CRISPR/Cas9 представляет собой специфический геномный инструмент, базирующийся на дополнении геномной ДНК 20-mer олигонуклеотидной последовательностью вместе с консенсусной последовательностью, наз. PAM (protospacer adjacent motif). Эта short guide RNA (sgRNA) позволяет рекрутировать Cas9 целенаправлено на геномную последовательность ДНК для обеспечения разрезов двойной нити ДНК (DSB). В случае репарации DSB с помощью nonhomologous end joining (NHEJ), могут возникать небольшие инсерции/делеции в кодирующей последовательности, что может приводить к возникновению преждевременного стоп-кодона [2, 3]. DSB могут быть репарированы и с помощью гомологичной рекомбинации (HR), что может быть использовано для целенаправленного мутагенеза эндогенных генов при использовании мутантной рекомбинационной матрицы [4].

AMP-activated protein kinase (AMPK) является одним из основных сенсоров клеточной энергии, активируемым посредством соединения AMP или ADP с её γ-регуляторной субъединицей и путем фосфорилирования её α-каталитической субъединицы [5]. Будучи активированной, AMPK модифицирует клеточный метаболизм (подавляет anabolism и активирует catabolism), чтобы восстановить клеточный энергетический баланс. Проделаны многочисленные попытки по эффективной активации AMPK в контексте метаболических болезней или рака [5]. Устранение активности AMPK может помочь определить роль AMPK в данном клеточном контексте. К сожалению, нет специфических ингибиторов AMPK, доступных сегодня и доступных генетических knockdown/knockout подходов для оценки функции AMPK (seeChapter 12). Поэтому специфическая делеция AMPK гена представляет собой неоценимый инструмент для оценки специфичности малых молекул целенаправленно воздействующих на AMPK (в основном AMPK активаторы). Поскольку целенаправленно воздействие на регуляторыеAMPKβ или γ субъединицы может быть важным для нарушения регуляции активности и функции AMPK, инактивация гена AMPKα достаточна, чтобы устранить активность AMPK serine/threonine киназы [6]. Сначала мы использовали RNA interference (RNAi) с помощью small hairpin RNA (shRNA), чтобы истощать AMPKα в клетках при acute myeloid leukemia (AML) как это проделывали и в др. клеточных контекстах [7-9]. Однако, мы оказались неспособны достичь полного подавления AMPK?α, при этом остаточная экспрессия составляла 10-20% на уровне белка [10]. Saito с колл. недавно продемонстрировали важную роль для жизнеспособности AMPK в AML клетках под воздействием стрессов [11], тем самым бол объяснен негативный отбор клеток с эффективным нокдауном AMPKα1. Следовательно, эффективный и стабильный AMPKα нокаут в клеточных линиях человека представляет собой проблему. Чтобы избежать этого ограничения, а также снизить вероятность эффектов вне мишени, наблюдаемых при использовании shRNA [12], мы обратились к подходу, базирующемуся на CRISPR/Cas9, чтобы изучить функцию AMPK в линиях клеток человека. Мы использовали CRISPR/Cas9 технологию, чтобы нарушить экспрессию AMPKα1 при acute myeloid leukemia (AML) в клетках MOLM-14 и OCI-AML3 и соотв. AMPKα1 and AMPKα2 экспрессию в клетках карциномы толстой кишки Caco2, это может стать неоценимым инструментом для дальнейшего исследования биологии AMPK и разработки специфических активаторов AMPK для лечения рака и метаболических болезней (see Note 1 ). Мы попытались найти общую ДНК последовательность в генах PRKAA1 и PRKAA2 (кодирующих AMPKα1 и AMPKα2 каталитические субъединицы, соотв.) для целенаправленного воздействия с помощью одной sgRNA, но такая последовательность отсутствовала как в кодирующей, так и не кодирующей ДНК. Поскольку возможно multiplexing sgRNA в один вектор [13], то мы использовали процедуру секвенирования, чтобы достичь нокдауна сначала AMPKα1? а затем AMPKα2 в колониях из одиночных клеток. Мы тем самым разработали систему целенаправленного воздействия на PRKAA1- и PRKAA2 с помощью CRISPR/Cas9, это позволило осуществлять последовательную селекцию AMPKα1-истощенные колонии из одиночных клеток, базируясь на резистентности к антибиотикам и затем к выделению AMPKα2 нокаутных колоний из одиночных клеток, базируясь на экспрессии флуоресцентного маркера. В частности, мы описали процедуру для разработки AMPKα1 и AMPKα2 целенаправленно действующих sgRNAs и клонирование в лентивирусном векторе. Мы также предоставили методы для инфекции, клональной селекции, скрининга и оценки из одиночных клеток клонов CRISPR (see Note 2 ).

Итак, мы описали методы для генетической инактивации AMPKα1/α2 каталитических субъединиц в линиях клеток человека с помощью технологии CRISPR/Cas9.