Посещений:
НАРУШЕНИЯ СПЕКТРА АУТИЗМА



Перспективы генотерапии

Autism spectrum disorder: prospects for treatment using gene therapy
Matthew Benger, Maria Kinali and Nicholas D. Mazarakis
Molecular Autism20189:39 https://doi.org/10.1186/s13229-018-0222-8

Autism spectrum disorder (ASD) is characterised by the concomitant occurrence of impaired social interaction; restricted, perseverative and stereotypical behaviour; and abnormal communication skills. Recent epidemiological studies have reported a dramatic increase in the prevalence of ASD with as many as 1 in every 59 children being diagnosed with ASD. The fact that ASD appears to be principally genetically driven, and may be reversible postnatally, has raised the exciting possibility of using gene therapy as a disease-modifying treatment. Such therapies have already started to seriously impact on human disease and particularly monogenic disorders (e.g. metachromatic leukodystrophy, SMA type 1). In regard to ASD, technical advances in both our capacity to model the disorder in animals and also our ability to deliver genes to the central nervous system (CNS) have led to the first preclinical studies in monogenic ASD, involving both gene replacement and silencing. Furthermore, our increasing awareness and understanding of common dysregulated pathways in ASD have broadened gene therapy's potential scope to include various polygenic ASDs. As this review highlights, despite a number


Рисунки к статье

Нарушения спектра аутизма (ASD) затрагивают ~1.5% популяции [1], это этиологически различающиеся дефициты пластичности познавательной функции приводят к широким нарушениям в общении и ограничиваются повторяющимися поведенческими реакциями [2]. Распространены сочетанные заболевания (~70% случаев) и включают эпилепсию, нарушения внимания, настроения и речи; нарушения сна; проблемы с ЖКТ; и интеллектуальная недееспособность [3].
Несмотря на высокую социологическую цену ASD (оценивается в $2 миллиона на пациента в год [4]), сегодня лишь антипсихотические средства risperidone и aripiprazole разрешены FDA-для лечения ASD, это исключительно воздействие на симптомы возбудимости [5]. Отсутствие болезнь-модифицирующей терапии может быть связано с патогенезом ASD's, это в принципе обусловлено гетерогенностью генетических мутаций и вариантов и модуляциями разнообразных взаимодействий ген-среда, включая и связанные с беременностью факторы (напр. активация материнского иммунитета, материнские токсины) и перинатальные травмы [2, 6-10]. Большинство кодируемых белков, участвующих в патогенезе ASD, такие как цитоскелетные белки, молекулы клеточной адгезии и белки, связывающие ДНК , могут 'не реагировать на лекарства' в виде обычных малых молекул, которые в принципе и модулируют функцию рецепторов и энзимов [11].
Напротив, генотерапия может быть пригодной для репарации, замещения, усиления или замалчивания какого-либо интересующего гена в клетках мишенях [12]. Ещё одним преимуществом генотерапии по сравнению с малыми молекулами является способность вызывать длительно длящийся клинический успех после единственного вмешательства и в принципе контролировать целенаправленное воздействие на клетки посредством модификаций векторов [13].
В самом деле генотерапия уже используется для клинического применения в области нейрологии, так терапия Nusinersen, антисмысловым олигонуклеотидом разрешена при Spinal muscular atrophy (SMA), а недавно и Luxturna, стратегия замещения гена, базирующаяся на вирусах, разрешена при Leber's congenital amaurosis, выступая как первая терапия, модифицирующая обе эти болезни [14, 15]. Кроме того, клинические испытания при SMA агента AveXis, с использованием системной доставки recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9), несущего замену SMN1 гену, недавно продемонстрировало безопасность и эффективность у новорожденных [16]. С др. стороны, генотерапия довольно дорогостоящая, оценивается в $500000 на воздействие и остается неприемлемой во многих системах здравоохранения (see ref [17]).


Genetic targets in ASD


ASD могут быть подразделены на состояния, управляемые одиночным генетическим дефектом (моногенные ASD) , и состояния, управляемые множественными генетическими дефектами (полигенные ASD). Моногенные ASD часто содержат разнообразные кластеры фенотипов, которые включают аутизм как часть синдрома [18]. Пока примерно насчитывается ~5% случаев ASD [18], нарушения при которых являются прямыми кандидатами для генотерапии. Во-первых, они представляются как разработанные генетические модели ASD, которые позволяют выяснять путь от генотипа к фенотипу, потенциал обратимости болезни постнатально и эффективность и токсичность новых терапевтическ4их средств. Во-вторых, коррекция одиночного вызывающего дефект белка имеет потенциал арестовать и возможно обратить вспять патологию болезни. В самом деле, основные исследования по преклинической генотерапии ASD базируются на идентификации природы и функции причинных генов для ряда моногенных состояний с аутистическими признаками, включая Rett syndrome (RS), fragile X syndrome (FXS), Angelman syndrome (AS) и tuberous sclerosis (TSC) [19-23] (Table 1).

Table 1 Genotypic and phenotypic characteristics of monogenic conditions with ASD features 

Monogenic ASD        Mutated gene        Chromosome        Protein function        Autism prevalence        Other characteristics
Fragile X syndrome        FMR1 (encodes FMRP)        X        Binds and transports specific mRNAs from the nucleus to the ribosome [123]
~?30% [124]
Long/narrow face, macroorchidism, long ears and philtrum, mild to moderate intellectual disability, hyperactivity, intellectual disability (ID), seizures
Rett syndrome        MECP2        X        Chromatin modification [125]
~?60% [124]
Microcephaly, breathing irregularities, language deficits, repetitive/stereotyped hand movements, epilepsy, ID
MECP2 duplication syndrome        MECP2        X        Chromatin modification [125]
~?100% [126]
Brachycephaly, spasticity, recurrent respiratory infections, gastrointestinal hypermotility, genitourinary abnormalities, epilepsy, ID
Tuberous sclerosis        TSC1
TSC2        9
16        Inhibition of translation via mTORC1 inhibition [127]
~?50% [124]
Benign tumours in multiple organs, epilepsy
Angelman syndrome        UBE3A        15        Targeting of proteins for destruction via ubiquitin-tagging [41]
~?30% [124]     <\pre> 
 

Cheerful demeanour, microcephaly, epilepsy, speech deficits, sleep disturbance, epilepsy, ID

Abbreviations: FMR1 fragile X mental retardation 1, FMRP fragile X mental retardation
 protein, MECP2methyl-CpG-binding protein 2, TSC1 tuberous sclerosis 1, TSC2 tuberous
  sclerosis 2, UBE3A ubiquitin-protein ligase E3A
Сравнительно недавно наше понимание генетического ландшафта ASD было круто изменено несколькими исследованиями секвенирования целых экзомов и целых геномов, которые идентифицировали сотни de novo и редко наследуемых вариантов, влияющих на риск возникновения спорадических ASD [24-32]. Многие из этих генов, по-видимому, участвуют или непосредственно или косвенно в морфологии и активности синапсов, это привело к концепции ASD как 'synaptopathy' [33, 34] (Fig. 1). Определенно идея использования генотерапии для усиления или ослабления экспрессии белков-мишеней внутри этой сети и 'воскрешения' синапсов является правильной, которая может оказаться применимой к некоторым случаям ASD.

Fig. 1 Proteins known to cause monogenic ASD are shown in red. Some of these, including TSC1/2, directly impact on ribosomal translation via the AKT-mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1) pathway, leading to altered synaptic protein expression and hence altered synaptic function. Others feed into this loop at the level of transcript production (MECP2 [125]) and selection (FMRP [123]) and protein degradation (UBE3A [128], not shown). Many other ASD-linked proteins also act within this synaptopathic loop, including various cell adhesion molecules (e.g. neuroligins [NLGNs], neurexins [NRXNs] [129, 130]), scaffolding proteins (e.g. postsynaptic density protein 95 [PSD95] [131]), cytoskeletal proteins (e.g. disrupted in schizophrenia 1 [DISC1] [132]), receptors (e.g. AMPA, NMDA, mGluR [133, 134]) and DNA-binding proteins (e.g. chromodomain-helicase-DNA-binding protein 8 [CHD8] [135, 136]). The entire rapidly expanding list of over 900 ASD-linked genes can be found at the Simons Foundation Autism Research Initiative (SFARI) database (https://gene.sfari.org/database/human-gene/)

Однако, при таких гетерогенных состояниях, как ASD, важно не зацикливаться на одном причинном механизме, особенно учитывая недавнюю информацию о явных критических ролях иммунной дисфункции и эпигенетики, по крайней мере, для определенных случаев ASD [35, 36]. Более того, недавние клинические испытания фазы II, которые выявили регуляцию синаптической функции посредством модуляции GABA и glutamate рецептора, оказались неспособны продемонстрировать значительное общее улучшение, несмотря на сильные позитивные реакции у определенных пациентов [37, 38]. Т.о., важно учитывать, действительно ли целенаправленное воздействие на синапсы с использованием генотерапии, может быть наиболее подходящим для коррекции особых ASD эндофенотипов в специфических подгруппах пациентов и не быть панацеей для всех ASD.

Modelling ASD in rodents: a platform for proof-of-principle studies


Область генотерапии отягощена примерами терапии, оказавшейся неспособной осуществить надежды преклинических исследований. Во многих случаях вина может быть приписана достоверности предсказаний на базе животных моделей, которые сами зависят от точности воспроизведения болезни (т.е. насколько точно они воспроизводят этиологию болезни) и кажущейся обоснованности (т.к. насколько точно фенотип модели представляет собой нарушение у человека) [39].
Принимая во внимание проблемы клиницистов, связанные с использованием диагностических критериев для ASD [40], и то, как различные общественные черты часто оказываются прирожденными 'человеческими' качествами (хотя это само по себе сильно зависит от контекста[41]), неудивительно, что полученные животные модели ASD с хорошей кажущеёся обоснованностью оказываются ненадежными. Следовательно, всегда необходима осторожность в предположениях относительно поведенческих исходов у животных с аутизмом, разные моногенные ASD модели грызунов способны продемонстрировать поддающиеся количественному измерению социальные и коммуникативные поведенческие признаки [42, 43, 44], лежащие в основе преклинических терапевтических исследований.
В качестве предостережения необходимо отметить, что основное ограничение животных моделей ASD связано с их неспособностью отражать гетерогенные влияния среды на фенотип ASD, при этом различные токсические, воспалительные и психосоциальные факторы трудно вносить в крепкие, воспроизводимые животные модели. Трудно сконструировать работоспособность особенно при моделировании полигенных ASD, при которых взаимодействия ген-среда играют более фундаментальную роль [45], и которые поэтому обладают особым риском для будущих исследований.

Locating and reversing ASD pathophysiology


Идентификация специфических клеток и связей, нарушаемых при ASD, является важным для разработки генотерапии, чтобы вектора могли целенаправленно воздействовать на специфические регионы головного мозга или типы клеток. В частности, получаемые данные подтверждают, что гиппокамп, мозжечок и мозолистое тело содержат ключевые патогенетические связи (circuits) [34, 46-48], тогда как влияние типов клеток распространяется на пирамидальные клетки, клетки Пуркинье и глиальные клетки [34, 49].
Недавние технологии позволяют начать выяснять взаимоотношения между типами клеток со специфическими функциями и определенными ASD эндофенотипами. Напр., в мышиной модели RS, cre/lox-обеспечиваемая делеция MECP2 особенно в глютаматергических нейронах переднего мозга, приводит к частичному болезненному фенотипу, при этом сохраняется дефицит социального поведения и координации движений, но сохраняется двигательная активность и страхами обусловленное обучение [50]. В то время как мыши, моделирующие TSC, обнаруживают химиогенное возбуждение региона Right Crus I (RCrusI) мозжечка - области, которая постоянно изменена в головном мозге при ASD при нейроанатомических и neuroimaging исследованиях [51, 52] - этого достаточно, чтобы специфически устранить социальные нарушения, не меняя повторяющееся или негибкое поведение [53].
Внутри индивидуальных circuits, становится очевидным, что разные ASD мутации могут оказывать противоположные эффекты на синаптическую функцию. Напр., TSC2+/- и FMR1-/y нокауты, по-видимому, обнаруживают противоположные эффекты на mGluR-зависимую long-term depression (LTD) в гиппокампе, тогда как мыши, разводимые с обеими мутациями, уравновешивают др. др. на синаптическом и поведенческом уровнях [54]. Такие данные являются не только примером чрезвычайно гетерогенной природы ASD, но и также подчеркивают необходимость оптимального синаптического контроля и являются первым намеком, что успешная генотерапия д. проходить по узкому терапевтическому натянутому канату между избыточной и недостаточной стимуляцией синаптической передачи.
Дальнейшим важным вопросом является, могут ли аутистические фенотипы быть устранены или сформировавшиеся нейроны фиксированы в ходе развития. Удивительно, ряд исследований на разных животных моделях моногенных ASD, постоянно демонстрирует потенциал устранения возникшей дисфункции нейронов, или после фармакологического воздействия или генетической реактивации молчащих аллелей [55-60]. Эти находки показывают, что постнатально и в самом деле пост-симптоматически, гены могут быть ещё не закреплены и генетическая коррекция с помощью доставки вектора может быть пригодна доя лечения когнитивных нарушений.

Delivering gene therapies to the CNS


Если ASD фенотип обратим скорее, чем фиксирован, то из этого следует, что непрерывная генетическая коррекция обязательна для успешного терапевтического эффекта. Сегодня только система вирусной упаковки обеспечивает эффективную трансдукцию долговременную экспрессию генов in vivo [61] (хотя определенные состояния ASD могут быть пригодны для не-вирусной доставки антисмысловых нуклеиновых кислот).
Из вирусов, которые могут трансдуцировать пост-митотические клетки, rAAVs оказываются принципиальными доставщиками в ЦНС [62]. Это базируется на их относительно низкой иммуногенности (по сравнению с аденовирусами и вирусом герпеса), ограниченной энцефалитической иммунной реакции, их способности персистировать в эписомной форме, пониженном онкогенном потенциале (по сравнению с ретровирусами [63, 64]), и их продукции с высокими титрами [12]. самом деле, вектора rAAV уже используются безопасно в ряде ранних клинических исследований генотерапии ЦНС, при нарушениях в пределах от SMA до идиопатической болезни Альцгеймера [65].
Оптимизация целенаправленного специфического воздействия является критической при максимизации количества трансдуцируемых клеток мишеней и доз и для ограничения токсичности вне мишеней. Существуют два основных способа, при которых пространственная динамика rAAV векторов может быть выверена. Во-первых, свойства самого вектора могут быть модифицированы, чтобы включать капсиды, избирающих определенный тип клеток (напр. AAV9 является особенно нейротропным [66, 67]) и/ или промотор [68].
Во-вторых, могут быть отрегулирован способ доставки. Исторически rAAV вектора вводятся внутрь паренхимы посредством stereotactic инъекций в ЦНС, приводя к высоким локальным концентрациям с ограниченным распрост ранением векторов [69]. Будучи инвазивными (каждая инъекция требует краниотомии), такие локальные методы доставки могут быть использованы для коррекции специфических нарушений ASD circuit, связанных с определенными клиническими эндофенотипами, аналогично недавнему улучшению моторных показателей, наблюдаемых после доставки лентивирусными векторами dopamine-продуцирующего гена в nigrostriatal путь при болезни Паркинсона [70].
Однако, ASD, по-видимому, вызывает глобальные синаптические нарушения и поэтому может быть необходима глобальная генетическая коррекция ЦНС, чтобы полностью обратить когнитивное фенотипическое отклонение [71, 72]. Открытие, что rAAV9 пересекают гемато-энцефалический барьер (BBB) и глобально трансдуцируют нейроны и глиальные клетки ЦНС [73], а недавние производные еще более эффективно преодолевающих BBB rAAVs [74], открывают возможность использования внутривенных инъекций для генотерапии ASD.
Остается посмотреть, однако, действительно ли побочные эффекты, связанные с трансдукцией периферических тканей, а также присутствие нейтрализующих циркулирующих в крови антител (анти-AAV9 антитела присутствуют у 47% людей), может помешать внутривенным инъекциям при разных ASDs [75-77]. Изменения последовательности нуклеиновых кислот в вирусном векторе вне вирусного трансгена - такие как включения 'детерминирующей' последовательности с помощью micro RNAs (miRNAs), экспрессирующиеся специфически в клетках вне мишени [78]- могут перехитрить прежнюю проблему, но использование сильно ограниченного пространства (способность к упаковке у rAAV's ограничена ~5 kb [79]). Эта проблема может быть преодолена путем использования преобразованных rAAV капсид, которые могут обладать более низкой seropravalences нейтрализующих антител [80].
Альтернативная система доставки - это введение под оболочку, которая в принципе обеспечивает (относительно) безопасное использование и и глобальную трасдукцию ЦНС с незначительными периферическими осложнениями и высоким пространственным разрешением, ограничивающим потребную дозу. Однако, существуют противоречивые данные относительно способности введения под оболочку rAAV для эффективной трансдукции областей вне спинного мозга [81], а также их собственной способности избегать периферического вытекания [82] и реакции на нейтрализующие антитела [83, 84]. Конечно, подход с введением AAV9 под оболочку способен обеспечить коррекцию у модели giant axonal neuropathy [85] и запущен в клиническое испытание.

Gene therapy strategies in monogenic ASD




Gene replacement


При ASD нарушениях, вызываемых мутациями потери функции (напр. RS, FXS, TSC), простое замещение гена может восстановить синаптическую функцию [12]. Учитывая ограничения, накладываемые на несовершенную стратегию доставки генов, возникает ключевой вопрос, действительно ли достаточно трансдукции типов клеток мишеней, чтобы достичь фенотипического успеха.
Ободряет то, что ряд исследований с использованием моногенных животных моделей продемонстрировал улучшение поведения после rAAV-доставки замещающего гена. В RS мышиной модели системная доставка rAAV9-MECP2 вектора достаточна для ~10% трансдукции ЦНС (принципиально нейронов), это приводит к умеренному улучшению поведения [86, 87]. Между тем ~6-кратное увеличение дозы вектора, дает ~25% трансдукции ЦНС, приводящее к заметным поведенческим и фенотипическим улучшениям [88]. Наконец, недавно было продемонстрировано, что rAAV-обеспечиваемая доставка даже фрагментированного гена MECP2 (лишенного N- и C- терминальных регионов вместе с центральным доменом) приводя к фенотипическому улучшению у RS мышей, потенциально предоставляя дополнительно пространство для конструкции модификаций с целью трансдукции и экспрессии клеток мишеней [89]. Сходным образом, существенные фенотипические улучшения наблюдались в исследованиях с использованием моделей FXS и TSC после доставки внутрь ЦНС замещающих генов, хотя ни одно из этих исследований не оценивало количественно трансдукцию ЦНС [90- 92].
Несмотря на причину для оптимизма, ни одно из приведенных выше исследований не получило доказательств тотального фенотипического обращения к норме после замещения гена. Такое неполное фенотипическое обращение может быть вторичным в отношении недостаточности трансдукции ЦНС. При RS, напр., ~80% реактивация гена в нервных клетках, по-видимому, достаточна и необходима для тотального фенотипического обращения к норме [56, 93]. Однако, увеличение дозы вектора для усиления трансдукции может нарушать баланс риска связанной с дозой токсичности. Это может возникать вторично из-за экспрессии трансгена клеток вне мишени: напр., специфичная для трансгена печеночная токсичность наблюдается при высоких дозах rAAV9-MECP2 [86, 94], возможно из-за роли MECP2's в метаболизме печени [95].
Токсичность может также возникнуть вторично благодаря супрафизиологической экспрессии в клетках мишенях. Напр., после обеспечиваемой с помощью rAAV доставки FMRP при FXS, возникает токсичность при 2.5-кратном увеличении экспрессии выше уровня дикого типа [96], в то время как удвоение MECP2 приводит к дупликации MECP2 синдрома у самцов [97-99]. Такая токсичность может возникать даже при низком проценте трансдукции из-за неравномерного распределения вектора внутри ЦНС или в случае X-сцепленных нарушений у самок из-за мозаичного паттерна экспрессии в ЦНС, вызываемого случайной инактивацией X [100]. Возможно фрагментированная версия MECP2 промотора, по-видимому, ограничивает экспрессию MECP2 до физиологических уровней у самок мышей дикого типа и MECP2null/x, даже когда доза вектора вызывает ~25% трансдукцию ЦНС [88].
Несмотря на это дальнейшие исследования необходимы, чтобы достичь оптимального баланса между трансдукцией ЦНС и токсичным воздействие на мишени при разных синдромах ASD. Кроме того, будущие исследования по замене генов д. лучше охарактеризовать взаимоотношения между дозой гена и функцией дендритов (которая не оценена ни в одном из исследований).

RNA knockdown


Экспрессия генов может замалчиваться с помощью сиквенс-специфического нокдауна мРНК транскриптов с использованием техники такой, как антисмысловые олигонуклеотиды (ASOs) и short interfering RNAs (siRNAs), которые используются для изощренной специфичности, обеспечиваемой Watson-Crick спариванием оснований, чтобы связывать определенные мРНК транскрипы и предупреждать их трансляцию (детальный механизм см. ref [101]). Эти нуклеиновые кислоты обычно относительно легки для изготовления и могут быть модифицированы, чтобы ограничивать деградацию и воспаление и не нуждаются в вирусных векторах (хотя долговременная экспрессия ASOs возможно д. использовать вирусную доставку коротких шпилечных РНК [shRNAs]) [101, 102]. В самом деле, такие терапевтические вмешательства используются для лечения SMA и клинических испытаний при болезни Гентингтона [103, 104].
Эти техники принципиально пригодны, когда тотальный или частичный нокдаун определенного транскрипта может восстанавливать синаптическую функцию. Напр., при MECP2 duplication синдроме, уменьшение наполовину экспрессии MECP2 восстанавливает клеточную функцию и фенотип постнатально при conditional избыточной экспрессии MECP2 у мышиных моделей [105]. В том же исследовании введение в желудочки головного мозга ASOs (доставка с постоянной скоростью путем насоса) специфически воздействуя на MECP2 ведет к широкому распространению ASO в ЦНС, эффективному нокдауну MECP2 до почти нормального уровня и и существенному фенотипическому возвращению к норме (~10 нед.) [105].
Др. стратегия, при которой замалчивание РНК может использоваться - это knocking down гена, который ингибирует экспрессию гена мишени, т.е снятие ингибирования. Напр., трипликация 15q11-13 ведет к довольно распространенному и высоко проявляющемуся типу аутизма, связанногоa с повышенной экспрессией UBE3A (который функционирует как регулятор транскрипции в дополнение к его функции в качестве ubiquitin ligase) и последующим подавлением Cerebellin 1 Precursor (Cbln1), синапсы организующего белка, в ventral tegmental area (VTA) [106]. Т.о., нокдаун UBE3A может быть использован для существенного восстановления экспрессии Cbln1 в VTA, это, как уже было показано, влияет на фенотипические изменения после cre/lox-обеспечиваемого восстановления в UBE3A-triplicated мышиной модели [106].
Др. применением этой стратегии может быть AS, где длинные не-кодирующий UBE3A антисмысловой транскрипт (UBE3A-AST) вызывает импринтинг отцовского UBE3A аллеля, приводя к тому, что потеря материнского UBE3A аллеля будет давать AS фенотип (ещё один пример того, как генетические дефекты при ASD могут оказаться двунаправленными, с оптимальной экспрессией гена в специфических критических регионах головного мозга). Недавно было продемонстрировано, что одиночная инъекция в желудочки головного мозга резистентного к деградации ASO целенаправленно воздействует на UBE3A-AST у взрослых AS модельных мышей, приводя к специфической и существенной редукции уровня UBE3A-AST, при этом происходит частичное восстановление (~40%) уровней UBE3A по всей ЦНС [107].
Интересно, что в том же исследовании, в то время как устранялся дефицит подвижности, др. поведенческие реакции, такие как боязнь и повторяющиеся поведенческие реакции, нет. В более позднем исследовании с использованием Cre-зависимой реактивации UBE3A у AS модельных мышей, была показана временная зависимость для специфических фенотипических возвращений к норме, при этом страхи и повторяющиеся поведенческие реакции требовали реактивации гена во время раннего развития, при этом двигательная активность могла восстанавливаться у взрослых [108]. Такие временные факторы не были тщательно исследованы при др. моногенных ASDs, но они безусловно важны, если принимать во внимание временные точки пригодного вмешательства у людей.
Наконец, в аналогичном ключе с чрезмерной заменой гена, гипер-нокаут РНК мишени может приводить обратному действию токсичности как в клетках мишенях, так и в клетках, не являющихся мишенями. Более того, и ASOs, и siRNA могут вызывать непредсказуемый нокдаун вне мишени [109]. С этой точки зрения потребность в регулярных введениях внутрь ЦНС ASOs является вторым краем меча при ASD: поскольку, с одной стороны, это менее пригодно, чем одноразовая инъекция вирусного вектора, а с др. стороны, это открывает возможность uptitration дозы и определение оптимального терапевтического уровня.

Gene editing


Одной из чрезвычайно важных разработок последнего времени является генотерапия, делающая возможной сиквенс-специфическое редактирование, это CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9, позволяющая корректировать генетические мутации посредством не-гомологичной рекомбинации (при обеспечении подходящей матрицы) или замалчивание генов посредством не-гомологичного соединения концов [110]. Такая техника должна в целом оказаться восстанавливать генную экспрессию до физиологических уровней в клетках мишенях, устраняя проблемы, связанные с токсичностью трансгена, наблюдаемой как при замещении гена, так и при нокдауне РНК.
К сожалению,, по крайней мере, in vivo, техника редактирования генов всё ещё остается далека от клинического использования, при наличии огромного количества подходов технического преодоления узких мест, включая то, как доставлять системы для редактирования генов в клетки мишени, как повысить эффективность редактирования и как избегать редактирования вне мишеней [111, 112]. Всё же недавняя работа Doudna с сотр. усилила оптимизм в этом отношении, продемонстрировав значительно улучшенное редактирование пост-митотических нейронов в головном мозге взрослых мышей, используя проникающие в клетку пептиды, нагруженные Cas9 рибонуклеопротеиновыми комплексами [113].

Prospects for gene therapy in polygenic ASD


Как уже упоминалось, по сравнению с моногенными ASD, полигенные ASD имеют и значительно большую внешне-средовую компоненту, влияющую на их фенотип [45]. В этом отношении, повреждающие, несинонимные, пост-зиготические мутации в последовательностях целого экзома из самой крупной коллекции трио с ASD были недавно идентифицированы, при этом некоторые из этих генов были особенно часты в отношении экспрессии в amygdala, ключевом регионе головного мозга для социальной адаптации и обучения [114]. Такие факторы, в комбинации с малым количеством и конструкторскими ограничениями животных моделей полигенных ASD, делают их менее ясной мишенью для генотерапии.
Несмотря на удивительный набор редких генетических мутаций, сцепленных с полигенными ASD, важно иметь в виду, что эти мутации, по-видимому, участвуют в регуляции синаптической функции, при этом разные мутации ASD потенциально связаны с аномальными трансляционными сигналами и реакциями (Fig. 1) [34]. Например, у мышей делеция трансляционного репрессора Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 2 (4E-BP2) приводит к избыточной экспрессии NLGN класса клеточных адгезивных молекул [115], мутации которых причинно сцеплены с ASD [46, 116, 117]. Более того, такие делеции приводят к нарушению соотношения возбуждающих и ингибирующих синаптических импульсов, а также к ASD поведенческому фенотипу, который корректируется с помощью нокдауна NLGN1 [115].
Это привело к идее, что многие ASD мутации могут лечиться с помощью тонкой настройки экспрессии влияющих белков, действующих внутри динамических трансляционных петель. Очевидна фундаментальная роль пути PI3K-AKT-mTOR в разных случаях моногенных ASD [118], также как и фенотипическое возвращение к норме, наблюдаемое при использовании малых молекул ингибиторов mTORC1 при пре-клинических исследованиях [119], это указывает на то, что этот путь может быть критической мишенью для генотерапии при некоторых случаях ASD.
Однако, принимая во внимание гетерогенность ASD's опять оказывается важным не концентрироваться близоруко на одном пути. Скорее всего, вместо этого терапевтического подхода 'one size fits all' (один на все размеры) д. иметь место эффект какой-либо определенной ASD мутации на исход трансляции и синаптическую функцию, который д. быть определен, прежде чем решать имеется ли он и как воздействовать на определенный ген или путь. Напр., NLGN3 нокаутные мыши демонстрируют FXS-подобное нарушение mGluR-зависимой синаптической пластичности [120], указывая. что или избыточная экспрессия FMRP или нокдаун пути PI3K-AKT-mTOR (учитывая упомянутое выше противостояние этих двух путей) смогут скорректировать этот фенотип.
Наконец, недавние доказательства показали, что ASD поведение вызывается дефицитом аминокислот [121, 122]. Например, гомозиготная дисфункция BBB solute carrier transporter 7a5 (SLC7A5) и соотв. потеря в ЦНС branched chain amino acids (BCAAs) оказались сцеплены с ASD, это оказалось обратимым у мышиных моделей после введения в ЦНС BCAAs [122]. Т.о., прямое замещение белка может предоставить важные6 дополнительный терапевтический путь при определе6нных случаях ASD. Также возможно представить использование генотерапии в качестве дополнения: напр., комбинацию системного замещения BCAA с доставляемыми с помощью вектора SLC7A5, целенаправленного на клетки BBB.

Conclusions


Given the heritable component of ASD, gene therapy offers a promising alternative to conventional small molecule therapies. Preclinical studies over the last 5 years using animal models displaying autism-like traits have demonstrated that directly altering gene expression using rAAV-delivered transgenes can reverse the behavioural phenotype, either via gene replacement or RNA knockdown. Such studies establish proof-of-concept and set up a platform for clinical translation in various monogenic ASDs, with RS being a frontrunner in this regard.
However, major hurdles remain, not least the fact that the majority of ASD disorders, even monogenic ones, show variable penetrance, with epistatic and gene ? environment interactions determining phenotype. Not only is such genetic and environmental heterogeneity inherently difficult to model, hindering clinical translation, but also in clinical trials that do go ahead, ASD subgroups that benefit from a particular treatment may be lost amongst other unsuitable subgroups. Furthermore, we still do not know whether, or in which cases, epigenetic factors may preclude reversibility in humans. Cyclically, this brings us back to the question of animal models and whether these have sufficient construct validity to actually begin to answer such questions in the first place.
A number of additional questions remain: Firstly, can vector design be optimised to the extent that intravenous delivery achieves sufficient CNS transduction without peripheral toxicity? Secondly, where is the optimum balance between CNS transduction and the risk of on-target transgene-related toxicity for each ASD syndrome? Thirdly, will demonstrations of acceptable levels of CNS toxicity hold when studies commence in larger animal models? Fourthly, is there a time point beyond which some or all autistic features lose their reversibility? Answering these questions will be key to moving ASD gene therapy into clinical trials, and perhaps one day generating a genetic treatment for ASD.