Отмечается 25-я годовщина с момента первого клинического использования для генотерапии гематопоэтических стволовых клеток для лечение генетической болезни: ADA (adenosine deaminase)-дефицитного варианта тяжелого комбинированного иммунодефицита severe combined immunodeficiency (SCID) [1,2]. Это заболевание стало широко известно благодаря истории David Vetter, ребенка с SCID, удерживаемого несколько лет в изоляции ("bubble boy"), чтобы защитить его от воздействия в общем-то безвредных общераспространенных патогенов и угрожающих жизни инфекций. Постепенно было установлено, что SCIDs представляет собой гетерогенное семейство генетических дефектов [3]. Впервые SCID был идентифицирован на молекулярном уровне как дефицитный по ADA вариант [3], редкое нарушение, вызываемое изменением генетического кодирования фермента ADA. Хотя основные симптомы ADA дефицитной SCID связаны с дефектом иммунитета, болезнь имеет серию дополнительных осложнений, связанных с метаболическими нарушениями [3,4], некоторые необходимо учитывать при лечении ADA-SCID. Вплоть до появления ex vivo генотерапии, ADA дефицитная SCID лечилась с помощью аллогенных трансплантаций костного мозга от HLA идентичных единокровных братьев (sibling) [5] или у пациентов при отсутствии подходящего донора, путем энзим-замещающей терапии (ERT) от pegilated телячьих энзимов в течение всей жизни [6]. Однако, такие воздействия неспособны обеспечить идеальную реакцию для медицинских нужд ADA-SCID пациентов. Фактически большинство пациентов, лишенные HLA-идентичных сиблингов при хроническом введении pegilated телячьей ERT неспособны поддерживать длительное время полностью функциональным иммунное восстановление [7]. ADA-SCID стала рассматриваться как первый кандидат на генотерапию благодаря нескольким преимуществам: 1 - кДНК ADA гена пригодна для инсерции в доступные вектора для переносе генов, в мышиные gamma retroviruses (RVV); 2 - ограниченной экспрессии ADA энзима, достаточной для коррекции метаболических нарушений в лимфоцитах и миелоидных клетках от поврежденных пациентов [8]; 3 - было предположено и впоследствии подтверждено [9], генетически скорректированные клетки д. иметь сильные избирательные преимущества перед дефектными клетками, приводя к прогрессивному увеличению исправления болезненного фенотипа.
Первая ex vivo генотерапия гематопоэтических стволовых клеток сопровождалась использованием для переноса гена ADA ретровирусного вектора в периферические лимфоциты крови (PBL) в NIH у двух детей с ADA-SCID [10]. Это исследование оценено и разрешено Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) в июне 1990 и оно базировалось также на результатах одной из первых химерных моделей человеческих лимфоцитов у иммунно-дефицитных мышей [11]. Сходное исследование, также использовавшее множественные вливания генетически скорректированных аутологичных лимфоцитов у ADA-дефицитных пациентов [9], предоставило доказательства, что генотерапия PBL может улучшать иммунную функцию у леченных пациентов более чем в нескольких лет. Это в конечном счете позволило прекратить вливания pegilated телячьих энзимов, чтобы повысить свойства аутоиммунитета и устранить иммунный дисбаланс (elevated IgE, perioral erythema и asthma) [9]. Несмотря на улучшение иммунологических параметров и клинический успех, результаты ADA генотерапии с помощью аутологических лимфоцитов периферической крови показали, что величина производимых векторами системных уровней adenosine deaminase недостаточна для получения адекватных уровней циркулирующих энзимов для детоксификации тканей и органов пациентов. Это привело к гипотезе, что перенос генов в плюрипотентные гематопоэтические стволовые клетки посредством продукции мультиклонального потомства генетически скорректированных клеток д. приводить к полной коррекции иммунной системы и адекватной детоксификации токсических метаболитов, элиминируя тем самым большинство метаболических последствий болезни. Первое ex vivo лечение гематопоэтическими стволовыми клетками осуществлено в 1992 итальянской группой из Istituto Scientifico Ospedale San Raffaele в Милане и подтвердило преимущества разработки и применения переноса генов с помощью двух ретровирусных векторов, идентичных, но отличающихся одной парой оснований при переносе ADA гена в HSC и PBL, соотв. Этот подход позволил отслеживать источник (долго живущих лимфоцитов и HSC) генетически скорректированных клеток. Результаты были опубликованы в 1995 [2], подтвердив потенциал генетически скорректированных стволовых клеток по предоставлению потомков ADA экспрессирующих клеток из разных клонов. Последующие улучшения процедуры генотерапии с использованием комбинаций цитокинов, позволило включить retronectin в процедуры генотерапии, чтобы повысить проницаемость вектора, связанное с non-myeloablative кондиционированием, это приводило к полной долго-временной коррекции болезненного фенотипа и к отказу от энзимной замещающей терапии [12]. Эти первоначальные клинические результаты подтвердили, что ex vivo генотерапия предоставляет лучшие шансы пациентам с ADA-SCID, при отсутствии HLA идентичных сиблингов, чем гапло-идентичные (наполовину совпадающие) аллогенные трансплантации костного мозга. После важных испытаний на 10 пациентах, подвергнутых лечению в Istituto Scientifico Ospedale San Raffaele в Миолане, Италии и в Hadassah University Hospital Израиля [13], которые подтвердили надежность и эффективность этого лечения, GlaxoSmithKline объявило в мае 2016, что EMA разрешает Marketing Authorization to Strimvelis (коммерческое название ADA-SCID генотерапии) [14]. После такого разрешения пациенты с этой болезнью и отсутствием HLA-идентичного донора стало возможным лечение в Ospedale San Raffaele, получая ex vivo генотерапию: одиночное введение очищенных аутологичных гематопоэтических стволовых клеток (CD34+), переносимых с помощью gamma-ретровирусов, чтобы экспрессировать ADA.
Прошло более 20 лет с первых экспериментальных клинических воздействий до появления первой ex vivo генотерапии на рынке. Проект пережил взлёты и падения, в частности, последствия возникновения экспансии клонов и лейкемической трансформации, связанных с интеграцией вектора в геном хозяина вблизи онкогена, обычно LMO2, что впервые было установлено в исследовании французов по ex vivo генотерапии Xl SCID [15,16]. Ключевые факторы успешного развития и регистрации Strimvelis стали попытки интегрировать, осуществляемые врачами и учеными, использовавшими комбинированную экспертизу в преклинических и клинических разработках, в регуляторных путях, в продуктах и процессах развития, чтобы сделать доступным процесс производства пригодным для коммерческого использования [13,14].
Хотя первые два приёма использования генотерапии ex vivo, получившие разрешение на маркетинг, Strimvelis and Zalmoxis, (см. ниже), использовали gamma RVVs-базирующийся перенос генов, благоприятствующий долговременной безвредности, выбранные модельные болезни имели строгие избирательные преимущества (что касается дефицита ADA ), и сравнительно лёгкую трансдукцию клеток мишеней, таких как лимфоциты периферической крови (в случае Zalmoxis), область была развита и тестирована на серии новых интегрирующихся и не интегрирующихся векторов. В частности, HIV-производные lentiviral vectors (LVVs) и adeno-associated vectors (AAV). LVVs были тестированы в серии генетических болезней, включая SCID, WAS, нейродегенеративные болезни лизосомного накопления и beta-thalassemia [17]. GMP (good manufacturing practice) позволила создать, оснастить инструмент для преодоления проблем по производству клеток и генотерапии на качественном уровне для клинического использования, в то время как процесс первоначально развивающийся в академических условиях, был оптимизирован, стандартизирован, так что первоначально охарактеризованные стандарты стали пригодными для клинических испытаний и в конечном счете для рынка.
Использование генотерапии также было расширено на ряд прямых in vivo моделей, в зависимости от природы болезни, сложности органа мишени и свойств используемых векторов [17]. Однако, генетически преобразованные клетки гемато-лимфатических клонов остаются ограниченными для ex vivo технологии переноса генов, при этом дополнительными ограничениями стали ломкость HSC клеток при манипуляциях и процедурах замораживания и оттаивания. Это может составить ограничение для широкого использования генотерапии, базирующейся на манипуляциях ex vivo с HSC, хотя улучшения в области характеризации стволовых клеток, экспансии и хранения, скорее всего, позволят в будущем преодолеть эти ограничения.
По этой причине для высоко надежного профиля [18,19], также как и для потенциальных приложений генотерапии болезней, затрагивающих большую популяцию пациентов, включая рак, T-лимфоциты обнаруживают растущий интерес в качестве мишеней для генного инженеринга, в частности, в попытке использовать высокий потенциал иммунной системы для распознавания и убийства опухолевых клеток. Кроме того, T лимфоциты по своей природе более резистентны к стрессам, вызываемых манипуляциями с клетками, замораживанию и оттаиванию. Это благоприятствует разработке и осуществлению клинических испытаний во многих центрах и в разных странах и на разных континентах с клетками отправляемыми и преобразованными с помощью GMP централизованно и возвращенными назад в центры, участвующие в клинических испытаниях.
Генетически модифицированные лимфоциты периферической крови были первоначально проверены для обеих болезней (ADA-дефицитной SCID) и рака с целью повышения иммунного ответа на опуховые мишени [20]. В самом деле, первое клиническое использование генотерапии для разработки противоопухолевого иммунитета против лейкемии, прошло полную клиническую разработку и маркет-регистрацию в Conditional Marketing Authorization by the European Medicines Agency, было предложено для использования гена убийцы (suicide), чтобы контролировать graft-vs-host disease (GvHD) в контексте трансплантаций HLA haploidentical костного мозга при лейкемии. Трансплантация аллогенного костного мозга при высоком риске лейкемии впервые продемонстрировала потенциал иммунной системы в отношении уничтожения неопластических клеток [21].
Трансплантации Hematopoietic stem cell (HSC), полученных из костного мозга или из mobilized клеток CD34+ периферической крови представляет собой метод выбора для пациентов, подвергающихся высокому риску лейкемии, при этом увеличивается продолжительность выживания и возможность лечения старых пациентов, благодаря более щедящим conditioning протоколам. К сожалению, существенная часть пациентов не имеет пригодных HLA идентичных доноров в семье или в регистре доноров. По этой причине использовали альтернативных доноров, включая трансплантации от совпадающих наполовину доноров в семье или пуповинную кровь, при этом описанные гапло трансплантации преобладали в клинической практике [22]. В самом деле, наполовину идентичная трансплантация является жизнь сохраняющей процедурой для многих пациентов при гематологических озлокачествлениях при отсутствии полного совпадения или при одном HLA несовпадающем семейном или неродственном доноре. Однако, благодаря генетическому несовпадению повышается риск нежелательных реакций донорских T клеток, содержащихся в трансплантатах против тканей и органов реципиента (graft-vs-host disease: GvHD). Были разработаны две основные стратегии, нацеленные на предупреждение угрожающих жизни осложнений в виде острой или хронической GvHD: 1 - ex vivo истощение донорских T лимфоцитов в трансплантатах с отсутствием пост-трансплантационной иммунной супрессии; или 2 - наполненные T клетками трансплантаты, сопровождаемые истощением in vivo аллореактивных T клеток с помощью cyclophosphamide и хронической иммунносупрессии [22]. Обе эти стратегии содержат ограничения, связанные с ограничением успешности аллогенных трансплантаций [23]. Ex vivo истощение T клеток полностью предупреждает возникновение GvHD, но оно затруднено из-за задержки иммунного восстановления и повышенной non-relapse смертности. Наполненные T клетками трансплантаты плюс хроническая супрессия иммунитета не застрахованы от хронической GvHD и повышенного возобновления лейкемии. Даже, если эти стратегии оказываются эффективными в предупреждении GvHD, они в конечном итоге приводят к снижению защиты от возобновления лейкемии и устойчивости к инфекционным агентам. Чтобы обойти эти ограничения и максимизировать эффект трансплантации на лейкемию, была разработана стратегия, базирующаяся на ex vivo генетических манипуляциях с донорскими лимфоцитами, чтобы они экспрессировали суицидный (suicide) ген [24]. Система suicide генов используется в таких исследованиях, базируясь на herpes simplex thymidine kinase gene (HSV TK), способном обеспечивать трансдуцируемые лимфоциты чувствительностью к pro-drug ganciclovir. Рис. 1 суммирует процедуру: в то время как пациент подготавливается к приему трансплантата донорские лимфоциты наделяются GMP способностью и генетически преобразуются, чтобы экспрессировать suicide ген HSV-TK (TK клетки); спустя 3 недели трансплантат, истощен по T клеткам, и TK клетки вводятся без возникновения какой-либо пост-трансплантационной иммунной супрессии, что обеспечивает профилактику от GvHD. С помощью этой технологии получает всю иммунную систему донора при отсутствии пост трасплантационной иммунной супрессии. Надежность и эффективность этой стратегии подтверждена в серии клинических исследований на более ста пациентах в фазе I-II испытаний [18,19]. После первоначальных исследований TK клетки выявлялись более 14 лет без признаков клональной селекции или экспансии. Эти и похожие исследования продемонстрировали, что ex vivo генетически модифицированные лимфоциты периферической крови могут жить долго in vivo и могут обнаруживаться спустя декаду в кровообращении подвергнутых воздействию пациентов. Долговременное выживание и клональная экспансия зависели от природы и фенотипа трансдуцированных клеток, при этом клетки со стволовой памятью, происходящей от центральной памяти, обнаруживали более широкий потенциал в отношении сохранения потомства этих лимфоцитов [25,26].
Fig. 1. Schematic representation of the Zalmoxis ex vivo suicide gene technology: peripheral blood lymphocytes (blu cells) are harvested from the HLA haplo-identical donor separately from the mobilized hematopoietic stem cells (in red), that are infused to the patient after myeloablative conditioning. During this phase of the transplant procedure, donor lymphocytes are processed in the GMP facility for HSV-TK (the 'suicide' gene) transduction. Genetically modified donor lymphocytes (in orange) are sorted to purity and infused to the patient three weeks from the transplant. After engraftment and in the absence of post-transplant immune suppression, donor lymphocytes contribute to the immune reconstitution. In case of graft-vs-host disease, the suicide gene machinery is activated by administration of ganciclovir to the patient.
Базируясь на этих данных, проводится жизненно важная фаза III клинического исследования (ClinicalTrial.gov NCT00914628)[27]. Conditional Marketing Authorization, базируется на надежности и эффективности результатов фазы II [28] и на доступных данных, оценивающих с помощью matched pair analysis данных регистра EBMT (European Society for Blood and Marrow Transplantation), было разрешено EU для Zalmoxis (коммерческое название стратегии TK suicide гена). Регистр EBMT представляет уникальный пример в медицине базы данных широкого назначения для реальных трансплантаций в Европейской клинической практике и является идеальным эталоном (comparator) [29].
Разрешение для Zalmoxis получено в августе 2016, спустя несколько мес. одобрен Strimvelis EU для GlaxoSmithKline. И Strimvelis, и Zalmoxis продуцируются с одинаковой легкостью, в настоящее время только GMP продукт разрешен для коммерческого производства для ex vivo генной терапии [30].
Помимо использования для контроля GvHD в отсутствие пост-трансплантационной иммуносупрессии или иммуно истощения, suicide гены [24] могут широко использоваться в генетически преобразованных лимфоцитах в серии дополнительных приложений, в которых чёткий контроль генетически преобразованных клеток обязателен. По этой причине были получены мутантные из дикого типа HSV-TK, т.наз. HSV-TK mut2 [31,32], обеспечивающие чувствительностью к ganciclovir для всех трансдуцируемых клеток. Сходное использование технологии suicide генов включает: 1 - delayed infusions (DLI), используемые в пост-трансплантационный период, чтобы искоренять минимальные остаточные болезни; 2 - высокие дозы TK клеток, чтобы предупреждать возвращение лейкемии и усиливать Graft-vs-Leukemia (GvL) эффект от аллогенных трансплантатов [19,23]; 3 - потенциальная критическая надежность инструмента, чтобы контролировать опухолевую трансформацию, генерируемую интеграцией вектора [33]; 4 - наконец, способ противодействия нежелательным эффектам токсичности на мишени и вне мишеней новой и мощной клеточной терапии, связанной с переносом генов CAR и TCR. В самом деле, возрос интерес к иммунно-онкологическим приложениям для лечения резистентных и упорных раковых опухолей с помощью специфичных для опухолей эффекторных T клеток, и к потенциальному вкладу генетически преобразованных эффекторных T клеток [34,35] с chimeric antigen receptor (CAR) генами или T-cell receptor (TCR) генами. CAR эффекторы могут быть собраны путем связывания вариабельных регионов антител с внутриклеточными сигнальными доменами, включающими также ко-стимулирующие домены для оптимальной активации клеток [36]. CAR эффекторные клетки распознают молекулы поверхности опухолевых клеток и не ограничиваются с помощью HLA ограничений [34], тогда как эффекторы генетически преобразованные, чтобы экспрессировать TCR, являются более сложными, чтобы быть сгенерированы [37], они являются предметом HLA ограничения и сродство TCR к раковым мишеням в целом ниже [38]. CAR T клетки более гибкие, а история использования CAR 19 для лечения упорного озлокачествления B клеток является историей успешности со множественными продолжительными реакциями при клинических испытаниях [34,35,39]. Такой успех первоначально ограничивался гематологическими озлокачествлениями, оказался многообещающим также для лечения эпителиальных раков и др. солидных опухолей. Было показано, что CAR T клетки обладают потенциалом проникать в солидные опухоли и убивать раковые клетки с высокой эффективностью. Проводящиеся преклинические и клинические исследования подтверждают этот потенциал генетически преобразованных T клеток.
Первоначальные клинические эксперименты с CAR подтвердили возможность терапии, однако, выявлен ряд токсических воздействий, включая синдром высвобождения цитокинов и токсичности в мишени и вне мишеней [34]. Использование удаленного аварийного переключателя [24,40], включенного в конструкцию CAR, как полагают, позволит контролировать или ограничивать токсичность CAR.
Два продукта на рынке и серия успешных генных терапий в основном генетических болезней и гематологических озлокачествлений, которые обычно сопровождают ряд клинических исследований, представляют обнадеживающий результат в области после rollercoaster-like путешествия, которое теперь ведет назад к обнадеживающей роли генной терапии при разработке новых подходов к терапии [17], хотя вопросы остаются, такие как упомянутая выше токсичность и появление ускользающих мутантов [34].
В добавок к биологическим ограничениям, имеются некоторые логистические проблемы, ограничивающие широкое распространение ex vivo генотерапии: 1 - ограниченная доступность GMP средств, которые могли бы поддержать переход от исследований ранней регистрации для рынка с потенциально тысячами пациентов, кандидатов на лечение; 2 - этот сценарий даже более сложен из-за логистики, ассоциированной со специфичным для пациентов лечением, нуждающемся в генетическом преобразовании собственных клеток пациентов; 3 - высокая цена терапии, которая будет вознаграждена после долгих лет исследований и разработок.
Использование аллогенных клеток предполагает упрощение логистики, позволяющей хранить эффекторные клетки в виде крупных запасов для многих пациентов. Новые средства будут созданы и оценены, но необходимое время находится в противоречии с высокой потребностью для пациентов и врачей. Разработка более автоматизированной и закрытой трансдукционной системы может помочь в этом процессе. Однако, всё это требует времени и зависит от финансовых издержек на лечение. Очевидно беспокойство, поскольку первый продукт для генной терапии, появившийся на рынке Европы, Glybera, (alipogene tiparvovec) стоит свыше 1 миллиона € на лечение [41-43]. Др. генные терапии, как полагают, будут иметь сходную цену. Это отражает объединенную цену не только от преклинических и клинических разработок, но и также продукцию и распространение продукта для ex vivo генотерапии. Однако, одноразовое лечение, предоставляемое ex vivo замещением гена может предложить долговременную коррекцию нарушения, тем самым будет уравновешена цена хронического в течение всей жизни обычного лечения и связанных осложнений. Генотерапия для ADA в противовес еженедельной терапии по замещению энзимов в течение всей жизни пациента представляет типичный пример. В др. случаях генотерапии ex vivo лечение может не только улучшить исход терапии, но и снизить или устранить цену терапии событий, приводящих к инвалидности осложнений, таких как лейкемия и др. гематологические озлокачествления. Наконец, имеются случаи болезни, при которых генотерапия является единственным эффективным лечением [44]. Можно заключить, что генотерапия на базе недавних улучшенных технологий и клинических результатов, потенциально приводящих к многочисленным рыночным разрешениям новых продуктов генотерапии, составит основу для выбора в пользу лечения многих генетических и приобретенных заболеваний. Новые технологии, такие как CRISP редактирование генов, также способствуют продвижению в направлении клинического использования, но его цена, по-видимому, столь же высока. Во всяком случае политика сдерживания цен и тщательный анализ клинической пользы д. быть сбалансированы относительно цены лечения. Применение Orphan Drug может помочь в случае редких заболеваний: и Strimvelis, и Zalmoxis попадают в этот класс терапии. Однако, необходимо больше. Предлагаются разные способы увеличения возвращения денег со временем в связи с терапевтическими воздействиями и эффективностью продолжительности действия лекарств [17], и помогут новые пути ранних взаимодействия между академическими исследованиями и индустрией [45]. Однако, потребительские возможности генотерапии д. касаться всех участвующих: фармакоиндустрии, биотехнологии, академическиех исследованийя, регуляторов и игроков, все д. вносить вклад в этот процесс. Если это произойдет, то генотерапия сможет предоставить решение для ряда неизлечимых болезней, но и также внести вклад в сдерживание цены при многих болезнях.
