В то время, как гаплонедостаточность можно лечить обычным замещением гена, болезни, сцепленные с избыточностью функции или токсическими эффектами существенных белков нуждаются в целенаправленном воздействии на мутантный аллель. Мутантный аллель может быть или инактивирован, приводя к гаплонедостаточности, или откорректирован, чтобы вернуться к дикому генотипу (WT). В случает генов, участвующих в возникновении болезни, важных для клеточных функций, аллель-специфическая коррекция д. быть преимущественно лишена вредных эффектов, обусловленных общим снижением экспрессии белка.

Аллель-специфическая инактивация генов может быть достигнута посредством замалчивания гена с помощью shRNA1 или анти-смысловых нуклеотидов, приводя к гаплонедостаточности. Коррекция мутаций может быть достигнута на уровне РНК с помощью транс-сплайсинга,^{2, 3} хотя аллель-специфическое целенаправленное воздействие всё ещё затруднительно с помощью этой стратегии. Наиболее продвинутым подходом могла бы стать целенаправленное воздействие на мутации на уровне ДНК. Редактирование генома использует программируемые нуклеазы, ставшие мощным инструментом для целенаправленного воздействия на специфические последовательности. Система clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-related CRISPR-associated protein 9 (Cas9) наиболее широко используемый инструмент для инактивации гена или его точной коррекции посредством homology-directed repair (HDR) с помощью матрицы для репарации ДНК.⁵ Monteys et al.⁶ оценивали специфичность базирующихся на CRISPR/Cas9 в цис-положении SNPs, которые формируют protospacer adjacent motif (PAM) на мутантном аллеле гена huntingtin в фибробластах пациентов, а Yamamoto et al.⁷ оценивали специфичность целенаправленного воздействия CRISPR/Cas9 на гетерозиготную единичную точечную мутацию в гене CALM2 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека. В обеих работах специфически изменяли мутантный аллель с помощью NHEJ, но не сообщалось о аллель-специфической коррекции. Аллель-специфическая коррекция при доминантных заболеваниях достигалась после интеграции кассеты резистентности к антибиотикам, способствующей селекции исправленного аллеля⁸

В качестве примера тестирования аллель-специфического редактирования генома без интеграции селекционной кассеты, которая может влиять на структуру генома или регуляцию, мы сфокусировались на доминантной форме centronuclear myopathy (CNM). CNMs являются редкими мышечными нарушениями, относящимися к группе врожденных миопатий. Описано несколько форм этой болезни с разной тяжестью.⁹ Аутосомно доминантная форма характеризуется началом от рождения или у взрослых, мышечной слабостью и задержкой развития двигательной активности. Аутосомно доминантная CNM вызывается гетерозиготными мутациями в гене DNM2, кодирующем фермент Dynamin 2 (DNM2) GTPase.^{10, 11} Точечная мутация DNM2 R465W представляет собой наиболее частую мутацию, возникающую приблизительно у 1 из 4-х пациентов.¹² A knock-in (KI) мышиная модель с этой мутацией обнаруживает возникновение прогрессирующей мышечной слабости со снижением мышечной силы и гистологическими признаками, включая уменьшение мышечных волокон и центральное накопление оксидативного окрашивания.¹³ In vitro, DNM2-CNM мутации усиливают активность GTPase и способствуют олигомеризации, подтверждая патогенетический механизм за счет избыточности функции.^{14, 15} Однако, эта гипотеза избыточной функции была полностью подтверждена на клеточном уровне. DNM2 является повсеместной GTPase, участвующей в расщеплении эндоцитотических пузырьков во время клатрином-обеспечиваемого эндоцитоза,¹⁶ регуляции цитоскелетных взаимодействий^17-19 и аутофагии.²⁰ Описанные альтерации потребления transferrin или EGFR в клетках, экспрессирующих разные мутации DNM2, подтверждают дефект эндоцитоза.^21-23 В мышиных эмбриональных фибробластах (MEFs), несущих мутацию DNM2 R465W в гомозиготном состоянии, дефекты аутофагии также были описаны.²⁴ Однако, клеточный патологический механизм болезни всё ещё неясен. Кстати, отсутствует специфическое лечение аутосомно доминантной формы CNM, а потенциал CRISPR/Cas9 для лечения доминантных наследуемых болезней пока ещё не использован.

В данном исследовании мы тестировали аллель-специфическую инактивацию или коррекцию гетерозиготных мутаций в гене Dynamin 2 (DNM2), вызывающем аутосомно доминантную форму CNMs. Укороченная единственная гид РНК, воздействующая специфически на мутантный аллель, тестировалась на клетках, происходящих от мышиных моделей и пациентов. мутантный аллель подвергался успешному целенаправленному воздействию в фибробластах пациентов и в миобластах Dnm^2R465W/+ мышей, и в клонах, полученных после точной геномной коррекции или инактивации. Dnm^2R465W/+ миобласты обнаруживали альтерации в потреблении transferrin и в аутофагии. Специфическая инактивация или коррекция мутантного аллеля устраняли этот фенотип. Эти находки иллюстрируют потенциал CRISPR/Cas9 в целенаправленном воздействии и коррекции аллель-специфическим образом гетерозиготных точковых мутаций, приводящих к эффекту избыточной функции, и к исправлению аутосомно доминантных связанных с CNM фенотипов. Эта стратегия может быть пригодной для большого количества болезней, вызываемых зародышевыми или соматическими мутациями, приводящими к избыточной функции.