MDM2/p53. Одними из наиболее изученных PPIs в исследованиях рака является взаимодействие murine double minute 2 (MDM2) с p53. Транскрипционный фактор p53 играет критическую роль в регуляции клеточного цикла, апоптоза, репарации ДНК, старения, ангиогенеза и врожденного иммунитета (8,9). p53 является мощным опухолевым супрессором и в 50% раковых опухолей у человека его противоопухолевая активность нарушена из-за мутаций в гене p53 (10). В большинстве др. раковых опухолей у человека p53 сохраняет свой статус дикого типа, но его функция как супрессора опухолей нарушена из-за множества внутриклеточных механизмов. MDM2 или HDM2 у человека является основным ингибитором p53. MDM2 соединяется непосредственно с p53, вызывая репрессию трансактивационной активности p53, усиливая экспорт в ядро p53 и деградацию p53 с помощью убиквитинирования с помощью активности его E3 лигазы (Figure 2) (11,12,13). Кроме того, избыточная экспрессия MDM2 в опухолях человека коррелирует с плохим клиническим прогнозом и плохой реакцией на современное лечение. Умножение MDM2 обнаруживается в 7% опухолей человека при анализе 28 разных типов рака, тогда как умножение MDM2 и мутации в гене p53 являются взаимоисключающими (14). По этим причинам становится ясно, что вмешательство во взаимодействия MDM2/p53 д. приводить к улучшению противоопухолевой активности p53 и к более эффективному противораковому лечению. MDM2 и p53 взаимодействуют посредством саоих N-терминальных доменов (15,16), точнее говоря, посредством гидрофобной поверхностной борозды на MDM2 и трех ключевых гидрофобных остатков в p53, Phe19, Trp23 и Leu26. Эти остатки и составляют "горячую точку", которая подвергалась целенаправленному воздействию исследователей в попытке идентифицировать молекулы, которые могут разрушить это специфическое взаимодействие (17). Уже 7 MDM2-p53 ингибиторов проходят клинические испытания с впечатляющими результатами.

Figure 2. Small molecule inhibitors in clinical and preclinical stage interfere with PPIs involved in the apoptosis pathway as an anticancer treatment. This scheme illustrates three clinically important PPIs: 1) MDM2/p53; 2) Bcl2, Bcl-XL/Bak, Bax; and 3) IAP/caspases, and their role in the apoptosis cascade. In blue, proteins are depicted that are targeted for inhibition by small molecules and in pink their interaction partners that promote apoptosis. The panels below depict the chemical structures of representative small molecule inhibitors that interfere with the respective PPIs. IAP, inhibitor of apoptosis protein; MDM2, murine double minute 2; PPI, protein-protein interaction.

В 2004 исследователи в Roche (Basel, Switzerland) идентифицировали nutlins, первый класс специфических и активных при оральном применении соединений, содержащих imidazoline, который соединяется с MDM2 имитируя структуру пептида p53, а сопровождающие in vitro данные подтверждают ингибирование клеточного роста. Nutlins были идентифицированы при скрининге разнообразных библиотек малых молекул с использованием базирующегося на surface plasmon resonance p53-MDM2 конкурентном подходе (18). Дальнейшая химическая оптимизация с целью улучшения связывания и фармакокинетики, привела к соединению RG7112, которое было использовано в клинических испытаниях при саркоме, миэлогенной лейкемии, новообразованиях и гематологических неоплазмах (19). Первые многообещающие данные с RG7112 в клинических испытаниях появились в 2012. Результаты от пациентов с MDM2-amplified липосаркомой показали четкое реактивирование p53 и ингибирование клеточного роста. К сожалению, его долговременный прием сопровождался гематологической цитотоксичностью, включая нейтропению и тромбоцитопению (20). Та же компания синтезировала pyrrolidine-содержащее соединение RG7388, аналог RG7112 (21). Эта молекула обладает лучшими фармакологическими свойствами и может активировать p53 сильнее, чем RG7112. После перорального приема он вызывает регрессию опухоли у SJSA-1 osteosarcoma xenograft модельных мышей. Сегодня, RG7388 уже вступил в фазу 2 клинических испытаний лечения пациентов с острой миэлогенной лейкемией, солидными опухолями или с продвинутыми озлокачествлениями в качестве единственного агента или в комбинации с химиотерапевтическими средствами, такими как cytarabine, хотя гематологические побочные эффекты оставались ограничивающими дозировку (22). Sanofi's MI-77301 (SAR405838; Sanofi, Paris, France) является spirooxindole-содержащим соединением, вступившим в фазу 1 клинических испытаний для оценки его надежности, фармакокинетики и биологической активности у пациентов с запущенными опухолями (23). Идентифицированное с использованием базирующегося на структуре подхода, чтобы воспроизвести три ключевых связывающих остатка p53, MI-77301 соединяется с MDM2 с кинетикой наномолярного диапазона (24). Ещё больше молекул было разработано разными фармацевтическими компаниями, нацеленными на это специфическое взаимодействие (Table 1) (25,26). MDM2 ингибиторы используются как одиночные агенты или в комбинации с традиционные химиотерапевтическими агентами. Комбинированное лечение необходимо из-за того, что ингибиторы MDM2 чрезвычайно избирательны к MDM2, но не к MDMX, который также непосредственно взаимодействует с p53 и репрессирует его действие. Обычные химиотерапевтические средства, такие как irinotecan и doxorubicin могутэффективно снижать уровни MDMX и поэтому его комбинация с MDM2 ингибиторами эффективно воздействует на раковые опухоли человека, характеризующиеся высокой экспрессией MDM2 и MDMX. Усилия в направлении идентификации ингибиторов MDMX привели к открытию дополнительных молекул, таких как RO-5963 (27), которые обнаруживает высокое сродство связывания с MDM2 и с MDMX.

Table 1 - Modulation of PPIs involved in cancer by small molecule inhibitors.

The caspase 9, XIAP/BIR3, SMAC system. Апоптоз или запрограммированная клеточная гибель обеспечивается в основном посредством двух путей, однако, эти внутренне присущие и внешние пути сходятся на активации каспаз. Caspase-9 является ингибитором каспазы внутренне присущего пути, которая димеризуется в каталитически активную форму, способную расщеплять и активировать procaspase-3 и procaspase-7 (28). Ингибирующие апоптоз белки (IAPs) обнаруживают избыточную экспрессию или постоянно активированы в опухолевых клетках, приводя к избеганию запрограммированной клеточной гибели. XIAP (X-linked IAP) наиболее мощный ингибитор каспазы среди IAP семейства белков (29) XIAP содержит три baculoviral inhibitory repeat (BIR) домена и кольцевой домен. Этот белок взаимодействует с инициатором caspase-9 посредством своего BIR3 домена и с caspases 3 и 7 посредством своих BIR1/2 доменов (30). BIR3 ингибирует caspase-9 с помощью превентивной димеризации, которая необходима для его каталитической активности. Поиски новых соединений, которые были бы способны прервать взаимодействие XIAP-caspase, привлекли внимание ученых.

Естественный природный ингибитор XIAP, SMAC/DIABLO (second mitochondrial activator of caspases/direct IAP-binding protein with Low PI), высвобождается митохондриями в цитозоль в ответ на апоптические стимулы (Figure 2). SMAC конкурирует с каспазами за связывание BIR доменов посредством его взаимодействия с AVPI тетрапептида (Ala-Val-Pro-Ile), присутствующего на N-терминальной части SMAC (31). С момента открытия белка SMAC в 2000, был проявлен чрезвычайный интерес к созданию малых молекул миметиков SMAC (32). 7 SMAC миметиков достигли клинических испытаний и 5 молекул остаются в клинической разработке. Сегодня IAP ингибиторы принадлежат к двум разным классам, т.e., к моновалентным и бивалентым ингибиторам. Моновалентные ингибиторы, подобные LCL161 (Novartis, Basel, Switzerland) (29,33) GDC-0917/CUDC-427, GDC-0152 (RG7419) (Genentech, San Francisco, CA/Curis, Lexington, MA) (34,35) и SM-406/AT-406 (Wang lab/Ascenta Therapeutics, Malvern, PA) (36) были разработаны исходя из AVPI пептида и имеют IC₅₀ значения в наномолекулярном диапазоне. Бивалентные ингибиторы, такие как Birinapant (TL-32711) (Tetralogic Pharmaceuticals, Malvern, PA) (37-39) и SM-1387 (APG1387) (40) являются димеризованными SMAC миметиками, которые в качестве гомодимеров соединяются одновременно с XIAP's BIR1/2 и BIR3 доменами.

Bcl2 family. B-cell lymphoma 2 (BCL2) семейство белков представлено более чем 20 членами. Некоторые члены являются анти-апоптическими, подобно Bcl2, Bcl-XL, Bcl2l2, Mcl-1, тогда как некоторые др. являются способствующими апоптозу, такие как Bax, Bak1, Bid и Bcl2l11. Члены этого семейства могут вовлекаться в PPIs, чтобы модулировать внутренне прирожденный апоптический путь (41). Антиапоптические члены Bcl2 защищают клетки от апоптоза, ингибируя действие проапоптических членов (Figure 2). При некоторых типах рака антиапоптические члены избыточно экспрессируются, а открытие молекул, которые могут соединяться с их гидрофобными бороздами, предсказывает индукцию апоптоза в раковых клетках с помощью противодействия их защитному эффекту. В 2005, исследователи из Abbott Laboratories (Chicago, IL), использовали базирующийся на ядерном магнитном резонансе скрининг основанный на структуре дизайн, идентифицировали ABT-737, мощный низко молекулярный ингибитор Bcl2, Bcl-XL и Bcl2l2 (42). Дальнейшая оптимизация ABT-737 в терминах фармакокинетики и эффективности посредством базирующихся на фрагментах подходах запустили Navitoclax (ABT-263) в качестве мощного антиапоптического Bcl2 ингибитора, но его использование привело к тромбоцитопении из-за супрессии Bcl-xL (43-45). Позднее была разработана Bcl2-специфическая версия, т.e., ABT-199 (RG7601). Это соединение находится в фазе 1 клинических испытаний по лечению хронической лимфоцитарной лимфомы или малой лимфоцитарной лимфомы с обнадеживающей реакцией у 84% (46,47). Др. благоприятный ингибитор Bcl2 Obatoclax (GX015-070) от Gemin X Pharmaceuticals (Montreal, Quebec, Canada), indole bipyrrole-содержащее лекарство, которое сегодня оценивается в фазе 2 клинических испытаний. Привлекательный профиль безопасности Obatoclax открывает возможность лечения многих форм рака как в отдельности, так и в комбинации с современным лечением. Он хорошо переносится без каких-либо признаков иммуно- или миэлосупрессии (48).

Избыточная экспрессия Mcl-1 в раковых клетках приводит к секвестрации проапоптических Bak, Bax, Bad и Bim, т.о, Mcl-1 также стал предметом поиска ингибиторов. Помимо натуральных соединений, описываемых как ингибирующие это взаимодействие, с помощью метода fluorescence resonance energy transfer (49) Varadarajan et al. предложили небольшую молекулу TW-37 в качестве специфического ингибитора Mcl-1 и в качестве ведущего соединения для дальнейших программ синтеза (50). Недавно серия indole-2-carboxylic кислот была описана, как связывающих Mcl-1 избирательно в наномолярных концентрациях и эффективно разрушающих комплексы Mcl-1/Bim в живых клетках. A-1210477, одно из наиболее мощных связующих соединений, индуцирующих апоптоз в Mcl-1-зависимых раковых клетках и обнаруживающих синергичные эффекты при комбинировании с Navitoclax (51). Разнообразные др. обнадеживающие Mcl-1 ингибиторы недавно были оценены, включая A*STAR соединения, MIM1 и Maritoclax, недавно были рассмотрены Belmar and Fesik (52).

Bromodomains. PPIs вносящие вклад в формирование динамических транскрипционных комплексов, могут предопределять модификации хроматина, такие как ацетилирование, контролируя тем самым транскрипционную судьбу специфических генетических локусов. Bromodomains являются эпигенетическими считывателями, которые распознают ацетилированные лизины (Kacs) на гистонах и заставляют транскрипционные комплексы переключаться на гены. Они обладают общей консервативной структурой, представленной лево-сторонним пучком из 4-х α-спиралей, сцепленных с разными регионами петли разной заряженности и длины. Гидрофобный карман, включающий консервативный аспарагин и 5 молекул воды, распознает ацетилированные лизины. Взаимодействие этого кармана с синтетическими молекулами было исследовано в порядке контроля транскрипции гена (53). Соотв., базирующееся на структуре молекулярное моделирование, осуществленное Bradner's laboratory at the Dana Farber Cancer Institute выявило thienodiazepine (+)-JQ1 соединение, которое является специфическим для bromodomain-containing protein 4 (BRD4) и было использовано в качестве противоракового агента (54,55). Др. ингибиторы BRD4, базирующиеся на (+)-JQ1 структуре, находятся на клинических испытаниях по лечению рака, включая I-BET762 (GSK525762) (Glaxosmithkline, Middlesex, UK) (56) CPI-0610 (Constellation Pharmaceutical, Cambridge, MA) (57) Ten-010 (Tensha Therapeutics, Cambridge, MA) (58) и OTX015 (OncoEthix, Lausanne, Switzerland) (59). Кроме того, RVX-208 является quinazoline специфичным для BRD3, который сейчас находится в фазе 2 клинических испытаний для атеросклероза (2).

Oncology-related PPI targets in the preclinical stage. Proteasome assembling chaperone (PAC) 3 действует как гомодимер и играет важную роль в образовании протеосом. Метаболит грибов Thielocin 1 (TB1) идентифицирован с помощью метода комплементации фрагментов ингибирует димеризацию PAC3 и супрессирует рост раковых клеток (60). Др. соединение, наз. JBIR-22 и выделенное из Verticillus sp., обладает специфической ингибирующей активностью на гомодимеризацию PAC3, тем самым подавляется сборка функциональных протеосом (61).

Снование белка между цитоплазматическим и ядерным компартментом является критическим для аккуратного преобразования сигнальных каскадов. Транспорт белков из ядра в цитоплазму с помощью экспортирующего белка CRM1, который распознает грузовые белки посредством богатого лейцином ядерного экспортного сигнала, был также нацелен на подавление как компонент противоопухолевой стратегии (62). В поиске аналогичных соединений к anguinomycins, которые являются мощными противораковыми агентами, принадлежат к семейству leptomycin, был идентифицирован природный продукт goniothalamin из растения рода Goniothalamus. Goniothalamin вызывает цитотоксичность в клетках рака груди посредством разрушения PPI между CRM1 и грузовыми белками, приводящего к подавлению ядерного экспорта (63).

C момента идентификации Wnt1 в качестве протеоонкогена у мышей моделирующих рак груди, знания о важности пути расширяются. Пертурбации с передачей сигналов Wnt ассоциируют со стимуляцией пролиферации и с предупреждением апоптоза в ряде раковых опухолей человека, это проявляется повышенной транскрипционной активностью β-catenin (64). Немногие PPIs используют Wnt путь, нацеленный на ингибирование, чтобы ограничивать негативный эффект на прогрессирование рака. Взаимодействие Frizzled (FRZ) и Disheveled (DVL) является одной из первых ступеней на этом пути. Особенно многообещающим для работки лекарств является наблюдение, что передача сигналов Wnt ассоциирует с онкогенезом посредством FRZ-7 рецептора и оба, как было установлено, DVL и FRZ-7, избыточно экспрессирующиеся в линиях опухолевых клеток. В самом деле, ингибирование взаимодействия FRZ-7/DVLс помощью малой молекулы FJ9 вызывает апоптоз в линиях раковых клеток человека и подавляет опухолевый рост в ксенотрансплантатах мышей (H460)in vivo (65). Взаимодействие β-catenin c Tcf-4, ещё больше подавляет путь Wnt, оно также было использована для поиска ингибиторов PPI. Около 7000 природных соединений было тестировано сж высокопроизводительного скрининга ELISA в отношении их способности ингибировать β-catenin/Tcf-4 взаимодействие в контексте колоректального рака (66). Среди них два компонента грибов, PKF115-584 и CGP0409090, являются специфическими ингибиторами взаимодействий, способными ингибировать рост рака толстой кишки (67) и гепатоцеллюярных карцином (68). Для активации транскрипции β-catenin/Tcf-4 комплекса, необходим ко-активатор cyclic AMP response element-binding protein (CBP). Небольшая молекула ICG-001 соединяется специфически с CBP, приводя к снижению транскрипционной активности комплекса. ICG-001 индуцирует апоптоз в трансформированных клетках толстой кишки и в модельных мышиных ксенотрансплантах рака толстой кишки (69).

Ингибирование PPIs является также стратегией лечения лейкемии. Menin функционирует в качестве критического онкогенного кофйактора mixed lineage leukemia (MLL) слитых белков в возникновении острой лейкемии, а ингибирование взаимодействия menin с MLL слитыми белками представляет собой очень многообещающую стратегию устранения их онкогенной активности. В попытке идентифицировать малые молекулы ингибиторы взаимодействия menin-MLL, Grembecka et al. скринировали 49000 малых молекул, используя метод флюоресцентной поляризации и идентифицировали MI-2 (70). Базируясь на кристаллических структурах menin с MI-2, была получена более мощная вторая генерация ингибиторов, а именно MI-2-2 (71) иd MIV-6 (72), которые эффективно воспроизводят горячие точки MLL пептида. Оба соединения обладают связывающей активностью в наномолекулярном диапазоне и предварительные данные in vitro подтверждают концепцию разработки ингибиторов PPI для борьбы с лейкемией. Кроме того, два высоко эффективных и орально применяемых menin-MLL ингибитора (MI-463 и MI-503) были описаны недавно, как обнаруживающие выраженные эффекты на MLL лейкемические клетки и усиливают жизнеспособность у in vivo мышиных моделей MLL лейкемии (73).