Посещений:
ГЕМОФИЛИЯ



Генотерапия

Advances in Gene Therapy for Hemophilia
Nathwani Amit C., Davidoff Andrew M., and Tuddenham Edward G. D.
Human Gene Therapy. November 2017, 28(11): 1004-1012.

Gene therapy provides hope for a cure for patients with hemophilia by establishing continuous endogenous expression of factor VIII or factor IX following transfer of a functional gene copy to replace the hemophilic patient's own defective gene. Hemophilia may be considered a "low-hanging fruit" for gene therapy because a small increment in blood factor levels (~2% of normal) significantly improves the bleeding tendency from severe to moderate, eliminating most spontaneous bleeds. After decades of research, the first trial to provide clear evidence of efficiency after gene transfer in patients with hemophilia B using adeno-associated virus vectors was reported by the authors' group in 2011. This has been followed by unprecedented activity in this area, with the commencement of seven new early-phase trials involving >55 patients with hemophilia A or hemophilia B. These studies have, in large part, generated promising clinical data that lay a strong foundation for gene therapy to move forward rapidly to market authorization. This review discusses the data from the authors' studies and emerging results from other gene therapy trials in both hemophilia A and B.
Hemophilia A и B являются Х-сцепленными рецессивными нарушениями, возникающими в результате мутаций гена blood-clotting factor VIII (f8) или IX (f9), соотв. Встречаемость hemophilia A ~ 1/5000, а гемофилии B ~ 1/25000 живых новорожденных мальчиков. Это наиболее распространенная наследуемая кровоточивость в мире. Несмотря на генетические и биохимические отличия эти нарушения неотличимы клинически, при этом тяжесть симптомов кровоточивости варьирует в зависимости от активности остаточного фактора в плазме пациента. Пациенты с фенотипом мягкой кровоточивости имеют базовый уровень плазматического фактора выше 5% от нормы и обычно обнаруживают немного спонтанных эпизодов кровотечения. Однако, у них может возникнуть продолжительное и опасное для жизни кровотечение после травмы или хирургического вмешательства. Недавнее исследование популяции пациентов с гемофилией в Датской клинике 1 показало, что такие с легкими повреждениями пациенты, чей остаточный уровень фактора находится между 5% и 13% может приводить к существенному диатезу, тогда как те у которых уровень выше 13% редко или никогда не переживают кровотечения в суставы. Более половины пациентов с гемофилией A или B имеют уровни фактора менее 1% от нормы.2 Эти индивиды обнаруживают тенденцию к тяжелым кровотечениям, при этом часты спонтанные мышечно-скелетные кровотечения и кровотечния в мягких тканях. Среди таких пациентов, у которых происходят кровотечения в суставы, чаще всего затрагиваются лодыжки, начиная с раннего детства, при этом коленные и локтевые суставы повреждаются позднее. Повторные эпизоды внутрисуставных кровотечений вызывают тяжелые, прогрессирующие, деструктивные артропатии с деформациями, приводящими к полной потере функции суставов и сопровождаются бессилием.
В отсутствие заместительной белковой терапии вероятная продолжительность жизни мальчиков с тяжелой гемофилией лишь около 10 лет. Это всё ещё приложимо ко многим развитым странам. Даже в них вплоть до 1960s, лечение гемофилии ограничивалось вливанием свежей замороженной плазмы. В 1968, впервые стал широко использоваться концентрат для гемофилии A, криопреципитат.3 В 1970s и 1980s разработаны многие концентраты фактора от многих доноров чтобы улучшить чистоту, потенцию, стабильность и удобство использования терапии с замещением фактора. Но эти разработки зависели от того, насколько велик пул доноров плазмы, это привело к широкому распространению трансмиссии человеческого вируса иммунодефицита (HIV) и вируса гепатита С. Почти вся генерация пациентов с гемофилией, получавших новые продукты, стали HIV позитивными и умирали, приобретя синдром иммунного дефицита, до появления высоко эффективной анти-ретровирусной терапии. В период 1970-1986, каждый леченный пациент обладал также гепатитом С и спустя 25 лет некоторые всё ещё страдали от хронической печеночной недостаточности в результате постоянной инфекции. С 1986 предложено лечение теплом, а затем растворимым детергентом для инактивации вирусов HIV и гепатита С. Но затем возникали новые случаи передачи вирусов, покрытых липидами. Передача с помощью продуктов крови др. патогенов, устойчивых к инактивации, таких как parvovirus,3 hepatitis A,4 и прионы (вариант болезни Creutzfeldt-Jakob5), стала основной проблемой. Концентраты рекомбинантных факторов, конечно, были свободны от инфекций, передаваемых с кровью, но их доступность была лимитирована наиболее развитыми странами и очень высокой ценой и затруднениями в продукции. С истечением срока действия патентов на рекомбинантные FVIII и IX факторы на рынок выходят биосимилары и другие варианты с улучшенными фармакокинетическими или другими благоприятными свойствами, с более широкой доступностью, чем до сих пор. В развитых странах стандартом ухода за пациентами с тяжелой гемофилией стала домашняя профилактика с безопасными концентратами, предназначенными для поддержания уровня фактора выше 1% от нормального. Это стало компромиссом, базирующимся на затратах и практических соображениях, который уменьшает, но не устраняет кровотечения. Если начинать в раннем детстве после первых кровоизлияний в суставы, то артропатия в основном предупреждается.6 Продолжаемая в течение всей жизни профилактика приводит к почти полной нормализации ожидаемой продолжительности жизни.7 Относительно короткий полу-период жизни FVIII и FIX iв кровообращении требует частых вн4утривенных вливаний концентратов фактора (по крайней мере 2-3 раза в неделю), это обязательно и чрезвычайно дорого; годовые затраты на профилактику для взрослых составляют ~20000 для пациентов с гемофилией B. Даже при профилактике остаются значительные ограничения, т.к. нормальные уровни фактора свертывания крови восстанавливаются несоответственно; короткий период полу-жизни для фактора свертывания приводит к появлению пиков и впадин циркулирующего фактора свертывания, связанного с прорывными кровотечениями. "Пилообразная" картина уровня фактора, высокая сразу после инфузии, быстро падающая до нижайшего уровня, требует тщательного планирования физических упражнений, которые люди, живущие без гемофилии, вряд ли могут себе представить. Новые модифицированные синтетические препараты FVIII и FIX, которые являются пегилированными или слитыми с белками с длительным периодом полу-жизни, такими как альбумин или Fcγ значительно улучшили профиль устойчивости для FIX, но были менее впечатляющими для FVIII из-за доминирующей роли фактора фон Виллебранда в определении его полураспада. Во всяком случае, эти продукты не устраняли проблем с продолжительностью жизни внутривенных вливаний, с кровотечениями и запредельной ценой. Куммулятивный эффект от приема в течение жизни pegylated белков неизвестен, как и потенциал слияния белков, чтобы индуцировать иммунный ответ.6 Два др. совершенно новых подхода по нормализации гемостаза у пациентов с гемофилией A находятся на расширенных клинических испытаниях. Первое, это синтетический миметик FVIII, состоящий из сцепленных антител, один из которых связывает FIXa, и др. фактор X (Emicizumab).7 Хотя восстанавливаемый гемостаз достигает уровня, сравнимого с уровнем FVIII около 15% у пациентов с или без ингибирующих антител, но имеется значительное отличие от дикого типа FVIII. Активность миметика не находится под контролем, оставаясь постоянно активным по всему кровообращению, тогда как природный FVIII обнаруживает очень четко контролируемую активность во времени и пространстве. Он циркулирует в крови как профактор, тесно сцепленный с носителем, он активируется только в местах образования сгустка и имеет очень короткий период полу-жизни после активации. Последствия этих различий стали очевидны недавно в виде событий тромбоза у пациентов, принимавших Emicizumab и др. агент сворачивания.8 Второй альтернативный подход связан со снижением уровня натурального antithrombin, с помощью анти-смысловой РНК технологии,9, которая работает также у пациентов с гемофилией B. Оба подхода обнаруживают эффективность по редукции количеств кровотечений, но его использование ограничивается риском возникновения тромбозов, и оба подхода всё ещё нуждаются в инъекциях в течение все жизни без восстановления нормального гемостаза.

Rationale for Gene Therapy for Hemophilia


Генотерапия обнаруживает поразительно привлекательный потенциал лечения с помощью эндогенной продукции FVIII или FIX после переноса нормальной копии соотв. гена. Гемофилия была распознана в 1980s как прекрасный кандидат для генотерапии, поскольку все клинические проявления были обусловлены единственным белком, циркулирующим в минимальных количествах в кровотоке. Годы клинических испытаний и испытаний на пациентах с умеренной гемофилией показали, что небольшое увеличение в 1-2% в уровне циркуляции дефицитного фактора свертывания достоверно модифицировало гемморагический диатез. Так, даже умеренная реакция на генотерапию может быть эффективной. Регуляция экспрессии трансгена излишняя, поскольку широки пределы уровней FIX или FVIII без токсичности, и экспрессия эффективна по снижению кровоточивости. Модельные животные, f8- и f9-нокаутные мыши10-12 и собаки с гемофилией A или B13,14 облегчили обширные преклинические исследования стратегии генотерапии. Эффективность терапии может быть оценена легко путем измерения в плазме уровней FVIII или FIX. кДНК для кодирования гена FIX небольшая и пригодна для переноса гена с помощью разных вирусных систем. Кроме того, путь его экспрессии значительно менее сложен, чем путь FVIII, и он обычно экспрессируется на более высоких уровнях. Поэтому большинство исследований по переносу генов сфокусировались на гемофилии B, чем гемофилии A, но это быстро изменилось по мере развития технологии.

Previous Gene Therapy Trials in Hemophilia


Проведено 10 клинических испытаний в Фазе I на субъектах с гемофилией, используя разные подходы. Первое исследование использовало ex vivo перенос ДНК гена, кодирующего B-domain-deleted FVIII гена (BDD-hf8) в аутологические фибробласты перед их имплантацией в сальник субъектов с тяжелой гемофилией A. процедура оказалась легко переносимой без серьезных побочных эффектов, но обнаружила низкую эффективность, обусловленную частично замалчиванием трансгена за счет метилирования ДНК.15,16 С помощью ретровирусного вектора обеспечиваемый перенос гена f9 в ex vivo размноженные аутологичные фибробласты перед их имплантацией в кожу пациентов с тяжелой гемофилией B оказался также надежным, но не эффективным без долговременного сохранения экспрессии.17 In vivo системное введение онко-ретровирусных векторов, кодирующих ген BDD-hf8 с дозами векторов 9 х108 трансдукционных единиц на кг веса переносилось хорошо, но активность в плазме FVIII ~1% от нормы лишь временно выявлялась у 6 из 13 субъектов. Системное введение "gutless" аденовирусных векторов, кодирующих ген f8 полной длины, приводило к временному увеличению активности FVIII до ~3%. Однако, исследование было прекращено раньше из-за подъёма печеночных энзимов, связанных с тромбоцитопенией.18
Внимание затем переместилось на рекомбинантные adeno-associated virus vectors (AAV) из-за их предпочтительного профиля надежности и способности обеспечивать долговременную экспрессию трансгена после трансдукции в постмитотические ткани, такие как печень или мышцы (Table 1).19,20 Первое исследование было dose-escalation Phase I/II исследованием с помощью множественных внутримышечных инъекций AAV вектора, кодирующего ген f9. Ис пользование вектора не было сопряжено с серьезными побочными эффектами, но существенного устойчивого увеличения в плазме FIX до уровня более 1% не наблюдалось ни у одного из 7 субъектов, привлеченных к этому исследованию, несмотря на иммуногистохимические доказательства экспрессии FIX в месте инъекции в течение более 10 лет.19

Table 1. Hemophilia B gene therapy with AAV vectors

Во втором исследовании AAV2 вектор, содержащий специфическую для печени кассету экспрессии, вводился в печеночную артерию. У одного субъекта после воздействия высокой дозой (2 х 1012 vg/kg), уровни FIX увеличивались до приблизительно 10% от нормальных уровней спустя 4 недели после введения вектора и затем неожиданно снижались до базовых значений. Это снижение совпадало с временным 10-кратным увеличением печеночных transaminases, whichкоторые спонтанно возвращались к базовым значениям спустя неделю, что совпадало с процессом самоограничения. Дальнейшее исследование привело е гипотезе, что снижение экспрессии FIX и печеночная токсичность были, скорее всего, обусловлены capsid-специфической цитотоксической атакой Т клеток, направленной против трансдуцированных гепатоцитов вследствие презентации пептида AAV2 капсиды в контексте MHC I молекул.20

The First Long Term Success in a Clinical Trial of Gene Transfer in Hemophilia


Далее был разработан подход по генотерапии гемофилии B с использованием кодон-оптимизированной версии человеческого гена f9 (hf9co) под контролем компактного синтетического печень-специфического промотора (LP1), упакованного в self-complementary AAV вектора (scAAV).21 Пре-клинические исследования на мышах и не человекообразных обезьянах (NHP) показали, что scAAV вектора являются более мощными, чем соотв. однонитчатые AAV (ssAAV) вектора, повышают возможность достижения терапевтических уровней FIX, используя более низкие и потенциально более надежные дозы векторов.21,22
Важным аспектом данных исследований стало использование вектора, псевдотипированного с помощью AAV серотипа 8 капсиды. Это оказалось преимуществом по сравнению с AAV2 векторами, используемыми ранее, с величиной доминирования серотипа у людей ~25% по сравнению с более 60% у AAV2,23 это позволяло исключать меньше субъектов с пред-существующим гуморальным иммунитетом из участников клинических испытаний. Др. преимуществом стал высокий тропизм AAV8 в отношении гепатоцитов, позволяя вектору высвобождаться в периферическое кровообращение, в отличие от AAV2, который вводили непосредственно в печеночную артерию.
6 субъектов с тяжелой гемофилией B были внесены в список инициальной стадии изучения, при этом два субъекта получали последовательно одну из трех доз вектора (низкая доза: 2 х 1011 vg/kg; промежуточная доза: 6 х 1011 vg/kg; высокая доза: 2 х 1012 vg/kg) в виде scAAV2/8-LP1-hFIXco. Была выявлена экспрессия FIX в 1-6% от нормы у всех 6 субъектов, при этом снижение от инициального уровны наблюдалось между 6 и 14 мес. после переноса гена. Бессимптомное временное увеличение в сыворотке печеночных энзимов, как результат клеточной иммунной реакции на AAV8 капсиду, Наблюдался у обоих субъектов, принимавших высокую дозу между 7 и 10 неделями после переноса генов. Лечение каждого коротким курсом приема преднизолона привело к быстрой нормализации печеночных энзимов и поддержанию уровней FIX в пределах 2-4%. 4 из 6 субъектов оказались способны прекратить рутинную профилактику, не страдая от спонтанных кровоизлияний, даже если они привлекались к действиям, которые ранее провоцировали кровоточивость. Двое др. подверглись более продолжительному интервалу профилактики FIX. Это согласовалось с тенденцией к естественной кровоточивости у пациентов с легкой гемофилией (FIX уровнями между 5% и 40%), когда случаи кровоточивости обычно появлялись только после травмы или хирургического вмешательства, появлялись небольшие, и не спонтанные кровоизлияния.24
Более продолжительное наблюдение за этими индивидами показало, что of AAV-обеспечиваемая экспрессия FIX остается относительно стабильной в период, по крайней мере, 6 лет.25 Один из 4-х субъектов, у которого прерванная профилактика в последствии была возобновлена, то спустя неделю профилактического режима было предотвращено кровотечение, вызванное травмой. Остальные оставившие профилактику были свободны от спонтанных гемморагий. В целом снижение от использования FIX у этих 6 субъектов в продолжение исследования составляло несколько миллионов единиц, при этом финансовая экономия составила около 5 миллионов. Впоследствии 4 др. субъекта были приглашены для лечения высокой дозой. 2 из этих субъектов не имели признаков иммунитетом обусловленного воспаления печени и у них была достигнута устойчивая экспрессия FIX на уровне между 5% и 8%. Оба прекратили профилактику и не было отмечено кровоизлияний. Один субъект имел легкий эпизод иммунного гепатита, которые быстро реагировал на стероиды. Уровень FIX у него поддерживался на 5%, и он не нуждался в профилактике и не имел случаев спонтанного кровотечения после переноса гена. Оставшийся субъект испытывал более заметное повышение transaminase, которое, несмотря на оральный курс стероидов, сопровождалось падением устойчивого состояния FIX до 2%. Он имел меньше кровотечений, чем до переноса гена. В нынешнем продолжении испытания препараты вектора подвергнуты дополнительной очистке, чтобы удалить пустые капсиды и оптимум дозы был определен путем эскалации дозы, может ли быть при применении терапевтически благоприятного уровня FIX.

New Hemophilia B Gene Transfer Trials


Успехи в генотерапии с помощью AAV гемофилии в последние 5 лет разительны (Table 1). Два исследования с использованием Padua мутанта характеризуются сходным количеством антигена FIX, как и в более раннем испытании St Jude/UCL, но с 5 - 10 кратным увеличением активности. Т.о., уровни FIX колебались от 18% до 80% у 10 субъектов в исследовании, финансируемом Spark Therapeutics после одиночного применения относительно низкой дозы 5 х 1011 vg/kg. Известно, однако, что 2/10 субъектов имели повышение печеночных энзимов, потребовавшего лечения стероидами. Тем не менее это исследование показало впервые, что возможно "нормализовать" уровни FIX в результате одиночного введения AAV векторов. Не удивительно, следовательно, что средняя величина кровотечений у этих пациентов снизилась до 0.4 по сравнению с 11.1 при предыдущей генотерапии.
Несмотря на стабильную экспрессию в течение более 7 лет, беспокойство относительно AAV генотерапии, описанной выше, вызвано тем, что геном AAV который сохраняется в печени в эписомной форме, будет со временем теряться при замене трансдуцированных гепатоцитов. Возникает возможность падения экспрессии FIX ниже терапевтического уровня. Чтобы преодолеть это теоретическое препятствие, Sangamo Therapeutics разаработала использование AAV векторов для доставки zinc finger nuclease (ZFN) и лишенного промотора гена f9 в in vivo подходе по редактированию генома, нацеленного на локус гена альбумина. Способность интегрировать ген f9 навсегда таким способом предоставляет возможность стабильной экспрессии в течение всей жизни, что особенно важно, когда воздействию подвергаются дети. Фаза I/II клинического испытания по оценке этого подхода у взрослых с тяжелой гемофилией B открыта для зачисления в список. Основным ограничением этого подхода является необходимость в двух AAV векторах: один кодирующий ZFN и др. несущий кДНК f9.

AAV Vectors and Gene Therapy for Hemophilia A


Ограничения в способности упаковки в AAV вектора (4680 kb) и плохой профиль экспрессии FVIII служит препятствием для использования этих векторов для генотерапии гемофилии A. По сравнению с др. белками сходно размера, экспрессия FVIII чрезвычайно неэффективна.26 Биоинженеринг молекулы FVIII привел к усилению экспрессии. Напр., делеция домена FVIII B, который не нужен для активности кофактора, приводит к 17-кратному увеличению в уровне мРНК по сравнению с полной длиной дикого типа FVIII и к 30% увеличению секреции белка.27,28 Это привело к разработке BDD-FVIII белкового концентрата, который теперь широко используется в клинике (Refacto; Pfizer). Pipe et al. показали, что включение проксимального 226 аминокислотного участка из B-domain (FVIII-N6), который богат сцепленными с аспарагином олигосахаридами существенно повышает экспрессию по сравнению с достигнутой при BDD-FVIII.29T Это может быть обусловлено улучшением секреции FVIII, облегчаемой путем взаимодействия с шестью N-сцепленными триплетами гликозилирования внутри этого региона с лектином, связывающим маннозу, LMAN1, или обусловлено снижением тенденции вызывать реакцию на неупакованный белок.30 Эти 6 N-сцепленных консенсусных последовательностей гликозилирования (Asn-X-Thr/Ser) очень консервативны в B доменах у разных видов, указывая тем самым, что они играют важную биологическую роль.31
Др. препятствием для AAV-обеспечиваемого переноса генов при гемофилии A является размер кодирующей последовательности f8, который составляет 7.0 kb что превосходит нормальную способность упаковывать у векторов AAV. Упаковка крупных экспрессионных кассет в AAV вектора была описана, но это очень несостоятельный процесс, приводящий к низкому урожаю векторных частиц со сниженной эффективностью.32,33 AAV вектора, кодирующие собачий BDD-f8 вариант, который имеет размер приблизительно в 4.4 kb дает многообещающие результаты, но необходима дальнейшая оценка использования человеческого BDD-FVIII. Др. подходы включают одновременное применение двух AAV векторов, отдельно кодирующих тяжелую и легкую цепь FVIII, ассоциация которых внутри клеток in vivo приводит к образованию функциональной молекулы.34 Альтернативой подхода из двух AAV векторов стала тенденция из этих векторов формировать голова-хвост concatamers, так что при расщеплении экспрессионной кассеты FVIII так, что один AAV вектор содержит промотор и часть кодирующей последовательности, а также splice donor сайт, тогда как др. AAV вектор содержит splice acceptor сайт и остальную кодирующую последовательность. Вследствие in vivo голова-хвост concatemerization, создается функциональный транскрипт, способный экспрессировать белок FVIII полной длины.35-39 Эти подходы с двумя AAV векторами, однако, неэффективны, громоздки, затратные и трудны для использования в клинике.
Подход, базирующийся на AAV переносе гена, был разработан, чтобы преодолеть ограничения в размере и неэффективности. Экспрессия FVIII человека была улучшена в 10-раз путем реорганизации кДНК дикого типа человеческого FVIII в соответствии с использованием кодонов высоко экспрессируемых генов человека.21,40-42 Экспрессия с B domain deleted codon оптимизированной FVIII молекулы была в дальнейшем улучшена включением пептида в 17 аминокислот, содержащего шесть N-сцепленных сигналов гликозилирования из B домена, необходимых для эффективного клеточного процессинга. Эти изменения привели в результате к новой в 5.2 kb AAV экспрессионной кассете (AAV-HLP-codop-hf8-V3), которая эффективно упаковывалась в рекомбинантные AAV вектора и была способна обеспечить сверхфизиологические уровни экспрессии FVIII у модельных животных в том же самом пределе доз AAV8, которые были эффективны у субъектов с гемофилией B.
Наложение новых аминокислотных последовательностей, как в случае AAV-HLP-codop-hf8-V3, д. приводить к появлению новых антигенов (neo-antigenicity), увеличивая тем самым риск провокации нейтрализующих антител на трансгенный белок. Это также беспокоило, когда рекомбинантный BDD-FVIII (ReFacto) был впервые привнесен для использования у человека. ReFacto содержит "SQ" связь из 14 аминокислот (SFSQNPPVLKRHQR) между A2 и A3 доменами, генерируемую путем слияния Ser743 на N-конце с Gln1638 на C-конце B-домена, создавая neo-antigenic сайт. Однако, несмотря на активное клиническое использование ReFacto, увеличение частоты нейтрализующих hFVIII антител у пациентов, леченных этим продуктом, не наблюдалось.43-45 Кроме того, эпитопы антител в B-домене, которые иногда обнаруживали у пациентов с тяжелой HA, леченных концентратами hFVIII белка были лишены ингибирующей активности, поскольку они связывали нефункциональные эпитопы FVIII.46
15 пациентов с тяжелой гемофилией были недавно лечены AAV5 вектором, содержащим SQ линкерный кодон, оптимизирующий FVIII полигенный экспрессирующий кластер (expression cassette), описанный выше, в Biomarin sponsored Phase I/II клинического испытания. Из них, 7 получали дозу 6 х 1013 vg/kg, и дополнительно 6-ти вводили низкую дозу 4 х 1013 vg/kg. Оставшиеся два пациента получали более низкую дозу (6 х 1012 vg/kg и 2 х 1013 vg/kg), но это не вызывало терапевтического эффекта. Спустя 1 год после введения уровни FVIII в когорте с 6 х 1013 vg/kg были между 20% и 218% от нормы (Table 2). У 3-х из 6 пациентов когорты 4 х 1013 vg/kg уровни FVIII были описаны в пределах нормы, тогда как остальные 3 пациента имели уровни FVIII в умеренных пределах. Все подвергались профилактическому воздействию стероидов после повышения transaminase, отмеченного у первого субъекта, получившего дозу 6 х 1013 vg/kg.

Table 2. Hemophilia A gene therapy with AAV vectors

Предварительные данные от Spark Therapeutic's испытаний SPK-8011 генотерапии гемофилии A, где впервые кагорта получала 5 х 1011 vg/kg AAV вектора, псевдо-типированного с помощью гибридной капсиды показали стабильную экспрессию в 11% у одного пациента, тогда как второй пациент достигал уровня в 14%, что сохранялось после 12 недель. Не выявлено токсичности (включая формирование ингибитора), и ни один из пациентов не получал лечения стероидами, т.к. отсутствовал transaminitis. Третий пациент получил дозу следующего уровня 1 х 1012 vg/kg.

Obstacles to Wider Use of AAV Vector Technology


Safety considerations


Пока риск печеночной токсичности, сопровождающий потерю или снижение экспрессии трансгена у некоторых пациентов, появлялся в виде токсичности, ассоциированной с целенаправленным введением AAV в печень. Кортикостероиды, по-видимому, снижают гепатоцеллюлярные повреждения у некоторых пациентов при испытаниях гемофилии B. В исследованиях гемофилии A, кортикостероиды, по-видимому, оказывают сомнительное действие по ограничению transaminitis. Точная физиологическая основа гепатоцеллюлярной токсичности остается неясной, частично из-за того, что невозможно воспроизвести эту токсичность у модельных животных.
Как и ожидалось, у всех субъектов в этих испытаниях возникает длительно длящийся специфичный для AAV капсид гуморальный иммунитет. Поскольку увеличение анти-AAV IgG не имеет прямых клинических последствий, его присутствие в высоких титрах предваряет последующий успешный перенос генов вектором того же самого серотипа, в том случае, когда экспрессия трансгена будет снижаться низе терапевтического уровня. Однако, некоторые исследования сообщают об эффективном переносе гена с помощью AAV5 вектора у индивидов с обнаружимыми anti-AAV5 антителами.
Др. потенциальной проблемой системного применения AAV является распределение векторных частиц в не печёночных тканях, включая гонады. Геномы векторов временно обнаруживали в семени всех субъектов, в клинических испытаниях AAV2 иAAV8 гемофилии B.24,47,48 Недавнее исследование показало, что провирусная ДНК может быть обнаружена в моноядерных клетках и семени некоторых участников спустя 1 год.
Риск инсерционного мутагенеза вследствие AAV-обусловленного переноса генов считается низким, потому что провирусная ДНК поддерживается преимущественно в эписомной форме. Это согласуется с тем фактом, что дикого типа AAV инфекция у людей, хотя и широко распространена, не связана с онкогенезом. Однако, исследования по глубокому секвенированию показали, что интеграция генома AAV может происходить в печени.49,50 Кроме того, повышен показатель гепатоцеллюлярной карциномы при мукополисахроидозе типа VII (MPSVII) у модельных мышей вследствие перинатального переноса генов с помощью AAV предположительно благодаря интеграции и нарушению импринтированных регионов, богатых miRNAs и snoRNAs в 12-й мышиной хромосоме.51 Последующие исследования на др. мышиных моделях не смогли воспроизвести эти находки, и в целом данные на мышах предполагают, что AAV обладает довольно низким риском туморогенности.52

Scale-up of vector production


Продолжается прогресс методологий в отношении гибкой, масштабируемой продукции и очистки, что подтверждается коммерциализацией AAV био-терапевтики. Наиболее широко используемый метод генерации AAV связан с временной трансфекцией adherent HEK 293 клеток, с помощью плазмид, кодирующих необходимый вектор, helper и упаковочные гены. Преимуществом этого метода является гибкость и скорость, которые важны во время инициальных стадий разработки. Не удивительно поэтому, что почти все препараты AAV векторов, применяемых у человека последние 10 лет, были приготовлены с помощью временной трансфекции adherent HEK 293 клеток. Однако, этот метод обременителен и не соответствует продукции больших количеств клинического уровня векторов, необходимых для Phase III/market authorization испытаний переноса генов при гемофилии. Внимание недавно было сдвинуто к трансфекции суспензионной культуры адаптированных 293 клеток, поскольку они более подходят для масштабирования, чем использование прилипающих клеток.53 Др. масштабируемый метод продукции AAV, который привлек много внимания, это базирующийся на baculovirus.54 Этот метод использован для поддержания разрешения для рынка генотерапии при дефиците lipoprotein lipase, но существуют проблемы, связанные с использованием метода baculovirus, это низкий потенциал. Два др. масштабируемых метода связаны с аденовирусной инфекцией Rep/Cap интегрированной клеточной линией и рекомбинантным HSV helper вектором, которые создают инфекционную систему всё в одном.55,56 Примеси, обычно обнаруживаемые в препаратах AAV векторов, включают белки клеток хозяев, ДНК млекопитающих и пустые каспиды, м. снижать надежность. Поэтому необходимо уделить внимание нижестоящим процессам очистки, которые обычно заключаются в колоночной хроматографии, так что чистота клинической степени AAV препаратов может быть достигнута.

Affordability of Gene Therapy


Hemophilia is a ~$10B market opportunity, dominated by factor replacement therapy, which is effective but expensive and highly invasive. This area has remained largely unchanged over the past 20 years, other than the introduction of extended half-life factor concentrates, which allow for modestly longer intervals between infusion times. In contrast, a single-administration gene therapy is highly effective with no long-lasting safety concerns, enabling many patients to enjoy life without fear of bleeding. It is likely that gene therapy will command a high price, at least initially, in order to recoup the development cost. The World Federation of Hemophilia estimates that 80% of hemophilia patients receive no or only sporadic treatment and are condemned to shortened lives of pain and disability. This is in large part because the cost of prophylactic treatment with factor concentrates is high and in excess of ~120,000 for an adult per year. It is therefore highly likely that gene therapy will not reach this disadvantaged population unless the cost of goods comes down significantly through innovations that improve vector yield and or improve manufacturing efficiency. Successful gene therapy offers the advantage of continuous endogenous expression of clotting factor, which will eliminate breakthrough bleeding and micro-hemorrhages, thereby reducing comorbidities and the need for frequent medical interventions while improving quality of life, thus yielding significant savings for the healthcare system and society in general. These factors will need to be considered when evaluating the health economics of gene therapy for these conditions.

Conclusion


The availability of convincing evidence of long-term expression of transgenic FVIII and FIX at therapeutic levels resulting in amelioration of the bleeding diathesis following AAV-mediated gene transfer is an important step toward the eventual licensure of gene therapy for hemophilia. While several obstacles remain, the current rate of progress in this field suggests that a licensed gene therapy product will be commercially available within the next 5 years. This will likely change the treatment paradigm for patients with severe hemophilia and, in addition, facilitate the development of gene therapy for other disorders affecting the liver, where the treatment options are limited or non-existent.