Посещений:
ГЕНОТЕРАПИЯ



Антисмысловые олигонуклеотиды и RNAi воздействия

Antisense oligonucleotides and other genetic therapies made simple
Alexander M Rossor, Mary M Reilly, James N Sleigh
Practical Neurology April 2018 - Volume 18 - 2

Дисфункции одиночных белков вызывают множество генетических нейрологических болезней. Кстати, существует лишь ограниченное лечение для таких моногенных заболеваний, традиционно связанных с модификациями диеты (напр., при phenylketonuria) и низко-молекулярными лекарствами, модулирующими нижестоящие пути (напр., corticosteroids при Duchenne muscular dystrophy). Недавно появилась более эффективная стратегия, чтобы модифицировать болезненные белки путем целенаправленного воздействия на предшественники РНК и ДНК. Генетическая терапия, такая как антисмысловые олигонуклеотиды (ASOs) и RNA interference (RNAi) действет таким способом. Посредством канонического спаривания оснований Watson-Crick (figure 1A), эти лекарственные соединения присоединяются к индивидуальным РНК, чтобы модулировать экспрессию генов и тем самым доступность белка.1 (figure 1B).

Figure 1

From genes to proteins. (A) Genomic DNA has a double helix structure that depends on two antiparallel chains of repeating nucleotides, which are composed of a phosphate group, a sugar called deoxyribose and one of four nitrogenous bases (adenine, A; cytosine, C; guanine, G; thymine, T). The storage of heritable biological information is mediated by Watson-Crick pairing of complementary bases (A to T and C to G) through hydrogen bonding. Amino acids are coded in mRNA by sequences of three bases, referred to as codons. Transcripts can be read in three different frames, but the start codon dictates which frame is chosen. Note that mRNA contains the base uracil (U) in place of thymine, and that individual amino acids are represented here by the three-letter code. The addition or deletion of bases that are not multiples of three will result in a frameshift (eg, frame 1 to frame 2 or 3), whereby all downstream codons are 'out of sync' (deletion not depicted in frame 2 or 3). This eventually leads to a premature stop codon (eg, frame 3), which, if it occurs sufficiently early in the transcript, results in its degradation by a process known as nonsense-mediated decay. (B) Genes are stretches of DNA that contain information for the production of proteins. DNA is transcribed into a complementary molecule called premessenger RNA (pre-mRNA), which contains both protein coding (exons) and non-coding (introns) regions, sandwiched between 5' and 3' untranslated regions, which are integral to gene regulation. Post-transcriptional modifications to pre-mRNA such as 5' capping, removal of introns (splicing) and polyadenylation, result in the production of mature mRNA, which serves as the template for ribosome-dependent protein production.



Types of gene therapy


Генотерапия может быть подразделена на три основные категории:
A. Короткие синтетические нуклеотиды, напр., ASOs и RNAi
Базирующиеся на ASOs и на RNAi терапевтические подходы оба связаны с синтетическими нитями нуклеотидов, которые соединяются с РНК мишенями посредством спаривания основания Watson-Crick, но они отличаются по своему составу и способу действия.
A. ASOs являются однонитчатыми ДНК или РНК последовательностями; RNAi синтезируются и доставляются в виде малых двунитчатых комплексов РНК (figure 2).
B. ASOs действуют разными способами, включая целенаправленное отправление РНК на деградацию, предупреждая трансляцию специфических РНК в белки и изменяя сплайсинг пре-мРНК (figure 2A).
C. RNAi является природным защитным клеточным механизмом против РНК вирусов, с помощью которого чужеродная, двунитчатая (вирусная) молекула РНК идентифицируется и используется как матрица для специфического расщепления комплементарной (вирусной) РНК. Этот клеточный процесс может быть использован для терапии, чтобы ограничивать экспрессию генов путем использования синтетических двунитчатых молекул РНК , которые 'используют' этот механизм для подавления своего транскрипта мишени (т.е. мРНК ) и белка.
B. Вирусом обеспечиваемая генотерапия. Терапия вирусными генами использует способность вирусов проникать в избранную ткань и использовать клеточный аппарат хозяина для транскрипции и трансляции интересующих вирусом доставляемых генов.
C. Genomic DNA editing/engineering. Редактирование генов или преобразование генома, наиболее успешный подход, вкотором используется бактериальная Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 система, применяемая для удаления участков неправильно функционирующей (мутантной) геномной ДНК и замещения их на 'нормальную последовательность. Figure 2

Antisense oligonucleotides (ASOs) vs RNA interference (RNAi). (A) ASOs impact gene expression through three principal mechanisms: (1) RNase H-mediated mRNA degradation, (2) steric block of ribosome binding and (3) splicing modulation. (B) Entry of double-stranded RNA into cells results in RNA-induced silencing complex (RISC)-mediated cleavage of messenger RNA (mRNA) through activation of the RNAi pathway (see main text for details on these mechanisms).



Current challenges to ASO and RNAi therapies


Способность экзогенно доставляемых ASOs и RNAi-based терапии модулировать экспрессию белков известна в лаб. давно. Однако, использование этой возможности в клинике наталкивалось на то, что они деградировались нуклеазами, не пересекали клеточные мембраны из-за их сильного отрицательного заряда и поскольку они запускали иммунную реакцию. Успехи в течение двух последних декад в области доставки и химической структуры ASOs и RNAi помогли преодолеть некоторые из этих препятствий.2

Modifying the chemical structure of ASOs


ASO представляет собой короткую, однонитчатую ДНК или РНК, состоящие из колец сахара с помощью фосфатного остова прикрепленных к одному из 4-х оснований (figure 1A). Модификации или остова, или колец сахаров могут менять чувствительность ASO's к деградации нуклеазами, их прикрепление к плазматическим белкам для поддержания стабильных сывороточных концентраций, их комплементарность к РНК и их способность активировать врожденную иммунную систему.

ASOs mechanisms of action


Degrading RNA


ASOs могут обусловливать направление РНК на деградацию путем рекрутирования фермента RNase H (figure 2A). В нормальных делящихся клетках репликация ДНК зависит от фермента ДНК полимеразы, действие которой нуждается в небольшом эндогенном РНК праймере (т.е. короткой нити из нуклеотидов, комплементарных участку ДНК), чтобы запустить репликацию ДНК. Как только происходит репликация ДНК, то фермент RNase H распознает комплекс ДНК/РНК и теперь деградирует излишний РНК праймер. Базирующиеся на ДНК ASOs этого типа действуют в ядре; здесь они соединяются со своей РНК мишень, воспроизводя комплекс ДНК/РНК, распознаваемый с помощью RNase H, что приводит к деградации мРНК. Это можно использовать для терапии, чтобы предупреждать продукцию токсических белков, таких как мутантный transthyretin при семейной амилоидной полиневропатии.

Blocking protein translation


ASOs, которые не рекрутируют RNase H (напр., morpholino ASOs) могут всё ещё ограничивать трансляцию белков путем соединения с их РНК мишенью и не позволяя прикрепляться к рибосомам (figure 2A).

Modifying RNA splicing


Гены, обладают промоторным регионом (к которому фермент РНК полимераза присоединяется и начинает транскрипцию) и кодирующими сегментами (экзонами), перемежаемые не-кодирующими регионами (интронами) (figure 1B). Транскрипция ДНК продуцирует комплементарную молекулу РНК, наз. пре-мРНК, которая содержит как интроны, так и экзоны. Специфические нуклеотидные последовательности внутри и в окружении границ экзон/интрон, затем рекрутируют факторы сплайсинга, которые облегчают удаление интронных последовательностей (т.е., сплайсинг), продуцируя тем самым зрелую молекулу мРНК, содержащую только необходимые экзоны, готовые к трансляции рибосомами. Возможно создавать ASOs, которые не будут рекрутировать RNase H, соединяющиеся с этими регуляторными последовательностями и изменяющие сплайсинг пре-мРНК (figure 2A).

RNAi mechanism of action: RNA degradation


В отличие от ASOs, базирующаяся на RNAi терапия (eт.е., siRNAs), работает путем привлечения эндогенного RNAi пути, чтобы целенаправленно воздействовать на специфические РНК, направляя их на деградацию, чтобы понизить уровни белка. Когда двунитчатая РНК проникает в клетку, она распознается и расщепляется на короткие фрагменты белком, наз. Dicer (figure 2B), и затем загружается на мультибелковый конгломерат, наз. RNA-induced silencing complex (RISC). RISC присутствует в клетках большинства эукариот и облегчает разделение двух нитей РНК. Как только нити двухнитчатой РНК разделены, одна нить деградирует, тогда как другая ассоциирует с RISC, чтобы действовать в качестве матрицы для RISC-обеспечиваемого расщепления комплементарной РНК, снижая тем самым трансляцию белка.2

ASOs in spinal muscular atrophy


Спинальная мышечная атрофия - это аутосомно рецессивное заболевание, вызываемое низкими уровнями белков жизнеспособности двигательных нейронов (SMN), обусловленных делециями или инактивирующими мутациями в гене SMN1. Человек обладает вторым, почти идентичным геном, наз. SMN2, который отличается только одним нуклеотидом в начале экзона 7, что ослабляет сигнал от сплайс-сайта, это исключает экзон 7 из большинства транскриптов SMN2, вызывая продукцию укороченного, нестабильного белка (наз. SMNΔ7). Тем не менее, SMN2 продуцирует небольшое количество функционального SMN белка, количество которого обратным образом скоррелировано с тяжестью спинальной мышечной атрофии. ASO терапия этого заболевания сфокусирована на коррекции дефекта сплайсинга в SMN2, чтобы продуцировать больше функционального SMN белка.3 Недавно лицензированным лечением спинальной мышечной атрофии стал, nusinersen, это ASO, который соединяется с регуляторной последовательностью в интроне 7 (наз. 'intronic splicing silencer N1' или ISSN1), который обычно супрессирует сплайсинг экзона 7. ASOs, нацеленные на эту последовательность, воздействуют на эту последовательность, потенциально стимулируя включение SMN2 экзона 7, это ведет к повышению концентраций белка SMN (figure 3A).

Figure 3

Examples of antisense oligonucleotide (ASO)-based and RNA interference (RNAi)-based therapies for neurological diseases. (A) Nusinersen is a splice-modifying ASO that targets the ISS-N1 sequence within exon 7 of the survival motor neurone (SMN)2 gene. This masks negative splicing factors, ultimately resulting in greater production of the SMN protein, which is lacking in patients with spinal muscular atrophy. (B) The ASO eteplirsen mediates skipping of exon 51 in the dystrophin gene, DMD, and is therefore only of use to 13% of patients with Duchenne muscular dystrophy. For example, a deletion across exons 49-50 could disrupt the reading frame and thereby create an out-of-frame premature stop codon in exon 51, resulting in the complete absence of dystrophin. Eteplirsen-mediated skipping of exon 51 bypasses the premature stop and restores the reading frame to produce truncated, but functional, dystrophin protein. (C) Patisiran is an RNAi therapy that selectively targets transthyretin (TTR) mRNA for RNA-induced silencing complex (RISC)-mediated degradation via the RNAi pathway. Both healthy and mutated transthyretin transcripts are degraded, resulting in reduced deposition of amyloidogenic TTR protein in familial amyloid polyneuropathy (FAP). An ASO targeting TTR messenger RNA (mRNA) for degradation, inotersen, has also completed phase III clinical trials in FAP. E, exon; I, intron. Adapted from Tosolini and Sleigh.10



ASOs in Duchenne muscular dystrophy


Мышечная дистрофия Дюшена тяжелое, начинающееся в детстве заболевание, возникающее в большинстве случаев в результате делеции в гене дистрофина, DMD. Эти делеции в 79 экзонах DMD часто нарушают рамку считывания (figure 1A), это приводит к возникновению преждевременного стоп-кодона и вызывает полное отсутствие дистрофина (преждевременный стоп-кодон запускает деградацию транскрипта с помощью процеесса, наз. nonsense-mediated decay). Мышечная дистрофия Becker является умеренным заболеванием, вызываемым укорочением дистрофина (обусловленным делециями 'in frame') скорее, чем отсутствием. Доступная стратегия генерации укороченного, но функционального белка дистрофина, связана с пропуском экзонов, чтобы откорректировать нарушения рамки считывания, вызываемые нонсенсными сцепленными с DMD мутациями (которые составляют 83% мутаций при Duchenne muscular dystrophy).4Теоретически, это д. приводить к снижению тяжести мышечной дистрофии Дюшена и к возникновению умеренных отклонений, сходных с мышечной дистрофией Becker. Кстати, ASO терапия, сконцентрирована на пропуске экзона 51 дистрофина, хотя лишь13% пациентов с мышечной дистрофией Дюшена имеет мутации, пригодными для такого лечения. Eteplirsen, базирующийся на morpholino ASO разрешен US Food and Drug Administration для лечения мышечной дистрофии Дюшена в 2016, соединяется с сплайс-сайтом экзон/интрон в начале экзона 51, и приводит к его пропуску и поэтому отсутствует в мРНК дистрофина (figure 3B).

RNAi-mediated and ASO-mediated RNA degradation in familial amyloid polyneuropathy


Семейная амилоидная полиневропатия является аутосомно доминантной болезнью, вызываемой миссенс мутациями в гене transthyretin (TTR), которые делают transthyretin амилоидогенным, что приводит к отложениям TTR амилоида в периферических и автономных нервах, сердце и стекловидном теле глаз. TTR является довольно обширным (redundant) белком, который транспортирует витамин A и небольшое количество thyroxine. Полное отсутствие TTR относительно безвредно, но может вызвать предрасположенность к дефициту витамина A. По этой причине familial amyloid polyneuropathy является привлекательной болезнью для генной терапии, т.к. не нуждается в аллель-специфичных ASOs/RNAi. Patisiran (RNAi) и inotersen (ASO), каждый направляет мРНК transthyretin на деградацию; для обоих завершена phase III клинических испытаний при familial amyloid polyneuropathy и мы ожидаем результатов. Общей целью этих вмешательств является снижение общего уровня TTR (здоровой и мутантной форм) , чтобы уменьшить отложения амилоида (figure 3C).5

Additional methods for optimising ASO/RNAi delivery


Были разработаны наночастицы, которые покрывают негативно заряженные ASO или RNAi, делая возможным пересечение ими клеточной мембраны и тем самым облегчая в дальнейшем доставку ASO/RNAi в клетки мишени.2 Проникающие в клетку пептиды - это обычно малые пептиды из менее 30 аминокислот - могут быть сцеплены с ASOs с целью проведения их через клеточную мембрану в ткани мишени. Гемато-энцефалический барьер представляет существенное затруднение для доставки в ЦНС, это означает, что ранние генерации ASOs, предназначенные для нейрологических болезней, таких как spinal muscular atrophy, нуждались в intrathecal или intraventricular введении; однако, нацеленные на ЦНС стратегии предоставили многообещающие пре-клинические результаты.

Viral gene therapy


Успешная генотерапия нуждается в эффективном, не-токсическом способе доставки трансгена в ткань мишень. Поэтому множество исследований сосредоточено на разработке эффективных вирусных векторов, нацеленных на специфические ткани.6 Напр., лентивирусы (сходные с HIV ретровирусами), аденовирусы и adeno-associated вирусы. Лентивирусы инфицируют клетки и интегрируют сегменты вирусной ДНК в хромосомную ДНК клеток хозяев, это обеспечивает стабильную длительную экспрессию; к сожалению, необходима забота о безопасности, поскольку лентивирусы потенциально могут нарушать функции эндогенных генов . Напротив, аденовирусы и adeno-associated вирусы доставляют генетический материал к клеткам мишеням, но не интегрируют с ДНК в геноме хозяина. В результате возникает более значительное воздействие на нервную ткань и увеличиваются периоды генной экспрессии, adeno-associated вирусы оказываются наиболее многообещающими векторами для генотерапии нейрологических болезней. Исследования по вирусной генотерапии теперь начинают использоваться на пациентах, так недавно было продемонстрировано, что одиночное внутривенное вливание adeno-associated вируса, кодирующего SMN1 ген детям со spinal muscular atrophy приводит к их более продолжительному выживанию и усилению двигательной функции.7
Adeno-associated вирусные вектора ограничены по тотальному количеству ДНК, которое может быть инкорпорировано в вирусную капсиду, обычно 4.5 - 5.5 kb. В случае Duchenne muscular dystrophy, полная дли на мРНК дистрофина составляет 14 kb.

Genome editing


Геномное редактирование позволяет хромосомной ДНК клеток меняться и корректировать лежащие в основе мутации на постоянной основе. Разработаны разные методы геномного редактирования (напр., zinc finger nucleases and transcription activator-like effector nucleases (TALENs)); однако, система CRISPR/Cas9 выступает как наиболее всесторонняя и простая в использовании. CRISPR/Cas9 является интегральной частью бактериальной защитной системы, предназначенной для идентификации и деградации чужеродных фрагментов ДНК, вносимых вирусами. Ведомые специфическими нуклеотидными последовательностями в малой РНК, Cas9 является эндонуклеазой, кодируемой с помощью CRISPR-associated (CAS) гена, которая разрезает нити ДНК. Регион между двумя специфическими разрезами может быть замещен с использованием матрицы ДНК, гомологичной региону, на который воздействует Cas, это делает возможным удаление мутации и замещение нормальной последовательностью. Использование CRISPR/Cas9 системы в клетках млекопитающих предоставляет инструмент для точного преобразования генома с огромным потенциалом для будущего клинического использования8; однако, существуют определенные ограничения, включая побочные генетические модификации и суб-оптимальную интеграцию матричной ДНК.