Мы установили, что ангиогенный фактор AGGF1 может активировать аутофагию ECs in vitro и у мышей с MI in vivo, тем самым идентифицирован новый и важный вышестоящий регулятор аутофагии. Интересно, что ангиогенный фактор AGGF1, как было установлено, вызывает аутофагию во время ангиогенеза. Сначала мы продемонстрировали, что мыши с острым MI (subject to LAD) обнаруживают повышенные уровни экспрессии или AGGF1мРНК или белка, что ассоциировало с усилением аутофагии (Fig 4). Во-вторых, аутофагия была подавлена у Aggf1+/- нокаутных мышей (Fig 6). В-третьих, воздействие на HUVECs рекомбинантным AGGF1 драматически индуцировало аутофагию (Fig 1). Эти данные показывают, что AGGF1 является сильным индуктором аутофагии. Полученные данные также выявили новую in vivo функцию AGGF1 в регуляции аутофагии. Механистически мы установили, что AGGF1 активирует аутофагию путем стимуляции активности JNK. Два JNK ингибитора и JNK1 siRNA блокируют индукцию аутофагии с помощью AGGF1 (Fig 9). AGGF1-инждуцированная активация JNK повышает активность Vps34 и облегчает совместную сборку Becn-1-Vps34-Atg14L комплекса, необходимого для аутофагии. Соотв. эти функции нарушались с помощью ингибиторов JNK inhibitors и JNK1 и Atg14L siRNAs (Fig 9). Ранее мы сообщали. что AGGF1 активирует AKT, чтобы регулировать спецификацию вен у рыбок данио [6]. Однако, усиление активации AKT, как было установлено, также ингибирует аутофагию [19]. Следовательно, путь передачи сигналов AGGF1-JNK, но не путь передачи сигналов AGGF1-AKT, который модулирует аутофагию. Это заключение подтверждено недавней находкой, что активация JNK1 с помощью FGF18 индуцирует аутофагию при росте кости [20].

Во время индукции аутофагии несколько др. ключевых модуляторов из комплекса Becn-1-Vps34-Atg14Lбыло идентифицировано, включая Unc-51 Like Autophagy Activating Kinase 1 (ULK1) и Autophagy And Beclin 1 Regulator 1 (AMBRA1) [21]. Дальнейшие исследования д. проверить, действительно ли ULK1 или AMBRA1 влияют на регуляцию комплекса BECN-VPS34-Atg14 с помощью AGGF1-JNK пути. Atg14L, как было установлено, является уникальной субъединицей специфичного для аутофагии комплекса PI3K, участвующего в формировании аутофагосом. Atg14L кооперирует с ER-resident Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein Receptor (SNARE) белком syntaxin 17 (STX17), чтобы собирать аутофагосомы в местах контактов ER-mitochondria [22]. Было бы интересно исследовать, действительно ли AGGF1 модулирует взаимодействие Atg14L-STX17, участвующее в формировании аутофагосом.

Др. главная новость связана с неожиданной находкой, что аутофагия важна для терапевтического ангиогенеза. Полученные данные демонстрируют существенную роль аутофагии в ангиогенезе in vivo у мышей. Молекулярный механизм, с помощью которого аутофагия активирует ангиогенез, неизвестен. Одним из возможных механизмов является тот, что аутофагия индуцирует метаболиты, которые необходимы для эффективной пролиферации, миграции EC и ангиогенеза. Недавно, было показано, что синтез fatty acid carbons и deoxyribose nucleoside triphosphate (dNTP) необходим для пролиферации EC и разрастания сосудов [23].

Интересно, что AGGF1 активирует аутофагию не только в ECs, но и во всех исследованных клетках, включая кардиальные клетки HL1 и клетки H9C2 и клетки сосудистых гладких мышц (VSMCs). Эти данные подтвердили, что AGGF1 выполняет более широкую биологическую функцию. Поскольку функция AGGF1, как полагают, более всего связана с ангиогенезом, то исследовали ECs. Драматические терапевтические эффекты AGGF1 на мышей с CAD и MI могут быть связаны с благоприятными эффектами AGGF1-активируемой аутофагии не только в ECs, но также в кардиомиоцитах и др. клетках.

Аутофагия происходит при низком базовом уровне при физиологических условиях в сердце и усиливается при ишемии и реперфузии [24,25]. Базовый уровень аутофагии в сердце играет важную роль в поддержании клеточного гомеостаза; однако, роль повышенной аутофагии в ответ на ишемию и реперфузию (возобновление кровотока после ишемии) противоречива [12]. Кстати, неясно, действительно ли аутофагия защитная (выживание клетки) или повреждающая (гибель клетки) в сердце во время аутофагии/реперфузии [13,25]. В некоторых случаях усиление аутофагии ассоцирует с кардио-защитным эффектом, но взаимоотношение причина-эффект недостаточно убедительно. В др. случаях усиление аутофагии в ответ на ишемию/реперфузию вредный и усиливает гибель кардиомиоцитов [12]. Здесь мы получили доказательства, что аутофагия важна для функционального восстановления сердца при остром MI у мышей. Предварительная обработка MI мышей ингибиторами аутофагии bafilomycin A1 и chloroquine устраняла терапевтические эффекты белка AGGF1 на повышение жизнеспособности и улучшение миокардиальных сокращений и восстановление кардиальной структуры (Fig 7). Сходным образом, AGGF1 белок полностью теряет свои терапевтические эффекты у дефицитных по аутофагии мышей (Becn1+/- нокаутные мыши и AAV9-CMV-Cre Atg5 нокаутные мыши) (Figs 7 and 8). Эти данные подтверждают, что аутофагия играет защитную роль при ишемии и необходима для кардиальной репарации после острого MI. Во время изучения жизнеспособности при MI Becn1+/- нокаутных мышей и AAV9-CMV-Cre Atg5 KO мышей, мы установили, что дефицит аутофагии у Becn1 KO и Atg5 KO мышей увеличивает выживаемость MI мышей в течение первых 2 недель, но драматически снижается выживаемость при MI после первых 2 недель (Figs 7 and 8). Данные указывают на то, что аутофагия является защитной в отношении жизнеспособности при MI при long run, а снижение аутофагии ведет к снижению выживаемости. Однако, в короткий период времени аутофагии может быть повреждающей при MI потенциально из-за сильной стрессовой реакции на ишемию. Вместо этого, снижение аутофагии приводит к повышению жизнеспособности.

Использование ангиогенных факторов для генерации новых кровеносных сосудов из уже существующей сосудистой сети, т.e., терапевтический ангиогенез, является привлекательной стратегией для лечения пациентов с CAD и MI. Семейство VEGF (vascular endothelial growth factors) факторов роста и fibroblast growth factor 2 (FGF2) являются широко изученными ангиогенными факторами для терапевтического миокардиального ангиогенеза. Для VEGF терапевтическую дозу трудно определить, поскольку низкие дозы не обнаруживают терапевтического эффекта, тогда как высокие дозы вызывают аберрантный рост сосудов и проницаемость сосудов. Для FGF2, долговременные эффекты не обнаруживаются. Мы установили, что проницаемость сосудов увеличивается у Aggf1+/- KO мышей, а применение AGGF1 блокирует проницаемость сосудов у мышей. Следовательно, терапия белком AGGF1 имеет уникальные преимущества перед VEGFA в отношении терапевтического ангиогенеза. Мы показали в данной работе, что на мышиной модели острого MI, терапия белком AGGF1 достоверно снижает смертность и драматически улучшает кардиальную функцию и миокардиальные сокращения путем подавления кардиальной гипертрофии, уменьшая размер инфаркта и предупреждая кардиальный апоптоз и фиброз in vivo (Fig 4). AGGF1 белковая терапия усиливает миокардиальный ангиогенез у модельных мышей при остром MI (Fig 5B), эффект, который драматически улучшает функцию и сокращения миокарда. Наши данные продемонстрировали, что ангиогенный фактор AGGF1 является новым ростовым фактором с многообещающим терапевтическим потенциалом для лечения CAD и острого MI.

Одной из проблем терапевтического ангиогенеза является его эффективность. Учитывая важную роль аутофагии в терапевтическом ангиогенезе, поддержка аутофагии необходима для эффективного терапевтического ангиогенеза и увеличение уровней аутофагии может быть потенциальной стратегией повышения эффективности терапевтического ангиогенеза. Напр., использование фармакологических агентов, таких как rapamycin [12], который усиливает аутофагию, может увеличивать эффективность терапевтического ангиогенеза при CAD и MI во время терапии белком AGGF1.