Посещений:
ДОСТАВКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА В КЛЕТКИ ЦНС



Методы трансфекции

In vivo methods for acute modulation of gene expression in the central nervous system
Andrzej W.Cwetsch, Bruno Pinto, AnnalisaSavardi,LauraCancedda
Progress in Neurobiology Available online 22 April 2018 https://doi.org/10.1016/j.pneurobio.2018.04.008

Accurate and timely expression of specific genes guarantees the healthy development and function of the brain. Indeed, variations in the correct amount or timing of gene expression lead to improper development and/or pathological conditions. Almost forty years after the first successful gene transfection in in vitro cell cultures, it is currently possible to regulate gene expression in an area-specific manner at any step of central nervous system development and in adulthood in experimental animals in vivo,even overcoming the very poor accessibility of the brain. Here, we will review the diverse approaches for acute gene transfer in vivo, highlighting their advantages and disadvantages with respect to the efficiency and specificity of transfection as well as to brain accessibility. In particular, we will present well-established chemical, physical and virus-based approaches suitable for different animal models, pointing out their current and future possible applications in basic and translational research as well as in gene therapy.
Многочисленные альтерации генов во время развития головного мозга ведут к нарушениям головного мозга, характеризующимися аномальным поведением, зависимым от поврежденной области. С др. стороны, генетические альтерации у взрослых также приводят к разнообразным, связанным с головным мозгом болезням и нейродегенеративным Это указывает на необходимость регуляции во времени и пространстве специфических генов, для соотв. функций головного мозга. Разработка техники для трансфекции генов in vivo привлекает повышенное внимание к пониманию роли разных генов. лежащих в основе механизмов развития и функции ЦНС (basic research) и к изучению генов, участвующих в нарушениях ЦНС, чтобы найти новое возможное лечение (translational research). В частности, в последние годы базовые исследования извлекли выгоду из новых инструментов по редактированию генов ( CRISPR-Cas9 технология; Ahmad et al., 2018) и модуляции активности нейронов (optogenetics and chemogenetics; Dobrzanski and Kossut, 2017; Towne and Thompson, 2016),связанными с системами доставки нуклеиновых кислот. Трансляционные исследования концентрируются в основном на возможности лечения нарушений ЦНС путем манипуляций с экспрессией генов (генотерапия) скорее, чем классической фармакологией, которая демонстрирует свою неэффективность (Gribkoff and Kaczmarek, 2017). Поэтому разработка новых методов для модуляции генной экспрессии in vivo приобретает всй большее значение в последние годы. Эти модуляции могут быть достигнуты или путем генерации генетически модифицированных животных или с помощью острых процедур по модуляции экспрессии генов.
В целом острые модуляции экспрессии генов нуждаются в процессах трансфекции или трансдукции (т.e., в процедурах, которые вносят чужеродные нуклеиновые кислоты, такие как ДНК/РНК в клетку) , чтобы создать генетически модифицированные клетки или организмы с помощью невирусных или вирусных методов, соотв. В самом деле, многие молекулы, такие как нуклеиновые кислоты и некоторые лекарства, неспособны диффундировать через липофильные клеточные мембраны из-за своих физико-химических свойств (напр., гидрофильности, заряда) и/или размера.
Хотя и очень эффективно острое внесение ДНК в клетки млекопитающих in vitro известно давно (Graham and van der Eb, 1973), почти 40 лет ученые пытаются повысить эффективность этого процесса in vivo (Crystal, 2014). Напр., циркулирующие нуклеиновые кислоты при трансфекции обнаруживают очень короткий период полу-жизни in vivoin vivo и особенно затруднительным оказывается головной мозг по ряду причин. Во-первых, изолирован, недоступен для окружающей среды из-за присутствия черепа и гемато-энцефалического барьера (BBB), которые отделяет кровоток от внеклеточной жидкости головного мозга. Во-вторых, головной мозг содержит несколько отличающихся областей, каждая из которых характеризуется специфической функцией, и нуждается в область-специфической трансфекции, критической для этого органа. В-третьих, ЦНС содержит сотни миллионов нервных и глиальных клеток, характеризующихся огромным разнообразием (напр., даже среди нейронов имется широкая вариабельность разных типов и разными функциями). Наконец, нейроны являются пост-митотическими клетками, которые не делятся, что требует независимого от клеточного цикла введения генетического материала.
Т.к. почти 95% животных, используемых для исследований, являются мыши и крысы (Badyal and Desai, 2014), поэтому мы сконцентрируемся на грызунах. Долгое время преобладающим подходом для острого переноса генов in vivo у грызунов была разработка разных вирусных векторов со всё увеличивающейся эффективностью трансфекции и тканевой специфичности (see viral methods below). Несмотря на это благодаря ограничениям, связанным безопасностью переноса генов вирусами, многие физические стратегии также были приспособлены, такие как электропортация и sonoporation (see physical methods below). Однако, физические методы нуждаются в строгих условиях (напр., сильном электрическом поле или ультразвуке) для эффективной трансфекции, и поэтому был создан ряд синтетических переносчиков для нуклеиновых кисло, пригодных для химической трансфекции (see chemical methods below; Yin et al., 2014). Недавно разные методы были скомбинированы (напр., физические и химические методы или вирусные и физические методы) чтобы преодолеть ограничения одно и преимущества др.
В обзоре, во-первых, мы сконцентрировались на химических методах, которые включают широкий выбор переносчиков для нуклеиновых кислот, позволяющих проникать через клеточную мембрану. Во-вторых, мы описываем физические методы, которые предоставляют преимущества для физических сил по увеличению проницаемости мембран, и возможно по направлению нуклеиновых кислот к предназначенному месту. В-третьих, мы рассмотрим базирующуюся на вирусах способность. Интересно, что все описанные техники, очень отличные, но каждая из них предоставляет некоторый уровень перекрывания, создавая огромный набор для выбора, когда планируются разнообразные эксперименты по переносу генов in vivo.

2. Chemical methods for transfection


Химические методы трансфекции являются набором техник, которые базируются на внешних переносчиках, характеризующихся специфическими химическими свойствами, которые важны для трансфекции интересующих экзогенных нуклеиновых кислот (Table 1). В частности, химические носители готовятся чтобы они были готовы формировать комплексы с нуклеиновыми кислотами и интернализоваться с помощью эндоцитоза в клетки мишени. Поскольку генетический материал высвобождается в цитоплазму посредством перемещения эндосом и последующего их вступления в ядро для транскрипции в мРНК, что д. сопровождаться трансляцией в функциональные белки в цитоплазме (Fig. 1). Химические методы часто обнаруживают зорошую способность к упаковке генов и низкой иммуногенностью и токсичностью и они довольно безопасны для оператора (Zhi et al., 2018). несмотря на это большинство химических методов обнаруживают низкую эффективность и они всё ещё базируются на инвазивных методах используемых in vivo приемов (напр., intrathecal/intraventricular инъекции). Лишь недавно быстрое развитие материалов позволило нано-науке получить конструкции более эффективных химических векторов для трансфекции in vivo; эти вектора пригодны не только для базовых исследований, но и также в области биомедицины (Glover et al., 2005; Lu and Jiang, 2017; Ramamoorth and Narvekar, 2015; Yin et al., 2014).
Table 1. Chemical methods for transfection.

Fig. 1. Chemical methods of gene delivery. Lipid-mediated gene transfer (left) occurs by the interaction between the positively charged surface of the carriers and the negatively charged cell membrane. This interaction promotes endocytosis, creating an endosome lipocomplex. The complex is then degraded in the cell cytoplasm, and the released DNA is transported to the nucleus. Nanoparticle-mediated gene transfer (middle) occurs by the nanoparticles binding to receptors on the cell surface, followed by endocytosis. During endosome degradation in the cell cytoplasm, the DNA attached to the core of the nanoparticles is released and transported to the nucleus. Similar to lipid-mediated gene transfer, polymer-mediated gene transfer (right) occurs via charge differences between the carriers and the cell membrane, which promotes binding and endocytosis. During endosome degradation, the DNA is released from the polymer structure and is transported to the nucleus. After DNA transcription, the mRNA exits the nucleus, and it is translated into a protein in the cytoplasm.

2.1. Lipids


Использование липидных носителей для трансфекции (т.e., lipofection) для доставки in vitro в клетки распространено с 1980s (Fraley et al., 1980; Lu et al., 1989). Катионовые липиды - наиболее широко используемые липидыs - являются синтетическими липидами с позитивно заряженным гидрофильным доменом, соединенным с линкером с помощью длинного липофильного хвоста. Во время трансфекции негативно заряженный фосфат в остове нуклеиновой кислоты взаимодействует с гидрофильным доменом на липиде, создавая структуру, наз-. lipoplex (2-200-nm в диаметре; (Higuchi et al., 2006; Inoh et al., 2017; Ramamoorth and Narvekar, 2015;Ross and Hui et al., 1999)). Как только lipoplex достигает клеточной мембраны, он интернализуется c помощью эндоцитоза и генетический материал затем высвобождается из эндосом внутрь клетки (Nayerossadat et al., 2012; Fig. 1). Хотя сильно позитивный заряд на поверхности липидов защищает генетический материал от расщепления c помощью циркулирующих эндонуклеаз (Ramamoorth and Narvekar, 2015), базирующиеся на липидах вектора всё ещё страдают короткой продолжительности полу-жизни in vivo. Это обусловлено быстрой деградацией липидных частиц c помощью ретикуло-эндотелиальной системы, которая состоит из фагоцитических клеток, расположенных в соединительной ткани (Nayerossadat et al., 2012; Petschauer et al., 2015;Song et al., 2014). Чтобы решить этот вопрос, к смеси ДНК и катионовых липидов часто добавляются т. наз. липиды помощники (наиболее распространенным является polyethylene glycol (PEG) и 1,2-dioleoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DOPE)). Они являются нейтральными липидами, которые усиливают стабильность lipoplex's, повышая тем самым продолжительность полу-жизни их в сыворотке. Более того, добавление липидов помощников повышает также слияния между липидными частицами и клеточной мембраной и облегчает перемещение генетического материала между эндосомами и клеточным ядром (Hassani et al., 2005; Nayerossadat et al., 2012; Yin et al., 2014; Zhi et al., 2018). Наконец, в зависимости от состава катионовых липидов в смеси и концентрации генетического материала, lipoplexes могут принимать разные вторичные структуры, которые могут способствовать эффективности трансфекции. Эта структурная изменчивость в основном обусловлена разным распределением зарядов на их поверхности и разными областями взаимодействия с клеткой. Напр., гексогональная фаза lipoplex может спонтанно высвобождать содержимое ДНК, если эти lipoplexes вступают в контакт с анионовыми пузырьками, тогда как мульти-ламелларные везикулярные структуры (где генетический материал расположен в виде сэндвича между липидными слоями) обнаруживают тенденцию не высвобождать свое содержимое. Интересно, что переходу от мульти-ламеллярного к гексогональному состоянию способствует добавление DOPE к смеси липидов с ДНК (Dan, 2015; Ma et al., 2007). Благодаря этим частицам, увеличивающим эффективность трансфекции, липиды обеспечивают более эффективную трансфекцию гена c помощью прямой инъекции in vivo в желудочки или головной мозг мышей (Hassani et al., 2005; Roessler and Davidson et al., 1994). Более того, липиды были использованы в качестве метода по доставке генов при лечении глиобластом c помощью инъекций в опухоль (Cikankowitz et al., 2017; Lagarce and Passirani, 2016; Pulkkanen and Yla-Herttuala, 2005).
Lh/ структурное образование может появиться среди катионовых липидов = это nanoemulsion. Липидная наноэмульсия (LNE) это дисперсия наночастиц липидов (100-400-nm в диаметре) в жидкой фазе, которая получается in vitro путем добавления сурфактантного агента, чтобы предупредить липиды от коалесценции в макроскопическую фазу. Главным преимуществом LNEs легкость приготовления, низкая цена и способность продукции в крупных масштабах (Liu and Yu et al., 2010; Ramamoorth and Narvekar, 2015). LNEs были успешно использованы in vitro, показав более высокую эффективность, чем липосомы (Liu and Yu et al., 2010). Использование наноэмульсий in vivo становится более популярным из-за их низкой токсичности и высокой стабильности (Ramamoorth and Narvekar, 2015). Напр., успешная доставка tumor necrosis factor alpha (TNF-α) small interfering RNA (siRNA), чтобы воздействовать на lipopolysaccharide (LPS)-индуцированное воспаление нейронов было осуществлено у крыс (Kim et al., 2010). Конечно, небольшие размеры наночастиц также позволяют производить доставку через нос, удобный способ для преодоления проницаемости BBB и предупреждения действия циркулирующих в крови нуклеаз, которые могут переваривать интересующую ДНК (Yadav et al., 2016).
Наконец, липидные переносчики также недавно были использованы в форме твердых липидных наночастиц (SLNs). SLNs и липидные наносферы (70-230 nm в диаметре) с наружной гидрофильнрой оболочкой, состоящей из двойного слоя фосфолипидов и внутренней сердцевины, содержащей липиды из длинных цепочек, образуют частицы, которые твердые и стабильные при температуре тела (Kaur et al., 2008). В последнюю декаду возник повышенный интерес к использованию этих наночастиц для доставки генов, главным образом благодаря их стабильности и биосовместимости (Pathak et al., 2017). Интересно, что SLNs были использованы для доставки siRNAs против c-met у мышей, моделирующих глиобластому, c помощью внутривенных инъекций in vivo и лечение показало положительный результат (Jin et al., 2011). Это подчеркивает тот факт, что SLNs очень стабильны и могут пересекать BBB, делая их очень соблазнительными векторами для переноса генов in vivo а головной мозг.

2.2. Nanoparticles


В результате быстрого развития нанотехнологий, использование наночастиц для доставки генов быстро увеличивается. Основным преимуществом такого типа носителей является высокая стабильность, значительная защита от циркулирующих нуклеаз и низкий риск токсичности (Bharali et al., 2005).

2.2.1. Silica and gold nanoparticles


Silica (оксид силикона) является очень податливым материалом. Silica наночастицы являются сфе6рами (30 nm в диаметре), которые можно довольно легко производить и модифицировать во время синтеза. В частности, silica наночастицы, покрытые органическими аминокислотами, могут взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами и могут защищать генетический материал от эндонуклеаз. Исследования in vitro показали, что после фагоцитоза, покрытые silica наночастицы могут интернализоваться, и затем высвобождать ДНК (Kneuer et al., 2000a, b). Интересно, что silica наночастицы были также использованы для изучения развития новорожденных нейронов in vivoпутем трансфекции EFGFR1-кодирующими плазмидами в субвентрикулярной зоне взрослых мышей с признаками клеточной дегенерации или системной или специфичной для головного мозга токсичностью (Bharali et al., 2005; Luo and Saltzman, 2006). Однако недавнее сообщение показало признаки воспаления нейронов у крыс вследствие внутри-назального применения silica наночастиц (Parveen et al., 2017).
Наночастицы золота также используются в качестве векторов для доставки генов, т.к. золото хорошо изучено в биологическом контексте благодаря очень низкой токсичности и его способности соединяться с широким кругом органических молекул. В частности, некоторые исследования in vitro показали, что наночастицы золота, покрытые органическими катионовыми молекулами, способны связывать нуклеиновые кислоты и эндоцитозироваться, обеспечивая эффективную доставку генетического материала (Bishop et al., 2015; Connor et al., 2005; Ekin et al., 2014; Jensen et al., 2013; Levy et al., 2010; Peng et al., 2016). Кроме того, наночастицы золота обладают также сильными и настаиваемыми оптическими свойствами (Pissuwan et al., 2011; Wijaya and Hamad-Schifferli, 2008). Интересно, что наночастицы золота возможно могут пересекать BBB, как показано на единственной in vitro модели (Bonoiu et al., 2009) , а также in vivo (Jensen et al., 2013). В частности, успешная трансфекция siRNA против анти-апоптического гена Bcl2 L12 была продемонстрирована на клетках глиомы после системных инъекций наночастиц золота у мышей. В частности, siRNA обнаруживали незначительную ферментативную деградацию (Jensen et al., 2013). Недавно частицы золота были задействованы с PEG или др. длинными органическими молекулами, показав значительно более высокую проницаемость BBB (Escudero-Francos et al., 2017; Takeuchi et al., 2018). Удисительно, наночастицы золота были также использованы, чтобы нарушить регуляцию α-synuclein у мышей, моделирующих болезнь Паркинсона, после внутрибрюшинных инъекций и давало позитивный результат по анатомическим проявлениям Паркинсоона (Hu et al., 2018).

2.2.2. Fullerenes


Fullerenes являются углеродными молекулами разных форм и размеров: сферические fullerenes (SFs) наз. Buckminster fullerenes, в то время как цилиндрические фуллерены с пустой сердцевиной наз. углеродные нанотрубчки (CNTs). Неправдоподобные свойства фуллеренов, такие как высокая температурная и электрическая проводимость, огромная прочность и ригидность, позволяют этим молекулам быть впереди в нано-инженерной индустрии (Yang et al., 2006). Более того, SFs могут быть функционализованы c помощью катионовых зарядов и тем самым могут стабильно конденсировать двунитчатую ДНК в глобулы (менее 100 nm в диаметре), которые устойчивы к внутриклеточным и циркулирующим нуклеазам. Несмотря на это известно единственное in vivo использование SFs - это успешная доставка гена Insulin 2 непосредственно в печень мышей без признаков системной токсичности (Maeda-Mamiya et al., 2010). Наконец, сообщалось, что SFs способны пересекать BBB, хотя отсутствуют сообщения об их использовании для доставки генов в ЦНС (Quick et al., 2008).
Кроме того, CNTs были изучены как позитивные вектора для доставки генов. Тем не менее, их использование для биомедицинских целей затруднительно, т.к. CNTs плохо растворимы в воде. Одной из стратегий повышения растворимости в воде является функционализация их поверхности, в самом деле, CNTs функционализованные пептидами и конъюгированные с ДНК или РНК способны успешно проникать через клеточную мембрану, а c помощью ДНК функционализованные, CNTs способны транслоцироваться в ядро в системе in vitro (Lacerda et al., 2008; Pantarotto et al., 2004; Singh et al., 2005). Ntv не менее, использование in vivo CNTs всё ещё находится на ранних стадиях (Lacerda et al., 2008; Zhang et al., 2014). Khuloud et al. трансфицировали кору головного мозга у крыс, моделирующих ишемию, CNTs, функционализированные c помощью siRNA для Caspase 3. Такое воздействие успешно снижало число апоптических клеток вокруг повреждения, сопровождаемое снижением дефицита двигательной активности у оперированных крыс (Al-Jamal et al., 2011; Costa et al., 2016). Т.о., хотя использование фуллеренов в биологии всё ещё во младенчестве, очевидно, что эти углеродные наномолекулы открывают новые, интересные перспективы в качестве векторов по доставке генов (Montellano et al., 2011)

2.3. Polymers


Полимеры являются макромолекулами, состоящими из повторяющихся единиц. Подобно lipoplexes, полимеры используются для доставки генов и имеют положительные заряды на своей поверхности, которые взаимодействуют с негативно заряженным остовом из нуклеиновых кислот, чтобы сформировать комплексы, наз. polyplexes. Среди полимерных материалов, используемых для трансфекции, polyethylenimine (PEI) является одним из наиболее эффективных векторов in vitro и in vivo (Pack et al., 2005). PEI является синтетическим, растворимым в воде полимером (0.8 -1000 kDa по м.в.), а его структурная сложность может варьировать от линейной до сильно разветвленной (Ewe et al., 2016;Ramamoorth and Narvekar, 2015). PEIs интернализуются посредством фагоцитоза клетками и могут избегать переваривания и деградации c помощью эндосом посредством proton-sponge эффекта. Благодаря своему высокому положительному заряду (благодаря большому количеству частично protonated аминогрупп, которыми они обладают), PEIs могут останавливать природную ацидификацию эндосом, генерируя сильный осмотический дисбаланс, заставляющий в конечном итоге эндосомы разрываться и высвобождать полимер и конъюгированный генетический материал в цитоплазму. Более того, высокий положительный заряд действует как защитный фактор против действия цитоплазматических нуклеаз (Ewe et al., 2016). Интересно, что многие исследования показали обнадеживающие перспективы по использованию PEI in vivo. Напр., в классическом исследовании успешно и безопасно доставлялась ДНК luciferase в головной мозг посредством внутрикортикального и внуть гиппокампа инъекций без осложнений (Abdallah et al., 1996). Затем базирующиеся на PEI вектора были использованы для доставки генетического материала в разные регионы ЦНС, такие как спинной мозг (Shi et al., 2003; Shimamura et al., 2004), кора у мышей, моделирующих ишемию (Oh et al., 2017) и к стволовым клеткам, расположенным в субвентрикулярной зоне (Lemkine et al., 2002). Доставка происходила посредством прямых инъекций в головной мозг, поскольку базирующиеся на PEI вектора, не пересекают BBB (Lungwitz et al., 2005). Недавно базиhe.ob йся на PEI вектор был использован для успешного нарушения регуляции α-synuclein, используя специфические siRNA у крыс, моделирующих болезнь Паркинсона после одной инъекции в желудочки (Helmschrodt et al., 2017).
Чтобы преодолеть потенциально низкую проницаемость BBB, PEI был сцеплен с пептидом из вируса бешенства (RVG), и этот метод был использован для успешной доставки микроРНК в головной мозг in vivo после инъекции в хвост (Hwang et al., 2011). Более того, PEI функционализованный c помощью PEG был использован для доставки плазмид, кодирующих ген CD200 у мышей, моделирующих множественный склероз (CD200 обнаруживал снижение экспрессии в этих условиях). В частности, базирующийся на PEI-носитель, фнкционализованный c помощью PEG, был способен пересекать BBB (Nouri et al., 2017). Удивительно, трансфекция подъязычных двигательных нейронов достигалась c помощью ретроградного аксонального транспорта, сопровождающего инъекции PEI , скомплексованного с ДНК, в язык экспериментальных крыс (Wang et al., 2001).
Несмотря на упомянутый выше успех, дальнейшее использование PEI для трансфекций in vivo были приостановлены из-за относительно высокой токсичности этого полимера и его низкой скорости потребления живыми клетками. Поэтому в последние годы внимание было обращено на менее токсичные полимеры, такие как chitosans. Chitosans являются натуральными полимерами с случайно распределенными β -(1-4)-linked D-glucosamine и N-acetyl-D-glucosamine, они рассматриваются как очень привлекательные векторы для доставки генов in vivo/ В самом деле, chitosans совсем не токсичны в используемых концентрациях и могут эффективно быть функционализованы (Duceppe and Tabrizian, 2010; Ramamoorth and Narvekar, 2015). Напр., PEGylated chitosan полимеры были использованы для доставки siRNA против Galectine-1 и EGFR, двух известных генов, повышающих резистентность клеток глиобластомы к лечению c помощью emozolomide. Доставка, которая была осуществлена c помощью внутри-опухолевых инъекций приводила к увеличению доли выживших животных (Danhier et al., 2015). Хотя базирующийся на chitosan полимеры не могут легко пересекать BBB, эта проблема была решена путем значительной модификации структуры chitosan. В частности, chitosans впервые были триметилированы, давая trimethylated chitosan (TMC), это увеличивало растворимость и связывание siRNA полимером. Впоследствии, PEG был конъюгирован с TMC. Как и в случае с рецепторами для липидов для доставки, добавление PEG повышало био-совместимость и стабильность в сыворотке данной конструкции. После внутривенного введения была осуществлена специфическая доставка Cy5.5-siRNA (Флюоресцентный зонд для визуализации РНК) в головной мозг in vivo путем добавления фрагмента, происходящего из гликопротеина вируса бешенства, к PEG-модифицированному TMC (Gao et al., 2014). Удивительно, базирующиеся на chitosan векторы были использованы для трансфекции HIV-инфицированных астроцитов c помощью siRNA против генов, необходимых для репликации вирусов, успешно останавливая HIV инфекцию. В этом исследовании наночастицы chitosan конъюгировали с антителами, которые д. соединяться строго с рецепторами transferrin в BBB, увеличивая проницаемость векторов в головной мозг (Gu et al., 2017).
Lh/ классом полимеров являются dendrimers, сильно разветвленные синтетические полимеры, которые приобретают популярность в биомед. исследованиях. Интерес к ним в основном обусловлен их хорошо известной структурой и высокой плотностью легко модифицируемых функциональных групп (Hu et al., 2016). Топологически дендримеры состоят из сердцевины и разветвлений, организованных вокруг серцевины, образующих сферическую структуру, которая обычно позитивно заряжена с модифицируемыми функциональными группами на поверхности. Благодаря своей высокой плотности положительных зарядов, dendrimers покидают эндосомы посредством "proton sponge mechanism", сходного с тем, что у PEI-based полимеров (Hu et al., 2016). Среди огромного набора дендримеров наиболее распространен и наиболее охарактеризован polyamidoamine (PAMAM); (Hu et al., 2016;Pack et al., 2005)). PAMAM экстенсивно используется in vitro благодаря низкой ц3итотоксичности (Eichman et al., 2000). Чтобы усилить эффективность переноса генов и био-совместимость, создано множество функционализированных PAMAM; эти функционализации включают замену положительных зарядов аргининовыми группами (Choi et al., 2004), PEG (Luo and Saltzman, 2006; Wang et al., 2009) и pyridine/histidine (Hashemi et al., 2016) и добавление гидрофобных цепочек, включая lauroyl (Santos et al., 2010). Несмотря на это, как положительно заряженная гидрофильная молекула, PAMAM не может пересекать BBB in vivo. Для преодоления этой проблемы PAMAM бы функционализованным c помощью PEG и SRL, небольшого, искусственно созданного пептида, и был способен пересекать BBB. После интернализации c помощью фагоцитов и взаимодействия с низкой плотности липопротеин рецептору родственным белком (LRP) на BBB, PAMAMs, функционализованные c помощью SRL были способны эффективно трансфицировать нейроны in vivo с плазмидной ДНК, кодирующей EGFP после его внутривенного введения в хвост мышей (Zarebkohan et al., 2015). Сходным образом, разные пептиды, которые обнаруживают высокую степень проникновения в головной мозг, такие как angiopep-2 (Ke et al., 2009), lactoferrin (Huang et al., 2008) и transferrin (Huang et al., 2007), были использованы для трансфекции клеток головного мозга in vivo. Поэтому PAMAM потенциально возможен для применения в качестве вектора для доставки генов in vivo.

3. Physical methods for transfection


Физические методы базируются на физической стимуляции доставки и прямого введения генетического материала внутрь живых клеток (Table 2). Физические методы способствуют обратимым альтерациям в плазматической мембране клеток или эндоцитозу, что позволяет непосредственное введение молекул в интересующие клетки или самих по себе или с поддерживающим химическим носителем (Fig. 2). Физические стимуляции могут, по крайней мере, частично преодолевать многие побочные эффекты, связанные с биохимическими или вирусными техниками. В частности, отсутствие токсичности, отсутствие ограничений в длине кодирующих последовательностей и низкая цена являются некоторыми из главных преимуществ. С др. стороны, их использование для генной терапии затрудняется инвазивностью подобных процедур (напр., использование сильных электрических полей и инъекции в желудочки головного мозга) и низкой эффективностью, когда доставка ДНК осуществляется системно (напр., снижается доступность через BBB).

Table 2. Physical methods for transfection.

Fig. 2. Physical methods of gene delivery. Electroporation-mediated gene transfer (left) enables the directional guidance of plasmids carrying the negatively charged DNA of interest towards the positive pole of the electrode. At the same time, electroporation causes destabilization of the structure of the cell membrane, creating temporary pores in its surface and allowing the plasmid to enter the cell. The plasmid is then transported to the nucleus. Sonoporation-mediated gene transfer (middle) occurs by ultrasound application, which promotes destabilization of the cell membrane in the presence of oscillating microbubbles. During this process, the plasmid contained in the microbubble mixture enters the cell and is then transported to the nucleus. Magnet-assisted transfection (right) is mediated by magnetic field oscillations that guide and promote endocytosis of the magnetic carriers with attached DNA. In the cytoplasm of the cell, the endosome undergoes degradation and the released DNA enters the cell nucleus. After DNA transcription, the mRNA exits the nucleus, and it is translated into a protein in the cytoplasm.

Первый успешный перенос in vitro с помощью физической стимуляции осуществлен в 1980 для переноса в клетки глиомы мыши с помощью электропортации. Тот же самый подход использован для in vivo трансфекции в клетки кожи мышей (Titomirov et al., 1991). Спустя годы и др. физические методы были предложены для переноса генов in vivo, включая трансфекцию с помощью магнита (Mah et al., 2002b; Scherer et al., 2002) и ультразвука (Sheyn et al., 2008).

3.1. Electroporation


Техника электропортации уже использовалась in vitro в 1980s (Neumann et al., 1982; Potrykus et al., 1985; Potter, 1988)в качестве острого, быстрого, легкого, очень эффективного, дешевого и в основном не токсического вмешательства для трансфекции бактерий и многих типов клеток и для создания трансгенных растений. Электоропортация делает возможной трансфекцию крупных, сильно заряженных молекул, которые не могут пассивно диффундировать через липофильные клеточные мембраны, путем создания временных заполненных водой полостей в мембранах (20-120 nm в диаметре; (Chang and Reese et al., 1990)) благодаря использованию серии пульсов электрического поля. Более того, использование электрического поля также направляет заряженные молекулы для трансфекции в направлении анодной стороны, тем самым премещая их в направлении области, где находятся интересующие клетки. Как только воздействие электрического поля прекращается, клеточные мембраны реогранизуются благодаря закрытию временных гидрофильных полостей и возвращения их к физиологической форме, так что введенный материал оказывается в клетках как в западне. Недавно техника электропортации разработана для разных применений in vivo (в и ex ovo, в и ex utero, а также в качестве постнатальной электропортации) при этом одним из главных преимуществ становится быстрое начало экспрессии белка, кодируемого трансфицированной ДНК. В целом, все методы in vivo электропортации для ЦНС базируются на одной концепции: раствор ДНК инъецируется в просвет системы желудочков ЦНС. В самом деле, интерфейсом между просветом системы желудочков и головным мозгом является нейроэпителий, где располагаются нейрональные предшественники разных областей головного мозга. Т.о., после воздействия электрического поля, осуществляемого с помощью множественных электродов, негативно заряженная ДНК отравляется в направлении положительно заряженного электрода и инкорпорируется в специфических популяциях клеток нейрональных предшественников. Эти предшественники д. генерировать зарождение новых нейронов, предназначенных для разных областей головного мозга, куда нейроны начинают мигрировать после рождения, осуществляя в конечном счете трансфекцию в дискретные регионы головного мозга.

3.1.1. In utero, exo utero and postnatal electroporation


In vivo электропортация использовалась для переноса генов в 1997 на эмбрионах кур in ovo (Muramatsu et al., 1997). Спустя 4 года проведена трансфекция ЦНС эмбрионов мышей и крыс, используя in utero и exo utero электропортацию (Fukuchi-Shimogori and Grove et al., 2001; Saito and Nakatsuji, 2001; Tabata and Nakajima, 2001).
Техника in utero electroporation (IUE) базируется на прямой инъекции экзогенных нуклеиновых кислот в вентрикулярную систему эмбрионов через стену матки у беременных матерей. Затем воздействовали электрическим полем на нейральные предшественники посредством двух внематочных электродов в виде щипцов, помещаемых по сторонам от головы эмбриона. Поскольку инъекции раствора нуклеиновых кислот через стенку матки не вызывали серьезных повреждений матки, то беременные особи были способны давать потомство. Этот процесс позволяет осуществлять как эмбриональные, так и постнатальные исследования детенышей после электропортации. Достигнута высокая эффективность с двумя стандартными типа щипчиков paddle электродами электропортации в пирамидальный нейроны в соматосенсорный кортекс грызунов (Saito, 2006). SС тех пор, IUE стала золотым стандартом для изучения кортикального развития ex vivo, как анатомическом, так и функциональном уровнях (LoTurco et al., 2009; Tabata and Nakajima, 2008; Taniguchi et al., 2012). Спустя годы исследователи осуществили целенаправленное воздействие на многие др. регионы головного мозга путем изменения просто ориентации электродов. В самом деле, путем наклона биполярных электродов стало возможно целенаправленно воздействовать на зрительную кору (Cang et al., 2005;Mizuno et al., 2007; Saito and Nakatsuji, 2001), гиппокамп (Conrad et al., 2010; Saito and Nakatsuji, 2001; Tomita et al., 2011), обонятельные луковицы (Imamura and Greer et al., 2013), ganglionic eminence (Borrell et al., 2005; Tanaka et al., 2006), таламус (Haddad-Tovolli et al., 2013), гипоталамус (Haddad-Tovolli et al., 2013), средний мозг, amygdala (Remedios et al., 2007; Soma et al., 2009) мозжечок (dal Maschio et al., 2012; Kita et al., 2013; Szczurkowska et al., 2016; Yamada et al., 2014), спинной мозг (Saba et al., 2003) и ствол мозга (David et al., 2014), но с очень высокой степнью изменчивости в эффективности (dal Maschio et al., 2012;Szczurkowska et al., 2016). Недавно добавление третьего электрода к стандартной конфигурации электропортации позволило осуществлять высоко надежную билатеральную трансфекцию гиппокампа; префронтальной, двигательной и зрительной коры и мозжечка (dal Maschio et al., 2012; Szczurkowska et al., 2016, 2013). В частности, хотя трансфекция затрагивает специфические регионы головного мозга и хотя не все клетки в этой области трансфицируются, всё же проведены успешные поведенческие исследования. Напр., животные, трансфицированные in utero с помощью DISC1 cDNA, обнаруживают гиперчувствительность к amphetamine (Vomund et al., 2013), а DCX KO мыши, трасфицированные DCX cDNA, теряют чувствительность в виде эпилептических припадков (Manent et al., 2009). IUE была также использована для изучения психиатрических нарушений, таких как шизофрения, выявили молекулярные пути, приводящие дефициту познавательной способности (Kamiya, 2009; Taniguchi et al., 2012).
Один из возможных вариантов техники IUE - это электропортация exo utero (EUE). В этом случае с помощью хирургического вмешательства эмбрионы удаляются из матки. После инъекции ДНК и воздействия электрического поля с помощью электродов, эмбрионы помещаются назад в брюшную полость матери без зашивания стенки матки. Поскольку EUE гарантирует наилучший доступ к эмбриону, чем IUE, и труднодоступные структуры, такие как ромбэнцефалон (Akamatsu et al., 1999), спинной мозг и каудальная часть заднего мозга (Saba et al., 2003), теперь можно трансфицировать с высокой точностью. Exo utero электропортация в основном используется для изучения пренатальных стадий беременности. Пренатальные исследования возможны только при извлечении электропортированных эмбрионов непосредственно перед рождением (E18.5) с помощью Кесарева сечения и вскармливанием приёмными матерями.
Возможно использование того же самого принципа IUE , чтобы трансфицировать головной мозг животных сразу после рождения, что позволяет изучать постнатальное развитие. При ранней постнатальной электропортации ДНК доставляется в желудочки головного мозга или субвентрикулярную зону, используя stereotactic микроинъектор (Boutin et al., 2008;Chesler et al., 2008), голова животных помещается между пластинками электродов типа шипцов (forceps). Этот процесс делает возможной трансфекцию предшественников, расположенных на латеральной, перегородчатой и дорсальной стенках боковых желудочков, приводя к трансфекции разных типов нейронов обонятельных луковиц (Boutin et al., 2008; Chesler et al., 2008; De Vry et al., 2010; Fernandez et al., 2011; Sonego et al., 2013).
Наконец, у взрослых грызунов (до 3,5 мес. возраста), ДНК может быть инъецирована в желудочки или непосредственно в желательные регионы головного мозга, не нарушая развития головного мозга. В случае электропортации у взрослых электрические пульсовые воздействия могут быть приложимы с помощью стандартных forceps электродов (Chesler et al., 2008; Kitamura et al., 2008), или для более точной электропортации с помощью иглообразных электродов, вводимых непосредственно в желательный регион головного мозга для локального воздействия раствора ДНК (Tanaka et al., 2000; Zhao et al., 2005). Поздняя постнатальная электропортация может использоваться для цнлегаправленного воздействия на dentate gyrus (DG; (De Vry et al., 2010)) и CA1 регион (Tanaka et al., 2000) гиппокампа, на префронтальную кору (Zhao et al., 2005), barrel cortex (Kitamura et al., 2008), и мозжечок (Kitamura et al., 2008).

3.2. Sonoporation


Sonoporation обладает преимуществом, создавая временные поры в клеточных мембранах с помощью ультразвука (US). Воздействие на носители ДНК во время действия US происходит за счет механического стресса, который вызывает эндоцитоз и/или крупные раны мембран, которые позднее закрываются с помощью механизмов репарации, базирующихся на эндогенных пузырьках (Fig. 2; Escoffre et al., 2013). US пульсовые воздействия могут доставлять самих себя, но их доставка в комбинации с локальным воздействием microbubbles повышает эффективность трансфекции (Taniyama and Morishita, 2006). В самом деле, микропузырьки являются заполненными газом структурами (1-8 µm в диаметре), которые могут реагировать ультразвуковые волны путем последовательной экспансии и компрессии (Lentacker et al., 2014), вызывающей их собственные локальные осцилляции вблизи клеточной мембраны и повышающие проницаемость для экзогенного материала l (напр., ДНК ). Более того, физико-химический состав микропузырьков может увеличивать их шансы на соединение или отлавливание ДНК. В частности, наиболее часто используемые микропузырьки состоящие из белков, липидов или полимеров (see chemical methods above). Наиболее подходящим решением для микропузырьков являются катионовые липиды, которые могут легко соединяться с негативно заряженной плазмидной ДНК и лекго разрушаться с помощью US.
Хотя sonoporation является многообещающей техникой, подходящей для переноса генов in vitro (Fischer et al., 2006), её использование in vivo затруднено из-за возможных побочных реакций живой ткани на действие US (напр., повышение температуры и продукция реактивных видов кислорода; Juffermans et al., 2006; Wu, 1998). У эмбрионов или новорожденных мышей ультразвуковое воздействие на головной мозг тем не менее используется для трансфекции плазмидной ДНК в комбинации с микропузырьками. Однако, эффективность трансфекции относительно низкая и 50% инъецированных эмбрионов страдают от гидроцефалии (Endoh et al., 2002). С др. стороны, осуществлен перенос генов в субвентрикулярную зону после инъекций внутрь желудочков у взрослых мышей in vivo (Tan et al., 2016).

3.3. Magnet-assisted transfection


Базирующаяся на магнетизме целенаправленная доставка впервые была описана почти 40 лет тому назад (Widder et al., 1978) как способ использования магнитных микро- и наночастиц для доставки лекарств в кровеносную систему in vivo. Техника заключается в том, что магнитное поле направляет магнитные наночастицы (MNPs), содержащие нуклеиновые кислоты в клетки мишени. MNPs используются в качестве переносчиков они в основном состоят из сердцевины оксида железа (magnetic) с дополнительным органическим и неорганическим покрытием (напр., arabic gum ((Zhang et al., 2009), липосомами (Linemann et al., 2013), полимерами, пептидами и дигандами/рецепторами (Estelrich et al., 2015)). Покрытые MNPs обладают существенными преимуществами (Chatterjee et al., 2001; Estelrich et al., 2015). Более того, благодаря своей положительно заряженной магнитной сердцевине, связывание негативно заряженных молекул (напр., ДНК ) довольно быстрый и легкий процесс. После активации магнитного поля MNPs перемещаются в направлении клеток мишеней. где они подвергаются эндоцитозу или пиноцитозу, что сопровождается высвобождением нуклеиновых кислот, оставляя состав мембран клеток мишеней интактным (Fig. 2).
При исследованиях in vitro magnetofection широко используется благодаря простоте и высокой эффективности (Scherer et al., 2002). Использование магнитного поля вместе с MNPs является многообещающим подходом для переноса генов in vivo благодаря неинвазивной природе, способности направлять ДНК в интересующий регион и низкая токсичность. Несмотря на это magnetofectionв ЦНС всё ещё в зачаточном состоянии. В самом деле, одно сообщение, описывающее MNPs, функционализованные с помощью PEI, которые были использованы на спинном мозге крыс для поясничных intrathecal инъекций (Song et al., 2010), эксперимент оказался недостаточно эффективным из=за дисперсии MNPs в спинно-мозговой жидкости после воздействия магнитного поля. С др. стороны высоко эффективная и продолжительная magnetofection комплексов EYFP channelrhodopsin и MNPs для оптогенного использования в зрительном кортексе крыс in vivo описана для прямой инъекции головного мозга (Soto-Sanchez et al., 2015).

4. Virus-mediated trasduction


Вирусы являются инфекционными агентами, состоящими из белковой капсиды, защищающей их генетический материал и в некоторых случаях липидная оболочка, происходящая из мембраны клетки хозяина, которая защищает капсиду. Вирусы поэтому могут быть классифицированы как голые или покрытые оболочкой, исходя из отсутствия или присутствия липидной структуры, соотв. Все вирусы зависят от клетки хозяина, чтобы успешно реплицироваться: они используют аппарат репликации клетки хозяина и заставляют реплицировать генетический материал вируса. В самом деле, во время лабораторного синтеза вирусных частиц для экспериментального использования, клетки сначала инфицируются с целью синтеза высоких количеств новых вирусных частиц, которые затем очищаются и используются в выоких концентрациях для будущих исследований (Farson et al., 2004). В зависимости от типа вируса, используемого для трансфекции, генетический материал может быть интегрирован в ДНК хозяина или может временно экспрессироваться (Fig. 3, Table 3). Все клетки могут быть инфицированы специфическими вирусами (Koonin et al., 2006), а их капсиды или в некоторых случаях оболочки из белковых последовательностей и формы, которые определяют тип вируса, свойство, наз тропизмом. Поскольку генетический материал, несомый вирусом может быть модифицирован или заменен синтетической конструкцией, поэтому вирусы широко используются в качестве средства для осуществления генетических манипуляций в живых клетках. Интересно, что капсида также может быть искусственно модифицирована и тем самым могут создаваться вирусы с желательным тропизмом для специфического типа клеток (Freire et al., 2015).

Fig. 3. Virus-mediated transduction. A lentivirus (left) can carry RNA inside its capsid. Contact with cell-specific receptors induces the fusion of the capsid with the cell membrane, followed by RNA release. In the cell cytoplasm, the released RNA undergoes reverse transcription, and upon transport to the nucleus, the RNA is integrated with the host DNA. Adenovirus infection (middle left) is mediated by specific receptor binding on the cell membrane, followed by endocytosis. Endosome degradation then results in the release of the virus capsid and lysosomal degradation of the endosome. The released virus capsid binds to the nuclear pore of the infected-cell nucleus, allowing the introduction of the double-stranded DNA inside the nucleus. Adeno-associated virus infection (middle right) is mediated by receptor binding on the host-cell surface and endocytosis. Endosome degradation results in the release of single-stranded DNA. The single-stranded DNA enters the nucleus and undergoes a conversion to double-stranded DNA, which can be either integrated in the host DNA (and later transcribed) or can remain in the host cell nucleus as nonintegrated viral DNA. Herpes simplex virus-mediated gene delivery (right) is the result of receptor binding and fusion of the virus with the cell membrane of the host cell. Inside the cell, the released capsid binds to the nuclear pore and introduces double-stranded DNA into the nucleus to be transcribed. The viral DNA in the host cell nucleus is transcribed into mRNA. The transcribed viral mRNA exits the nucleus, and it is translated into a protein in the cytoplasm of the host cell.

Table 3. Virus-mediated transduction.

Использование вирусных векторов для доставки генов в живые клетки возвращает нас в 1976, когда впервые сегмент ДНК бактериофага lambda был трансфицирован в клетки млекопитающих, используя Simian Virus 40 (SV40) вектор (Goff and Berg, 1976). С тех пор использование вирусов для биологических и биомедицинских исследований выросло многократно и сегодня вирусные векторы являются наиболее мощной техникой для доставки генов. Главными преимуществами использования вирусных векторов является их высокая специфичность относительно определенных типов клеток и высокая эффективность желательной трансфекции. С др. стороны, однажды искусственно измененная вирусная частица очищается. Сегодня доступны легкая и быстра очистка. Однако, этот процесс может иногда повреждать геномный материал (Kay et al., 2001). Более того, размер конструкции лимитирован способностью к упаковке капсиды. Кроме того, вирусы применяются посредством intrathecal или внутрижелудочковых инъекций, которые чрезвычайно инвазивны (Artegiani and Calegari et al., 2013; Kotterman et al., 2015a; Thomas et al., 2003). Наконец, большинство вирусов нуждаются в нескольких днях перед трансдукцией генетического материала, хотя в точности время экспрессии варьирует для каждого типа вируса (напр., herpes simplex достигает пика в 24 ч после инфекции; adeno-associated вирусы нуждаются приблизительно в 3 неделях для достижения пика, хотя экспрессия уже видна вскоре после 24 ч после применения; Penrod et al., 2015; Reimsnider et al., 2007). В отличие от др. методов доставки генов, некоторые вирусные екторы могут приводить к тому, что вирусный генетический материал оказывается стабильно интегрированным в геном хозяина (напр., Herpes Simplex viruses), это делает вирусные векторы особенно пригодными для трансфекции делящихся клеток. С др. стороны интегрированные вирусы может быть вредными, поскольку интеграция может происходить в нежелательных зонах генома, приводя к вредным мутациям, это мешает использованию в биомедицинских исследованиях (Thomas et al., 2003). Напротив, некоторые др. вирусные векторы (напр., аденовирусы), оставляют генетический материал в ядре в виде т.наз эписом. Т.о., не-интегрирующиеся вирусы являются более надежными и большинство пригодно только неделящихся клеток, поскольку не интегрированные плазмиды слишком сильно разводятся в быстро делящихся клетках, чтобы давать необходимый уровень трансфекции (Kotterman et al., 2015a; Thomas et al., 2003).

4.1. Lentiviruses


Лентивирусы являются покрытыми оболочкой вирусами, относящимися к классу ретровирусов (вирусы несущие генетический материал в виде РНК) при этом обладают уникальной характеристикой, т.к. способны инфицировать неделящиеся клетки продолжительное время. Принадлежность е этому классу вирусов, несущих РНК, означает, что эти вирусы базируются на ретротранскрипции, чтобы интегрироваться в генетический материал в геноме хозяина (Fig. 3). Ретротранскрипция использует транскрипцию РНК в ДНК с помощью энзима обратной транскриптазы, кодируемой геномом вируса. Хотя лентивирусы являются эффективными вирусными векторами, используемыми для доставки генов, они исходно произошли от патогенных агентов (т.e., human immunodeficiency virus, HIV). Это препятствует их использованию in vivo из-за риска вызвать сильную иммуногенную реакцию или даже реконверсию в патогенную форму дикого типа (Cockrell and Kafri, 2007; Mah et al., 2002a). Одной из важных ступеней в направлении разработки надежных лентивирусных векторов стала замена белка оболочки патогенного вируса на белок от др. вируса (чаще всего, vesicular stomatitis virus G glycoprotein, VSV-G), который не может успешно мультиплицироваться после инфекции в клетке хозяине и обладает широким тропизмом (Artegiani and Calegari et al., 2013; Mah et al., 2002b). Несмотря на это лентивирусы были успешно использованы для эффективной доставки генов in vivo в течение длительного времени (Bonci et al., 2003; Li et al., 2016; Qiao et al., 2016). В самом деле, базирующийся на HIV VSV-G-псквдотипированные вирусы были использованы впервые в 1996 для стабильной трансфекции полностью дифференцированных нейронов и глиальных клеток и доставляли β-galactosidase в гиппокамп взрослых крыс в течение более 3-х мес. после инокуляции, без каких-либо признаков иммуногенной реакции. Стабильность инфекции зависит от интеграции вирусного генома в генетический материал клетки хозяина (Naldini et al., 1996a, b). Осуществлялись и др. использования в ЦНС и лентивирусные векторы инъецировали в головной мозг и использовали для изучения эффекта изоформ ApoE на отложения амилоидных бляшек у модельных мышей, это позволило определить специфические для эффекты ApoE на скопления амилоида в гиппокампе (Dodart et al., 2005). Более того, модификации оболочки лентивируса делают возможными предпочтительные целенаправленные воздействия на дискретные популяции клеток в ЦНС с высокой гибкостью. Напр., лентивирусы псевдотипированные с модифицированной оболочкой, обладающей anti-GLAST (an astrocyte-specific protein) IgG на своей поверхности, предпочтительно и целенаправлено действовали на астроциты in vivo (Fassler et al., 2013). Интересно, что благодаря своей способности инфицировать полностью дифференцированные клетки, лентивирусы находят широкое применение для изучения и разработки терапии нейродегенеративных болезней, таких как болезнь Паркинсона (Azzouz et al., 2004; Bensadoun et al., 2000; Yin et al., 2017) Алцгеймера (Li et al., 2017; Parsi et al., 2015; Tan et al., 2018) и Гентингтона (Cui et al., 2006; Schwab et al., 2017).

4.2. Adenoviruses


Аденовирусы (ADVs) - это не интегрирующиеся голые вирусы, несущие двунитчатую ДНК. ADVs м. трансфицировать делящиеся и неделящиеся клетки с высокой эффективностью (Mah et al., 2002a). ADVs были успешно использованы in vitro для целенаправленного действия на клетки неокортекса и глии (Morelli et al., 1999;Smith-Arica et al., 2000; Southgate et al., 2008). Несмотря на это их использование in vivo проблематично из-за их высокой вирулентности (Thomas et al., 2003). Чтобы преодолеть эту проблему, ADVs активно искусственно перестраивали последние 35 лет с целью получения не-иммуногенные векторов. Первое поколение модифицированных ADVs имели делетированный вирусный геном, давая дефектные по репликации ADVs; тем не менее эти ADVs всё ещё обладали мощной связанной с Т клетками иммуногенностью. Эти первой генерации вирусы обнаруживали мощную токсичность в ЦНС, вызывая фагоцитоз трансфицированных клеток. Тем не менее использование этих векторов всё ещё приводит к успешному лечению глиом у мышей (Germano et al., 2003; Immonen et al., 2004; Lentz et al., 2012). Благодаря своей способности инфицировать делящиеся клетки дефектные по репликации ADVs были также использованы для трансфицирования нейрональных предшественников в головном мозге взрослых мышей после инъекций в желудочки (Yoon et al., 1996). Значительный шаг в направлении безопасности ADV векторов был сделан с разработкой helper-dependent ADVs (HD-ADV; Thomas et al., 2003). HD-ADVs лишены каких-либо вирусных генов; поэтому необходим др. вирус (helper вирус), чтобы переносить информацию для их репликации во время лабораторных приготовлений вирусов для инфекции. Такая разработка позволила синтезировать вирусные векторы со способностью переносить длинные конструкции (до 30 kB), которые почти полностью лишены вирулентности. Тем не менее практически невозможно полностью устранить helper вирус вовремя лабораторной очистки, хотя сегодня величина загрязнения снижена до более чем 0,1% (Kay et al., 2001). HD-ADV был недавно использован для осуществления манипуляций с ДНК плююрипотентных стволовых клеток и инфицированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS), это открывает перспективны для манипуляций с генами плюрипотентных стволовых клеток для терапии (Mitani, 2014).

4.3. Adeno-associated viruses


Adeno-associated viruses (AAVs) являются вирусами близко родственными ADVs. В самом деле, AAVs были впервые изолированы в1965 в качестве примеси к препаратам ADV (Atchison et al., 1965; Kay et al., 2001). AAVs имеют однонитчатую ДНК (ssDNA) , геном состоит из двух генов, один из которых для их репликации (rep) и один для их энкапсуляции (cap), хотя AAVs не могут реплицировать себя самих. Подобно ADVs, AAVs нуждаются в вирусе помощнике для мультпликации. Геном AAV остается в ядре клетки хозяина в качестве эписомы или с низкой частотой геном AAV стабильно интегрируется в геном хозяина. Дефицит естественной репликации AAVs в отсутствие HV предоставляет им механизм природной безопасности для использования in vivo (Kay et al., 2001; Mah et al., 2002b; Samulski and Muzyczka, 2014; Yan et al., 2005). В самом деле, эти вирусы никогда не были ассоциированы с патологией и они наиболее изученные вирусные векторы для доставки генов in vivo (Mah et al., 2000). Их главным недостатком является их небольшая способность к упаковке (не превышая 5 kb), котораЯ. тем не менее, может быть увеличена с помощью талантливых молекулярно биологических трюков (напр., разделение экспрессируемой плазмиды на два вектора и реконструкция полностью функциональной экспрессионной кассеты после concatemerization эписом в ядре (Thomas et al., 2003)). Пока, AAVs являются предпочтительными для изучения in vivo физиологи головного мозга, поскольку трансфекция может быть стабильной в течение поразительно длительного времени. Более того, разные серотипы AAVs могут обладать разным тропизмом в отношении дискретных клеточных популяций (Burger et al., 2004; Lentz et al., 2012). Напр., инфекция AAV стабильно экспрессируется до 6 мес. в головном мозге крыс (Klein et al., 1999) и дол 6 лет в костном мозге не-человекообразных приматов (Rivera et al., 2005). Более того, благодаря нейротропизму и их способности транспортироваться вдоль аксонов, AAV9 и AAVrh10 может быть использованы для разработки терапевтических подходов по локальной интервенции соединенных с аксонами структур (Choudhury et al., 2016b). Наконец, разные серотипы AAV могут трансфицировать разные типы клеток (напр., астроциты и олигодендроциты) в головном мозге in vivo (Foust et al., 2009; Lawlor et al., 2009). Такая трансфекция достигается путем перемещения случайных кусочков cap гена вместе, чтобы генерировать огромное разнообразие разных cap белков, а затем скрининга на специфический тропизм для разных типов клеток. В самом деле, перетасовка генов с heparin-binding domain (HBD) в индивидуальных гибридных капсидах из разных серотипов AAV (AAV-type 2/type 8/type 9 химера) помогает созданию AAV-DJ-происходящих библиотек вирусных пептидов для клеточно-специфичного тропизма in vivo у мышей (Grimm et al., 2008). Влияние HBD на тропизм вирусов было продемонстрировано с помощью трансдукции в разные ткани, включая головной мозг (Grimm et al., 2008). В частности, перетасовка cap-гена была также использована для получения химерных AAVs с удивительной способностью проходить через судорогами нарушенный BBB у крыс после индукции судорог с помощью kainic кислоты (Gray et al., 2010). Помимо перемешивания касид, плазмиды упаковываются со специфическими промоторами и могут использоваться для достижение клеточной специфичности (see the discussion section for further information about promoters). Интересно, что др. AAV серотипы, введенные внутривенно, неожиданно обнаруживали пересечение даже интактного BBB у молодых и взрослых животных (Bourdenx et al., 2014; Duque et al., 2009; Foust and Kaspar et al., 2009; Foust et al., 2009).

4.4. Herpes simplex viruses


Вирусы простого герпеса (HSVs) являются покрытыми оболочкой вирусами, несущими двунитчатую ДНК в качестве генетического материала. Их геном относительно велик, имеет длину приблизительно в 152 kb и содержит более 80 генов. Поскольку многие из генов не существенны для репликации вирусов, то HSVs могут нести, по крайней мере,30 kb невирусной ДНК, пригодной для экспериментального использования (Kay et al., 2001). Главным преимуществом HSVs является их высокий тропизм к ЦНС (по неизвестной причине, особенно к чувствительным нейронам; Menendez and Carr, 2017) и тот факт, что после инфекции геном HSV в основном остается в латентной форме в виде стабильной циркулярной эписомы в ядре полностью дифференцированных клеток, в течение длительного времени, не вызывая иммуногенной реакции (Lentz et al., 2012). С др. стороны, их чрезвычайно сложная оболочка делает разработку клеточно-специфических HSVs очень затруднительной, хотя псевдотипирование HSV с помощью VSV-G белка может снижать трансфекции вне мишеней in vitro (Andersen et al., 1982). Более того, HSVs всё ещё могут вызывать массивную активацию иммунной системы, начиная репликацию в клетках хозяина. Эта репликация составляет одну из основных проблем по использованию HSV для доставки генов in vivo. Одним из способов избежать само-репликации является делеция некоторого генетического вирусного материала, генерация не реплицирующихся вирусных частиц, что нуждается в соединении из с helper вирусами для их репликации во время приготовления (Kay et al., 2001;Spaete and Frenkel, 1982). С помощью этого процесса, цитотоксичность сильно снижалась и нейроны в культуре оставались стабильно трансфицированными более трех недель (Krisky et al., 1998). Хотя HSVs широко изучались in vivo для лечения глиоблластомы у грызунов (Nakashima et al., 2018; Ning and Wakimoto, 2014; Wollmann et al., 2005), их использование для трансдукции нейронов всё ещё ограничено. Несмотря на это, HSVs уже были использованы для трансфекции striatum (до 7 мес) у крыс. моделирующих болезнь Паркинсона, с помощью генов, необходимых для функционирования допаминергических нейронов, что приводило к значительной нормализации фенотипа (Sun et al., 2003).

5.1. Challenges of in vivo gene delivery to the brain


5.1.1. CNS penetration


Первым затруднением является необходимость прохождения in vivo BBB. В этом отношении огромные успех достигнут в области методов доставки в головной мозг или максимальной проницаемости векоров. Одной из первых и простейших идей стала инъекции ДНК непосредственно в интересующие области головного мозга. Первые исследования в этом направлении осуществлены в конце 1980s и начале 1990s (Breakefield and Geller, 1987), когда разные группы осуществляли генетические манипуляции с инъекциями вирусов непосредственно в сетчатку и головной мозг грызунов (Davidson et al., 1993; Palella et al., 1989; Price et al., 1987). Более того, поддерживаемые с помощью lipofectin трансфекции ДНК, которые преодолевали электростатическое отталкивание ДНК клеточными мембранами, также оказались успешными при прямых инъекциях в головной мозг мышей (Ono et al., 1990). Впоследствии химические полимеры, такие как PEI, были использованы, чтобы непосредственно вводить генетический материал в кору головного мозга, гиппокамп (Abdallah et al., 1996), спинной мозг (Shi et al., 2003) и SVZ (Lemkine et al., 2002) грызунов. Более того, липидные векторы также эффективно инъецировались в желудочки ранних постнатальных мышей (Hassani et al., 2005; Roessler and Davidson et al., 1994) для базовых исследований или глиобластомы грызунов для исследования возможных терапевтических подходов (Cikankowitz et al., 2017; Lagarce and Passirani, 2016; Pulkkanen and Yla-Herttuala, 2005).Сегодня физические методы, такие как IUE и EUE, особенно пригодны для изучения нейрального развития, т.к. ДНК может быть непосредственно инъецирована в крупные желудочки развивающегося эмбриона, а сильные электрические поля могут быть легко использованы для воздействия на головы эмбрионов. В самом деле, эмбрионы не имеют костного черепа, это гарантирует высокую эффективность трансфекции (Saito, 2006; Szczurkowska et al., 2016). Более того, быстрая экспрессия трансфицированного генетического материала после электропортации также вносит вклад в успешность использования этой техники для изучения нейрального развития. С др. стороны, для вирусных векторов, главной стратегии, используемой для доставки в головной мозг, остаются прямые вливания в паренхиму мозга вирусных частиц. В самом деле, инъекции в желудочки требуют в высоких больших количеств вирусного материала в высоких концентрациях, которые трудно получить и очень затратно. Т.о., инъекции вирусов наиболее подходящие для локальной трансфекции в постнатальный и взрослый головной мозг. Более того, в отличие от электропортации, которая затруднительна в случае костного черепа у взрослых животных, небольшие количества вирусных векторов могут быть доставлены прямыми stereotaxic инъекциями в специфические регионы головного мозга взрослых животных с минимальной краниотомией. Важен также тот факт, что эти векторы могут потребовать несколько дней для эффективной экспрессии генетического материала, который они несут.
Поскольку прямые инъекции в головной мозг - особенно, если предназначены для трансляционных приложений - всё ещё инвазивны из-за самой процедуры и риска побочных эффектов хирургического вмешательства, разработаны новые стратегии преодоления BBB. В частности, липиды и полимеры, добавляемые с липидами помощниками, или функционализованные с помощью пептидов, увеличивают их проницаемость в отношении BBB, могут вводиться внутривенно. Напр., dendrimers, PEI и наночастицы функционализуются с помощью PEG и др. органических молекул, что позволяет им пересекать BBB (Zarebkohan et al., 2015). Кроме того, добавление вирусных капсид, искусственно измененных для лучшего проникновения через BBB (Choudhury et al., 2016a, c; Deverman et al., 2016; Zhang et al., 2011). Более того, часть продуцируемых AAV частиц остается ассоциированной с клеточными мембранам (exosome-AAVs). В сравнении с AAVs, exosome-AAVs обладают большей продолжительностью жизни в крови и повышенной проницаемостью BBB (Hudry et al., 2016; Maguire et al., 2012). Альтернативно, наночастицы были сконъюгированы с генетическим материалом и их малые размеры позволяют из прямую внутри-назальную доставку; этот метод гарантирует прямое поступление в головной мозг, поскольку для этого не нужно пересекать BBB (Yadav et al., 2016).

5.1.2. Transfection specificity in the brain


Др. открытый вопрос: способность трансфицировать точно клеточную популяцию среи многих др. Возможность управлять электрическим полем и тем самым направлять ДНК в строго определенном направлении, облегчает трансфекцию дискретных популяций нейральных предшественников в специфических областях головного мозга с помощью IUE и EUE (dal Maschio et al., 2012; Saito, 2006; Saito and Nakatsuji, 2001; Szczurkowska et al., 2016). Тем не менее, хотя этот метод очень подходит для исследований in vivo развития, он менее пригоден для исследований на взрослых животных, где предпочтительнее химические методы или вирусы, которые позволяют подбирать соотв. клеточно-специфические промоторы выше интересующего гена, что позволяет трансфицировать определенные типы клеток (Murlidharan et al., 2014; Ojala et al., 2015). По этой причине были идентифицированы некоторые нейрон- и глия-специфические промоторы и проверена их способность клеточно-специфической трансдукции (Hashimoto et al., 1996; Miura et al., 1990; Morelli et al., 1999; Oellig and Seliger, 1990; Quinn, 1996). Несмотря на это клеточно-специфические промоторы обнаруживают тенденцию быть слишком крупными, чтобы быть упакованными в вирусные векторы и поэтому экспрессия гена более слабая по сравнению с коституитивными вирусными промоторами (напр., CMV; Hioki et al., 2007; Shevtsova et al., 2005). Поэтому были созданы новые, более мелкие гибридные промоторы, способные эффективно индуцировать сильную, специфическую генную экспрессию (Gray et al., 2011; Hioki et al., 2007; Kugler, 2016).

5.1.3. Combinations of the diverse in vivo transfection methods


Для дальнейшего преодоления трудностей, связанных с модуляцией экспрессии генов in vivo в ЦНС в терминах доступности головного мозга, эффективности трансфекции и/или пространственной и временной специфичности, соединяют разные техники доставки. Напр., открытие BBB с помощью сфокусированного US было скомбинировано с системным введением ДНК, связанной с наночастицами, это привело к неинвазивной стратегии для достижения безопасной, крайне локальной, мощной и устойчивой экспрессии трансгена в ЦНС (Mead et al., 2016). Более того, комбинация US с внутривенным введением голых микропузырьков - вместе с голой плазмидной ДНК (Shimamura et al., 2004), AAVs (Hsu et al., 2013;Wang et al., 2017), liposomal-plasmid DNA (Lin et al., 2015), liposome-shRNA-NGR комплексами (Zhao et al., 2018), polyethylene glycol-modified lipid-based пузырьками (Negishi et al., 2015), или с folate-conjugated gene-carrying микропузырьками (Fan et al., 2016) - может вызывать обратимое открытие BBB и может усиливать эффективность трансфекции у грызунов. Более того, наиболее эффективная, специфичная для регионов головного мозга инфекция достигалась путем купирования аденовирусных векторов с обеспечиваемой магнитом трансфекцией в головной мозг эмбрионов грызунов in utero (Hashimoto and Hisano, 2011; Sapet et al., 2012).

5.1.4. Combinations of in vivo transfection methods with newly emerging techniques


Соединение инструментов молекулярной биологии, включая вновь возникшие техники, с техникой доставки генов in vivo также обнаруживает огромный потенциал. Напр., для достижения трансфекции, которая лучше всего подходит по времени и положению, IUE было купировано с системой Cre/loxP в исследованиях развития сетчатки (Matsuda and Cepko et al., 2007), а AAV трансфекция была купирована с системой tetracycline-контролируемой активации транскрипции (tet-on/off) при изучении структуры нервных связей в neostriatum и первичной самотосенсорной коре мышей (Sohn et al., 2017). Более того, как вирусные векторы, так и/или IUE были успешно использованы для внесения оптогенетических белков, хемогенетических рецепторов или сенсоров эл. напряжения в специфических типах клеток, слоях кортекса и областях головного мозга, это позволило исследовать нейральные связи in vivo(Ghitani et al., 2015). Более того, CRISPR-Cas9 технология, которая позволяет редактировать геном, регулируовть и визуализовать (Gilbert et al., 2013; Mali et al., 2013; Qi et al., 2013), была недавно соединена с IUE для изучения роли специфических генов в развитии головного мозга in vivo с помощью нокаута (Chen et al., 2015; Cheng et al., 2016; Kalebic et al., 2016; Rannals et al., 2016a, b; Shinmyo et al., 2016; Straub et al., 2014; Wang, 2018) или knock-in (Tsunekawa et al., 2016). CRISPR-Cas9 технология, соединенная с IUE также позволяет изучать субклеточную локализацию специфических белков путем вставления последовательности для флуоресцентного белка в кодирующий ген (Mikuni et al., 2016). Более того, CRISPR-Cas9, несмотря на свои крупные размеры, может быть упакована в вирусные векторы для доставки in vivo, тем самым делается возможной мощная трансфекция головного мозга взрослых мышей (Chen and Goncalves, 2016; Chew et al., 2016; Ortinski et al., 2017; Schmidt and Grimm, 2015). Интересно, что усиление эффективности редактирования у Cas9 и снижение риска эффектов вне мишени, разные группы тестировали доставку комплекс белок Cas9-guide RNA (gRNA) с помощью nucleofection (Kim et al., 2014; Lin et al., 2014), катионовых липидов (Zuris et al., 2015), липидных наночастиц (Wang et al., 2016; Yu et al., 2016) и проникающих в клетки пептидов (Ramakrishna et al., 2014) в клетках млекопитающих in vitro, тем самым открывается возможность новой стратегии доставки in vivo. В самом деле, комплекс Cas9/gRNA был недавно купирован с IUE для изучения эффекта нокаута Tbr2 в неокортикальных предшественниках мышей (Kalebic et al., 2016) он был инъецирован в гиппокамп, дорсальную часть striatum, первичный соматосенсорный кортекс и первичную зрительную кору мышей с положительным эффектом (Staahl et al., 2017).

5.2. Specific challenges for translational research and possible therapeutic applications


Генотерапия определяется как перенос генетического материала в специфические клетки мишени пациентов с целью предотвратить или устранить определенное болезненное состояние (Mali, 2013). Главной стратегией генотерапии является использование замещение аллеля в клетке, чтобы компенсировать потерю функции гена, замалчивая доминантный мутантный патологический аллель и внося трофические факторы или компенсаторные белки (Choudhury et al., 2016c). Первая доставка генов в головной мозг человека была осуществлена с помощью stereotactic инъекции ретровирус- и ADV-содержащей nuclear-targeted β-galactosidase cDNA 10 пациентам со злокачественной глиомой (Puumalainen et al., 1998). Впервые это исследование оценило осуществимость и безопасность переноса генов с помощью вирусов в глиому человека in vivo и было показан положительный результат (Puumalainen et al., 1998). В последующих клинических испытаниях генотерапия стала возможным способом для клинического вмешательства при некоторых смертельных и тяжело повреждающих состояний (Naldini, 2015). В самом деле, в последние годы достигнут крупный успех в улучшении методов доставки генов и сегодня более 2000 одобренных ген-терапевтических клинических испытаний проводится или готовится во всем мире (http://www.abedia.com/wiley/).
Однако, огромное большинство ген-терапевтических клинических испытаний пока адресованы раковым опухолям (64,5%), при этом нейрологические нарушения составляют только 1.8% от этих исследований (http://www.abedia.com/wiley/). С одной стороны, эта малочисленность возможно из-за того, что нейропатологические механизмы, лежащие в основе некоторых нейрологических нарушений всё ещё изучены плохо. В этом отношении методы in vivo по доставке генов обладают огромным потенциалом для усиления нашего понимания патологии головного мозга. С др. стороны, низкое число клинических испытаний по генотерапии нарушений головного мозга могут быть обусловлены низкой доступностью надежных и эффективных векторов доставки, которые способны пересекать BBB или может быть непосредственно инъецированы в головной мозг без серьёзных осложнений. Тем не менее возрастает превалирование некоторых нейродегенеративных болезней (напр., autism spectrum disorders; Neggers, 2014) и из них (обусловленные увеличением среднего возраста популяции Johnson, 2015), в комбинации с идентификацией четких причинных мутаций и бедностью стандартного фармакологического лечения для этих нарушений головного мозга. Сегодня AAV векторы становятся инструментом выбора для переноса генов in vivo в большинстве клинических испытаний, касающихся головного мозга. Несмотря на это, некоторые AAVs, сегодня тестируtvst на животных моделях? могут эффективно пересекать BBB (Choudhury et al., 2016b, c; Deverman et al., 2016; Zhang et al., 2011), пока же AAVs, используемые в клинических испытаниях оказываются менее проницающими. Поэтому эти AAVs обычно инъецируются непосредственно в паренхиму головного мозга, обеспечивая длительную и относительно безопасную экспрессию (Choudhury et al., 2016c). Напр., исследование в phase I/II тестирует intraputaminal инфузии в головной мозг AAV кодируемой человеческой aromatic L-amino acid decarboxylase в качестве возможного лечения субъектов с болезнью Паркинсона (http://www.abedia.com/wiley/). Интересно, что AAVs недавно были преобразованы так, что способны эффективно трансдуцировать нейральные стволовые клетки (Choudhury et al., 2016b; Kotterman et al., 2015b). Чтобы избежать риска связанных с хирургией побочных явлений при классических паренхимных инъекциях для вирусной доставки, предложен менее инвазивный метод, такой как введение в спинномозговую жидкость посредством intracerebroventricular (ICV) или intrathecal (IT) инъекций (Choudhury et al., 2016c). Тем не менее эти методы, по-видимому, менее эффективны по преодолению BBB и менее надежны из-за активации иммуногенных реакций (Choudhury et al., 2016c).
Несмотря на быстрое увеличение использования вирусов для генетических манипуляций in vivo, они всё ещё имеют недостатки (напр., возможность мутагенеза вследвивен интеграции вирусов в геном хозяина с высоким риском туморогенеза, токсичности и иммуногенности, а также ограниченная геномная вместимость). Поэтому расте интерес к невирус ным векторам (напр., липидам, наночастицам и полимерам). Интересно, что неокторые клинические испытания базируются на использовании lipofection для лечения глиобластомы (http://www.abedia.com/wiley/), и использование US комбинируется с микропузырьками для доставки наночастиц, несущих супрессирующие опухоли miRNA-34a у мышей в качестве нового возможного лечения (Vega et al., 2016). Более того, C2-9r пептид, доставляющий siRNA против α-synuclein (Javed et al., 2016) и US-обеспечиваемая доставка GDNF плазмиды (Fan et al., 2016) или из нанопузырьков, несущих фактор Nrf2 (Long et al., 2017) были недавно протестированы на грызунах в качестве нового подхода для лечения болезни Паркинсона.
Наконец, разработан CRISPR-Cas9 инструмент, который открывает новые пути и возможности для трансфционных исследований и генотерапии. Недавно начато исследование потенциала технологии CRISPR-Cas9 для обнаружения мутаций и коррекции моногенных заболеваний в культивируемых и стволовых клеток in vivo (Maeder and Gersbach, 2016; Prakash et al., 2016). Более того, CRISPR-Cas9 технология была также использована для манипуляций с раковым геномом или эпигеномом для терапии in vivo. Эти изменения включают мутации с потерей или избытком функции в онкогенах, генах супрессоров опухолей и модуляторах клеточной трансформации или реакции на лекарства (Sanchez-Rivera and Jacks, 2015). Тем не менее использование технологии CRISPR-Cas9 в качестве терапевтического подхода к нарушениям головного мозга замедлились частично из-за трудностей доставки крупных объемов (Walters et al., 2015). Получены многообещающие результаты на мышах, моделирующих болезнь Гентингтона, по снижению экспрессии мутантного гена Huntingtin (mHTT) поткм инъекций Cas9 и mHTT-gRNA, упакованных в AAV вектор, в полосатое тело (Yang et al., 2017).

5.3. Concluding remarks


Starting from the first attempts to deliver DNA to the difficult-to-reach brain, much progress has been obtained in terms of the efficiency of transfection, target specificity and safety in the CNS. This issue is of great importance since the basic mechanisms of brain functions are far from being resolved and since most brain disorders are still lacking a cure. In this respect, the currently available variety of delivery methods, which can be chosen to meet different experimental needs, and the continuous effort to find new and/or more efficient and safer ways to perform gene delivery in vivo will possibly aid basic research on animal models and translational attempts. The coupling of different delivery systems, such as chemical, physical and viral methods, together with new technological revolutions, such as optogenetics, chemogenetics and CRISPR-Cas9 technology, will further advance the field to further broaden our understanding of the brain and address several neurological disorders with new possible treatment options.