитом функции Т клеток, которые могут сопровождаться дефектами B клеток и/или клеток натуральных киллеров. Поскольку все иммунные клетки происходят из hematopoietic stem cells (HSC), то основным терапевтическим подходом лечения пациентов с SCID является трансплантация аллогенных стволовых клеток. Даже если протоколы трансплантаций HSC будут существенно улучшены, всё равно останутся ограничения, такие как доступность подходящих доноров и риск graft-versus-host disease (GvHD). Поэтому генетическая коррекция пациентов своими собственными HSCs всё ещё является привлекательной альтернативой для пациентов, лишенных пригодного донора или когда трансплантации аллогенных HSC всё ещё ассоцированы с высокой болезненностью или смертностью. В самом деле, генотерапия с использованием клеток, обладающих внутренне присущей способностью к самообновлению и продукции всех клонов клеток обладает потенциалом лечения многочисленных нарушений крови , к которым относятся и PIDs.10 Большинство испытаний генотерапии проводится на X-сцепленных SCID (X-SCID), adenosine deaminase-deficient SCID (ADA-SCID), Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) и X-linked chronic granulomatous disease (X-CGD).10 Т.к. ранние клинические испытания с первой генерацией гамма-ретровирусных векторов, обеспечивающих перенос генов, приводили к тяжелым побочным эффектам у довольно большого количества пациентов с X-SCID,11 WAS,12 и X-CGD13, тогда как использование более безопасных self-inactivating (SIN) гамма ретровирусных и лентивирусных векторов привело к существенному излечению у многих детей, страдающих от PIDs.14 Конечно же European Medicines Agency одобрило Strimvelis в качестве первой ex vivo генотерапии стволовыми клетками для лечения ADA-SCID в 2016.15
В то время как генотерапия с добавлением гена оказалась успешной для небольшого количества PIDs, она могла не срабатывать при нарушениях, где лежащие в основе мутации, располагались в тесной близи к регулируемым локусам или в генах, экспрессирующихся в определенное время или в специфических клонах, такие как мутации в CD40LG, STAT1, RAG1 и RAG2 генах. Основным преимуществом использования целенаправленного редактирования генов является потенциал исправления мутации, вызывающей болезнь сайт-специфическим образом, следовательно, приводя исправленные гены под контроль эндогенных регуляторных элементов. Коррекция in situ также пригодна для лечения доминантных негативныхз мутаций, для которых традиционное добавление нормальной копии гена не устраняло болезненного фенотипа. Напр., разработка программируемых нуклеаз для разрушения мутантных последовательностей аллель-специфическим способом могла бы помочь в лечении аутосомно-доминанного autosomal-dominant hyper-IgE syndrome (AD-HIES), вызываемого мутациями в гене STAT3.
В 2014, Naldini et al. впервые продемонстрировали функциональное репарирование дефектного гена в HSCs (Table 1). С этой целью они вставляли корректирующую кДНК в локус IL2RG в HSCs от X-SCID пациента, используя электропортацию мРНК, чтобы доставить ZFNs и IDLVs в качестве донорской матрицы.16 Интересно, что прицельно направляемый ген IL2RG достигал всех клеток из CD34-позитивных субпопуляций, но оказывался менее эффективным в большей части компартмента из наиболее примитивных стволовых клеток, которые содержали длительно возобновляемые HSCs. В 2016 группа Torgerson's использовала TALENs для восстановления функции CD40L.17 Мутации в локусе CD40LG вызывали неспособность выключать класс иммуноглобулинов и ассоциировали с синдромом hyper-IgM (HIGM). Предыдущие попытки осуществить генотерапию с доставкой ретровирусами CD40L полигенного экспрессирующего кластера в мышиные HSCs оказались способными восстанавливать приобретенный иммунитет, но обработанные мыши позднее обнаруживали появление лимфопролиферативных нарушений тимуса.18 В их подходе геномного редактирования авт. восстанавливали функцию CD40L в T клетках от пациентов с X-HIGM посредством комбинирования с TALEN и AAV донорскими матрицами, наблюдалась коррекция 30% аллелей.17 Система CRISPR-Cas9 была использована для лечения X-CGD, возникающего в результате мутаций в гене CYBB, кодирующем GP91phox, компонент системы бактериоцидной оксидазы в фагоцитах. С этой целью CRISPR-Cas нуклеаза целенаправленно воздействовала на мутацию одиночной пары оснований, были использованы в HSCs вместе с single-stranded oligodeoxynucleotides (ssODNs), чтобы устранить мутацию, восстанавливая генерацию реактивных видов кислорода в нейтрофилах. Частота коррекции гена в трансплантируемых HSCs была в пределах 10%.19

Table 1. Overview: preclinical gene editing for PIDs and hemoglobinopathies

Итак, целенаправленное воздействие на гены в человеческих HSCs, чтобы лечить PIDs, стало реальностью в преклиническом контексте. Было разработано несколько улучшений в последние годы относительно стратегии доставки сконструированных нуклеаз и доноров, а также относительно культивирования ex vivo этих деликатных клеток для поддержания мультипотентности. Доноры, базирующиеся на ssODNs оказались пригодны для коррекции точечных мутаций, вызывающих болезни, поскольку продукция ssODN легче и экономичнее, чем производство вирусных векторов. Однако, остаются проблемы с оценкой частот случайной интеграции ssODNs, т.к. их трудно обнаружить, как только они интегрируются в геном хозяина. Использование не патогенных AAV6 векторов для доставки доноров обладает несколькими преимуществами, включая низкую частоту интеграции, в большинстве случаев достаточно значительный объем пакуемого материала (4.7 kb) и возможно его однонитчатая природа. На обратной стороне трансдукции HSCs AAV6 векторами, по-видимому, стоит некоторая цитотоксичность.20 Альтернативные серотипы AAV или наночастиц, способных трансдуцировать HSC с высокой эффективностью, не вызывая цитотоксичности, будут рассмотрены ниже.

Genome Editing Strategies to Treat Hemoglobinopathies


Гемоглобинопатии находятся среди наиболее частых моногенных нарушений.21 Гемоглобин является гетеротетрамером, состоящим из двух α-globin мономеров и двух β-globin мономеров, он отвечает за транспорт кислорода из легких во все ткани. Локус β-globin состоит из 5 генов -- HBE1 (ε-globin), HBG2 (γ-globin-G), HBG1(γ-globin-A), HBD (δ-globin) и HBB (β-globin) -- которые кодируют beta-подобные субъединицы гемоглобина (Fig. 1). Экспрессия этих 5 генов контролируется locus control region (LCR) и характеризуется известным феноменом переключения во время плодного развития вплоть до первых мес. после рождения. В то время как ε- и γ-globins экспрессируются во время эмбриональной и плодной стадий, соотв., β-globin становится превалирующим после рождения и сохраняется в течение всей жизни взрослых. Нарушения регуляции экспрессии генов глобинов или мутации в генах, кодирующих α- или β-globin приводят к умеренной или тяжелой анемии, наз. α- или β-thalassemia, или к нарушениям, характеризующимся полимеризацией глобина, что приводит к серповидноклеточности эритроцитов, наз. sickle cell disease (SCD). SCD вызывает анемию разной степени и может потенциально вызывать угрожающие жизни закупорки сосудов.21 В этом контексте, заслуживает внимание злокачественный синдром, наз. hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH), который генетически характеризуется мутациями в регуляторных элементах β-globin локуса, что приводит к сохранению экспрессии плодного γ-globin в течение всей жизни. Этот синдром впервые был описан в греческой семье, имеющей делецию в 7.2 kb, соответствующую месту старта транскрипции δ-globin (Corfu deletion), приводящую к умеренной δβ-thalassemia.22



Figure 1. Schematic of ?-globin locus. The β-globin locus on chromosome 11 harbors five genes that encode the β-like subunits of hemoglobin: HBE1(ε-globin), HBG2 (γ-globin G), HBG1 (γ-globin A), HBD (δ-globin), and HBB(β-globin). Expression of these genes is controlled by the locus control region (LCR) and the cis-regulatory elements of each gene. ε-globin is expressed during the embryonic stage and replaced by γ-globin A and G during later stages of pregnancy. The complete switch to adult δ- and β-globin is completed within the first 6 months after birth. BCL11A is a major regulator of the globin switching process.
Около 7% мировой популяции являются носителями "sickle аллеля." В основном это обусловлено защитным эффектом признака серповидноклеточности против малярии, такие мутации могут захватывать до 80% в популяциях некоторых регионов.21 Современное лечение SCD базируется на профилактическом применении антибиотиков, долговременных режимах переливаний крови и использовании hydroxyurea, которая, как было установлено, частично восстанавливает экспрессию плодного γ-globin, лечение, которое также ослабляет проявления таллассемии.23 Такое лечение улучшает качество жизни и вероятную продолжительность жизни, но не может полностью защитить от случайных ударов, вызываемых закупорками сосудов серповидноклеточными эритроцитами. Стандартный уход за пациентами с таллассемией связан с частыми трансфузиями крови и iron chelation терапией, в зависимости от тяжести болезни. Несмотря на хорошую эффективность, всё ещё необходима индивидуализация терапии, требующая пожизненного специализированного менежмента. Трансплантация аллогенных HSC пригодна в альтернативных случаях тяжелых форм анемии или SCD, хотя этот выбор не без риска возникновения GvHD и варьирующей успешности приживления HSC.24 Как следствие, аутологические трансплантации HSC после генотерапии рассматриваются как многообещающая альтернатива лечения таллассемии и серповидноклеточности.
Первый ген-терапевтический подход базировался на интеграции β-globin последовательности с помощью лентивирусной трансдукции HSC.25 По существу, LCR последовательности и β-globin промотор комбинировали в таких векторах, чтобы получить специфическую и устойчивую экспрессию β-globin в эритроидном компартменте. В некоторых клинических исследованиях по генотерапии, модифицированная последовательность β-globin была использована, чтобы снизить склонность к полимеризации глобина в контексте SCD.26 Некоторые из этих клинических испытаний фазы I/II обнаружили многообещающие результаты, при этом пациенты оказывались способны остановить или существенно уменьшить количество переливаний после генной терапии. Др. клинические испытания не обнаруживали достоверного улучшения, хотя они использовали сходный сконструированный вектор, но использовали др. режимы подготовки.25 Эти позитивные и негативные результаты подчеркивают значение тонкой настройки экспрессии β-globin трансгена.
Базовые исследования, осуществленные на β-globin локусе, указали на важность регуляторных элементов, которые участвуют в процессе переключения глобинов. Некоторые из этих элементов были охарактеризованы в отношении их необходимости для устойчивой экспрессии β-globin у взрослых и были определены как специфичные для эритроцитов строгие энхансеры и сайты гиперчувствительности к DNase I.27 Др. цис-регуляторные элементы были охарактеризованы как необходимые для связывания репрессорного комплекса, включая BCL11A.25 В частности, цис-регуляторные элементы, окружающие гены плодных глобинов, HBG2 и HBG1, подвергались целенаправленному воздействию BCL11A репрессорного комплекса.28 Исследования по нокауту BCL11A подтвердили роль BCL11A в регуляции экспрессии плодного глобина, а также подчеркнули его значимость для др. путей, связанных с leukemogenesis и гематопоэзом, показав необходимость тщательной оценки при манипуляциях с его экспрессией для клинических целей.29
Многообещающий подход базируется на изменении направления процесса переключения глобина у взрослых к экспрессии плодного γ-globin, как это наблюдается при HPFH (Table 1). Естественный HPFH генотип был воссоздан в HSCs путем использования двух CRISPR-Cas нуклеаз, которые продуцируют делецию в 13 kb в локусе β-globin, устраняя HBD и HBB. Эритроциты, происходящие от редактированных HSCs обнаруживают мощную экспрессию γ-globin.30 Brendel et al. избирательно подвергали нокдауну BCL11A in HSCs благодаря специфичной для эритроцитов экспрессии shRNA, воздействующей целенаправленно на BCL11A, в результате происходила успешная реактивация γ-globin.31 Комплементарный подход был успешно использован, применив сконструированные эндонуклеазы, чтобы делетировать GATA-1 энхансерный элемент, присутствующий в гене BCL11A, который необходим для его мощной экспрессии в эритроидном компартменте.29,32 Дальнейшая альтернатива включает нокаут регуляторных элементов BCL11A в плодных γ-globin генах, это приводит к достоверному уменьшению серповидноклеточного фенотипа in vitro при использовании HSC, происходящих от SCD пациентов.33
Два исследования продемонстрировали восстановление экспрессии фетального глобина за счет использования chromatin looping комплекса, который действует в глобиновом LCR. Искусственно преобразованный zinc-finger белок, который распознает HBG промотор, был слит с доменом self-association в LDB1 белке.34,35 Этот химерный белок был помещен под контроль эртроид-специфического промотора и интегрирован в ген лентивируса, чтобы перенести его в геном HSCs от SCD пациентов. Фенотип SCD существенно регрессировал in vitro и подход оказался более эффективным, чем hydroxyurea или др. лекарства.34
Др. лаб сфокусировались на коррекции гена HBB в HSCs посредством сконструированных нуклеаз вместе с экзогенной донорской ДНК матрицей при использовании пути HDR. Многочисленные примеры показали вплоть до 40% корректный редактирований "sickle аллелей", если использовались ssODN или IDLV доноры в комбинации с ZFNs36,37 или CRISPR-Cas9.38 Dever et al. наблюдали около 20-40% отредактированных HBB аллелей при использовании CRISPR-Cas9 вместе с AAV6-обеспечиваемой доставкой донорской ДНК матрицы.39 После ксенотрансплантации HSCs с отредактированным геном иммунодефицитным мышам, однако, все исследования сообщили о сильном снижении фракции отредактированных клеток (снижение до 1-3%), указывая на низкую частоту HDR в длительно восполняемых HSCs. Стратегия, чтобы увеличить редактируемые гены в HSCs была предложена Dever et al., использовавших укороченный low-affinity nerve growth factor receptor (ΔLNGFR) в качестве избирательного маркера.39 такой подход только кажется имеющим значение, только если редактируемые длительно возобновляемые (repopulating) HSCs могут быть размножены ex vivo. Да из этих исследований сообщили о достоверной активности вне мишени используемых нуклеаз, поднимая вопрос о генотоксичности.36,39 Более того, высокая частота NHEJ-обусловленных нарушений β-globin кодирующей последовательности, наблюдаемая при редактировании генов в HSCs несет риск изменения SCD фенотипа в более тяжелую β-thalassemia.
Итак, даже посредством базирующиеся на лентивирусах подходы генотерапии успешны для воздействия на гемоглобинопатии, будучи нацеленными на редактирование β-globin локуса. В частности, базирующиеся на NHEJ нокаутные стратегии, имеющие целью восстановление экспрессии плодного γ-globin, будут разработаны в эффективные терапии в ближайшем будущем. С др. стороны, низкая частота HDR-обусловленной коррекци генов в длительно возобновляемых HSCs и соотношение между коррекцией генов и базирующейся на NHEJ разрушением генов остается основной проблемой для базирующихся на HDR подходах генного таргетинга в стволовых клетках крови.

Genome Editing in T Cells to Fight Cancer


Адаптивная иммунотерапия использует опухоль-специфические цитотоксические Т клетки или chimeric antigen receptor (CAR) T клетки, успешно применяемые в нескольких клинических испытаниях фазы I/II для лечения гематологических озлокачествлений.40-42 Эффективность сконструированных CAR T клеток зависит от распознавания опухоль-специфических или ассоциированных с опухолью антигенов посредством CAR независимым от human leukocyte antigen (HLA) способом. После связывания антигена CAR T клетки активируются и элиминируют опухолевые клетки. В частности, анти-CD19 CAR T клетки обнаруживают существенный успех в лечении озлокачествления В клеток, экспрессирующих CD19, при это до 90% пациентов, страдающих от acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) обнаруживают полную ремиссию.43 Несмотря на значительный клинический успех терапия CAR T клетками имеет серьезные побочные эффекты, такие как cytokine release syndrome (CRS), нейрологическая токсичность и т. наз. "on-target-off-tumor" эффект, вызывающий аплазию В клеток у пациентов, лечившихся anti-CD19 CAR T клетками. Эти побочные эффекты, по крайней мере, частично обусловлены отсутствием контролируемой активации и экспансии CAR T клеток. Чтобы улучшить профиль надежности терапии CAR T клетками, некоторые лаб. разработали безопасное выключение, чтобы элиминировать CAR T клетки, если необходимо, включая суицидальные гены, такие как iCasp9 или HSV thymidine kinase.40-42
В то время как CAR T клетки были чрезвычайно эффективны в целенаправленном лечении B-ALL, эффективность этих клеток, по-видимому, низкая в контексте солидных опухолей.44 Это в основном обусловлено иммуносупрессивным микроокружением, которе, как известно, подавляет функцию опухоль-специфических Т клеток, включая CAR T клеток. Используя антагонистические антитела, способные блокировать ингибирующие рецепторы КПП (check point ), такие как programmed death 1 (PD-1) или cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4), как было установлено, достоверно усиливают противоопухолевый эффект41 проникающих в опухоль T клеток. Т.к. эти антагонистические антитела могут быть ассоциированы с высокой токсичностью, то привлекательным альтернативным подходом стал генетический нокаут локусов, кодирующих PD-1 и CTLA-4, чтобы создавать "улучшенные CAR T клетки."45 С др. стороны, CAR T клетки в основном продуцируются как аутологичные T клетки, которые имеют несколько ограничений, включая вариации между пациентами в качестве стартового T клеточного материала, а также высокая цена их производства. Предприняты значительные усилия для продукции т. наз. "универсальных CAR T клеток," которые могут продуцироваться от здоровых доноров и затем храниться, пока не понадобятся. Такие готовые к употреблению CAR T клетки могли бы улучшить общее качество продукта в виде CAR T клеток и существенно снизить затраты на производство.
Сконструированные нуклеазы могли бы сыграть важную роль в разработке таких "универсальных CAR T клеток" и "улучшенных CAR T клеток" (Table 2). В нескольких исследованиях были использованы программируемые нуклеазы для нокаута локусов, кодирующих цепочки α или β T cell receptor (TCR), TRAC или TRBC,46-49 или B2M, кодирующего beta-2-microglobulin, главный компонент HLA-I комплекса.50 В то время как нокаут TRAC или TRBC будет устранять экспрессию комплекса TCR/CD3 на клеточной поверхности, нокаут B2M нокаут будет предупреждать экспрессию HLA-I . В результате эти нокауты будут элиминировать TCR-вызываемый аутоиммунитет и/или аллореактивность против HLA-mismatched клеток, не влияя на потенциал этих клеток редактировать CAR T клетки.50 Известно, что редактирование генов было успешно применено в Т клетках, экспрессирующих рекомбинантные опухоль-специфические TCR. Одним из ограничений такого подхода стало неправильное спаривание между экзогенными и эндогенными цепочками TCR, которое может приводить к образованию непредсказуемых и вредных TCR гибридов, влияющих на безопасность и эффективность генерируемых Т клеток. В самом деле, Mastaglio et al. продемонстрировали снижение аллореактивности у модельных мышей с опухолями, когда использовали ZFNs, чтобы вызывать нокаут эндогенного TRAC гена в T клетках, экспрессирующих рекомбинантные TCR, нацеленные на NY-ESO-1 антиген.51

Table 2. Overview: gene editing in CAR T cells

Продукция CAR T клеток обычно используется для доставки CAR трансгена, используя случайную интеграцию с вирусной40 и не вирусной52 векторными системами. В то время как генотоксичность в T клетках, по-видимому, не главная проблема, непрерывная избыточная экспрессия CAR может быть проблематичной, поскольку ускоряет истощение эффекторных Т клеток, это д. снижать персистенцию этих сконструированных CAR T клеток in vivo . Чтобы проверить этот аспект надежности, использовали временную экспрессию CAR путем трансфекции T клеток мРНК, кодирующими CAR.53 такая кратковременная экспрессия CAR может ограничивать клиническое использование, если становятся необходимыми множественные инъекции, чтобы достичь терапевтического эффекта. Чтобы получить наиболее физиологический уровень экспрессии CAR, разработчики технологии нуклеаз использовали целевую интеграцию CAR трансгена в разные локусы. Частоты HDR достигали 40% в первичных T клетках при использовании CRISPR-Cas9 и AAV6 векторов, чтобы доставлять CAR донорскую матрицу.20,47,54 Эта стратегия была использована, напр., чтобы генерировать специфические для human immunodeficiency virus (HIV) CAR T клетки, которые были устойчивы к инфекции HIV-1 за счет целенаправленной интеграции CAR в локус CCR5, кодирующий ко-рецептор, используемый HIV для проникновения в клетки.55 Особенно интересной оказалась целенаправленная интеграция CAR трансгена в TCR кодирующие локусы. Такая стратегия была применена, чтобы поместить CAR под контроль промотора TRAC и тем самым гарантировать "физиологическую" экспрессию. В самом деле, когда Sadelain et al. поместили CD19-специфические CAR в эндогенный локус TRAC, то экспрессия anti-CD19 CAR была существенно ниже по сравнению с экспрессией с ретровирусного вектора. Однако, такой "физиологический" контроль экспрессии CAR, как было установлено, приводит к более униформной экспрессии трансгена CAR, это сопровождалось задержкой истощения эффекторных Т клеток и более высоким потенциалом у CAR T клеток у мышей, моделирующих рак in vivo.54 Действительно ли "физиологическая" экспрессия CAR будет иметь преимущества в лечении солидных опухолей с помощью CAR T клеток, остается под вопросом.
Как упоминалось выше, CAR T клетки с повышенной противоопухолевой активностью могут быть получены путем разрушения генов, кодирующих ингибирующие иммунные КПП (checkpoints), таких как PDCD1 , кодирующего PD-1, CTLA4 или LAG356, кодирующего lymphocyte activation gene 3. PD-1, напр., рассматривается как маркер истощения, который подавляет функцию лимфоцитов, проникших в опухоль, чтобы элиминировать опухоль. Нокаут PDCD1 в tumor-reactive T лимфоцитах улучшает профиль высвобождения цитокина,57 увеличивая цитотоксическую активность in vitro,57 и увеличивая противоопухолевую активность у модельных мышей.58 Несколько клинических испытаний в фазе I/II использовали PD-1 нокаутные (CAR) T клетки стали следствием.1
Искусственно созданные нуклеазы могут также использоваться, чтобы вызывать одновременный нокаут нескольких генов. Напр., CD19-специфические CAR T клетки были удачно модифицированы с помощью TALENs по двум локусам, кодирующим TCR alpha цепь и CD52, белку, подверженному целенаправленному действию alemtuzumab, используемым в качестве антител для лечения лейкемии. Недавно два ребенка, страдающих от повторяющейся B-ALL, были успешно излечены такими CAR T клетками в комбинации с anti-CD52 серотерапией.59 Система CRISPR-Cas особенно важна для multiplexing. Ren et al. получили нацеленные на CD19 CAR T клетки, в которых локусы TRBC, B2M и PDCD1 были в нокауте. Такие универсальные CAR T клетки не экспрессировали TCR или какие-либо HLA-I молекулы или PD-1, это приводило к высокой противоопухолевой активности и более длительному сохранению модифицированных CAR T клеток в опухолях модельных мышей.50 Более того, чтобы усилить резистентность к Fas-обусловленному апоптозу, Ren et al. также создали тройные нокаутные CAR T клетки путем комбинирования генетического разрушения TRAC, B2M и FAS. Полученные CAR T клетки демонстрировали повышенную смертоносную активность и более продолжительное пребывание у модельных мышей с опухолями.45 Сложное редактирование генов с помощью двух или более нуклеаз, разрезающих многие сайты генома в одно и то же время определенно имеет преимущество в отношении уменьшения количества ступеней при производстве. Однако, конечный продукт д. быть тщательно оценен в отношении хромосомных транслокаций. Одновременное расщепление двух геномных сайтов приводит к 1% клеток с транслокациями.48
Итак, комбинация технологии CAR T клеток с редактированием генома указывает на новую эру в иммунотерапии рака, приводя к разработке новых CAR T клеточных продуктов для лечения опухолей, лечения которых на сегодня не существует. Некоторые клинические испытания были инициированы с редактированием генов CAR T клеток, чтобы лечить пациентов, страдающих от различных солидных опухолей, используя сконструированные нуклеазы для нокаута PD-1 с целью усиления функции эффекторных Т клеток (NCT02793856, NCT02867345, NCT02863913 и NCT02867332). Данные этих клинических испытаний чрезвычайно ценные для достижения безопасности и пригодности генетически модифицированных CAR T клеток в клинических условиях.

Epigenome Editing


генома имеет целью достижение терапевтического успеха путем использования клеточного аппарата репарации ДНК, чтобы вносить целенаправленные геномные изменения. Такие стратегии могут быть использованы для коррекции мутаций, вызывающих болезни, или для предоставления клеткам новых свойств, таких как резистентность к патогенам посредством целенаправленного нокаута генов. В последнем случае опираются на сконструированными нуклеазами вызываемый случайный мутагенез, базирующийся на NHEJ, чтобы инактивировать гены хозяина, однако, использованию могут мешать условия, связанные с безопасностью. Целенаправленное редактирование эпигенома, с др. стороны, представляет собой альтернативный путь, посредством которого фенотип и/или функция клеток могут быть изменены без изменения подлежащих последовательностей ДНК.60,61 В последнюю декаду молекулярные механизмы, которые контролируют экспрессию генов посредством, считывания, записывания и стирания эпигенетических меток и корреляция между аберрантными эпигенетическими ландшафтами и болезненными состояниями, такими как дефекты импринтинга,62 нейрологические нарушения,63 и в конечном итоге рак,64 стали более понятны. Поэтому в этом контексте целенаправленное редактирование эпигенома позволяет ученым переписывать эпигеном специфически в определенных местах генома, чтобы проверить некоторые из этих гипотез.
Попытка модулировать экспрессию генов специфическим образом65 .slf предпринята в последнюю декаду, используя искусственные транскрипционные факторы, которые, как было установлено, усиливают или подавляют экспрессию генов мишеней в специфическом контексте.66,67 Они экспрессируются непостоянно и эффект обычно разбавляется при делениях клеток.68 Чтобы преодолеть это ограничение несколько групп разработали синтетические methyltransferases (SMTs), которые могут быть использованы для индукции устойчивого контроля экспрессии генов путем модификации наследуемых эпигенетических меток. Это было достигнуто посредством слияния эффекторных доменов, способных индуцировать эпигенетические изменения, при этом подверженные целевому действию домены ДНК, связаны со специфическими сайтами в геноме и определяют регион, где эпигеном изменен. Первый пример целенаправленного воздействия на эпигеном редактирования, когда в 1997 Xu and Bestor слили бактериальную ДНК метилтрансферазу с zinc-finger-based ДНК связывающим доменом (ZF) с целью становления специфического метилирования CpG олигонукелеотидов in vitro.69 Потребовалось ещё 10 лет, чтобы осущетвить proof-of-concept на клетках человека. Jeltsch et al. сгенерировали химерную ДНК метилтрансферазу путем слияния мышиной ДНК метилтрансферазы 3a и 3b с конструированным ZF , чтобы вызывать метилирование ДНК в промоторе herpes-simplex-virus 1 (HSV1) IE175k, вызывая в результате снижение репликации HSV1 в культуре клеток.70 Чтобы улучшить в целом эффективность SMTs, Siddique et al. воспроизвели природную сборку комплекса метилирования ДНК и сгенерировали одиночный слитый белок, состоящий из C-терминальных частей ДНК метилтрансфераз 3A и 3L, соединенных с сконструированным ZF targeting промотором VEGF-A.71 Временная доставка в иммортализованные клеточные линии привела к строгой репрессии гена мишени в результате целенаправленного метилирования ДНК. Несмотря на эти первые успехи, неспособность поддерживать внесенные эпигенетические метки составило главную проблему, при этом большинство исследований сообщило о потере молчания гена после потери экспрессии SMT. Это затруднение было преодолено с помощью комбинации активности доменов репрессии транскрипции с активностью метилтрансфераз на локусе мишени. Как было сообщено недавно, такие системы способны к устойчивому замалчиванию гена мишени в иммортализованных линиях клеток человека72,73 при этом отмечается удивительная специфичность. Важно, что экспрессия гена может также контролироваться с помощью наложения синтетических меток на гистоны. Напр., избирательное метилирование гистонов было ассоциировано со снижением экспрессии гена, благодаря модификации архитектуры хроматина в специализированном локусе.74 Более того, было бы интересно посмотреть, действительно ли целенаправленная интеграция цис- или транс-регуляторных элементов, как было установлено, для X-инактивирующего гена, XIST, человека75 , может использоваться для изменения эпигенетического состояния хромосомного региона или целой хромосом.
Хотя эффективность целенаправленного редактирования эпигенома чрезвычайно повышена в последнюю декаду, при этом успешные примеры контроля экспрессии гена мишени путем модуляции структуры хроматина посредством наложения синтетических эпигенетических меток на ДНК или гистоны, имеются проблемы с переносом этих знаний в клинику.65 В перспективе использование целенаправленного редактирования эпигенома, чтобы стабильно замалчивать или реактивировать экспрессию гена мишени, остается ценным подходом, в частности, в контексте когда инактивация гена может предоставить терапевтический успех. Недавно было продемонстрировано, что целенаправленное редактирование эпигенома может быть использовано, чтобы замалчивать ко-рецепторы HIV-1 в первичных T клетках после кратковременного воздействия на клетки с помощью designer epigenome modifiers (DEMs), который целенаправленно воздействует на промоторы CCR5 и CXCR4.73 Отсутствие непосредственных эффектов вне мишени обусловлено действием этих DEMs подчеркивает потенциал надежности такой стратегии. С др. стороны, отсутствие понимания динамики замалчивания генов на уровне одиночной клетки, также как и неподкрепленная документально стабильность эпигенетических меток в высоко динамичных Т клетках, которые подвергаются постоянному ремоделированию своего транскриптома и хроматина в ответ на внутренние и внешние стимулы в течение всего периода жизни, всё ещё остается открытым вопросом.76
Несмотря на это модификации эпигенома сегодня разрабатываются для лечения рака, который во многих примерах обусловлен аберрантной эпигенетической регуляцией. Эпигенетические лекарства, вызывающие гипометилирование, такие как Azacitidine, были изучены в отношении нормализации количеств кровяных клеток у индивидов, страдающих от myelodisplastic синдрома.77 Даже в случае обнаружения положительных эффектов у пациентов, предполагается, что модуляция эпигенома становится новой концепцией в лечении рака, неспецифическое действие этих эпигенетических лекарств может привести к тяжелым побочным эффектам.78 Целенаправленное редактирование эпигенома может привести к лучшему пониманию корреляций эпигенетический аберраций с началом озлокачествления. Однако, два основных узких места необходимо учитывать при эпигеномном редактировании как лечение рака: (1) эффективность по доставке редакторов в достаточно большом количестве в злокачественные клетки, что довольно проблематично в случае солидных опухолей; и (2) преимущество в избирательном росте клеток вне мишеней. А этом отношении подходы, комбинирующие химиотерапию и целенаправленные эпигенетические лекарства могут открыть новые решения по уменьшению прогрессирования рака, усилению чувствительности раковых клеток к химиотерапевтическим агентам и в конечном итоге по увеличению жизни пациентов.79
Итак, в последние несколько лет установлено, что редактирование генома может страдать от разнородных связей с сконструированными нуклеазами в т. наз сайтах вне мишени.6 Даже небольшие количества разрезаний вне мишени в любом регионе генома обладают потенциалом индуцировать транслокации с вредными последствиями. Напротив, вне мишени редактирование эпигенома вызывает беспокойство только если касается цис-регуляторных регионов генома, т.е. существенно снижены потенциальные риски. Более того, поскольку эпигеномное редактирование, не вызывает каких-либо альтераций геномной последовательности ДНК, то эффект может быть изменен в обратную сторону. Целенаправленное редактирование эпигенома может новые терапевтические возможности в будущем. С этой целью важно лучше понять базовые механизмы, которые связывают эпигеном с клеточными функциями и разработать новые и более эффективные эпигеномные редакторы, способные контролировать экспрессию генов на постоянной основе.

Conclusions


Classical gene therapy approaches have been successfully applied in patients for roughly 10 years, and two gene therapeutics, Strimvelis and Glybera, have been approved as drugs in Europe. Genome editing using designer nucleases has also made the first steps into the clinic.1,2 Although few data from these clinical trials are available, it is safe to assume that ZFNs, TALENs, and CRISPR-Cas will be tested in numerous additional trials over the next few years. Among the most promising applications in the field of hematological disorders are ex vivo genome editing strategies for the therapy of cancer using "enhanced" and "universal" CAR T cells and the transplantation of genetically corrected blood stem cells for the treatment of hereditary hemoglobinopathies and primary immunodeficiencies. Although ZFNs are still the most frequently used platform in the clinic, it is foreseen that this platform will get strong competition from TALENs and in particular from the CRISPR-Cas system. The better availability of these platforms combined with their high activities and specificities make TALENs and CRISPR-Cas nucleases suitable candidates for clinical translation. Novel approaches to control gene expression through epigenome editors offer additional opportunities to develop therapeutics based on new principles. Even though we are still at the dawn of targeted epigenome editing, a better understanding of the function of the different epigenetic marks, as well as the dynamics driving gene expression and remodeling of the chromatin structure, will generate new impetus to the field. Over the next decade, many of the preclinical approaches described in this review will find their way to patients and fundamentally and sustainably change clinical medicine.