Итак, использование факторов роста является новой стратегией для защиты нейронов сетчатки. Принимая во внимание чрезвычайную изменчивость лежащих в основе генетических причин болезней сетчатки, независимые от мутаций стратегии, такие как neuroprotection, могут служить универсальным подходом для удержания или замедления потерм ретинальных клеток. Этот подход базируется на секретируемых белках и поэтому нейротропная генотерапия не требует доставки специфических типов клеток. Всё же целенаправленное воздействие на жизнеспособность Müller клеток скорее, чем потеря трансгенов в погибающих нейронах сетчатки, может заметно увеличить жизнеспособность сетчатки. Интерсно, что добавление комбинации разных нейротрофных факторов может обеспечить даже большую пользу для жизнеспособности RGCs [133]. Кроме того, при болезнях, при которых лежащие в основе генетические причины идентифицированы, доставка нейротрофных факторов может усиливать стратегии замещения генов. Напр., эта комбинация рассмотрена Buch et al., которые наблюдали увеличение жизнеспособности фоторецепторов, когда AAV-обусловленная экспрессия GDNF купироваана с замещением гена Prph2 у животных, моделирующих Prph2Rd2/Rd2 врожденную дегенерацию сетчатки [107]. Эта стратегия, при которой добавляли два вирусных вектора одновременно, один для замещения гена в фоторецепторах и один для секреции нейротрофных факторов в Müller клетках, подчеркивая важность избирательного возщдействия на Müller клетки секреции нейротрофного фактора. В самом деле, при индукции GDNF-секреции в Müller клетках, ни фоторецепторная machinery, ни энергия не влияли на секрецию нейротрофного фактора, облегчая тем самым регенерацию фоторецепторов [81].

Однако, необходимо преодолеть некоторые препятствия, прежде чем вектором-обусловленная нейропротекция сможет быть перенсена в клинику. Во-первых, каждый определенный фактор д. быть дозирован оптимально, чтобы опеспечить оптимальную защиту от дегенерации. В этом отношенииостается неизвестным действительно ли данные, связаные с продолжительностью восстановления у модельных грызунов могут быть экстраполированы на болезни человека. Др. важный вопрос связан с продолжительностью терапии, поскольку неясно, в какой момент времени прогрессирующей болезни сетчатки, нейрозащита может быть наиболее занчимой. Наконец, возможны (побочные) эффекты от устойчивой на высоком уровне экспрессии нейротрофного фактора в глазах. Использование вирусных векторов, содержащих индуцибельные промоторы, или использование не вирусных poly-(p)DNA или мРНК стратегий для индукции экспрессии белка во время ограниченного временного периода , возможно сможет решить некоторые из вопросов.

Одной из наиболее интригующих функций Müller клеток их роль в регенерации сетчатки. Наблюдения, что Müller клетки для обеспечения регенерации обладают свойствами стволовых клеток сделало их мишенью для эндогенной репарации сетчатки [134].

В отличие от большинства типов клеток в теле человека, дифференцированные ретинальные нейроны не обладают способностью повторно вступать в клеточный цикл и делиться. При травматических повреждениях и болезнях, приводящих к гибели клеток сетчатки, потеря нейронов в поврежденных областях не замещается спонтанно и апоптоз в конечном счете приводит к потере зрения. Однако, это наблюдается не у всех видов. Teleost рыб, таких как рыбки данио, существует удивительная врожденная способность регенерировать ткани сетчатки и устранять повреждения зрения^135-137. Источником такой регенерации оказалась группа пролиферирующих клеток, мигрирующих из внутреннего (INL) в наружный ядерный слой (ONL), где они продолжают делиться и генерировать новые фоторецепторы палочки^{138, 139}. Первоначально предплагали, что эти кластеры возникают из предшественников палочек^{140, 141}, но наблюдения, что пролиферация INL клеток предшествует регенерации и что Müller ядра, которые располагаются в INL, также пролиферируют и мигрируют в пустые пространства, лишенные фоторецепторов после повреждений, подтвердили, что Müller глия служит альтернативным источником регенеративных предшественников [142]. Наконец, разные исследования с использованием трансгенных рыбок данио, в которых отслеживалась судьба GFP-нагруженных Müller клеток вскоре после повреждений сетчатки, позволили подтвердить, что Müller cells for regeneration глия является источником этих предшественников^143-145. Используя системы кондиционной экспрессии, позволяющей постоянно метить происходщие из Müller глии предшественники, Ramachandran et al. продемонстрировали, что эти предшественники ответственны за регенерацию всех типов клеток сетчатки, которые стабильно интегрируются в ретинальные структуры [146].

Несмотря на существенное сходство между сетчаткой рыбок данио и млекопитающих, Müller глия не реагирует на повреждения дедифференцировкой. Вместо этого они подвергаются реактивному глиозу, который часто сопровождается клеточной пролиферацией и образованием рубцов (see earlier), и неспособны инициировать регенерацию [7]. Тем не менее эта реакция на повреждения вместе с их способностью активировать гены, ассоциированные с ретинальными стволовыми клетками, показывают, что Müller клетки млекопитающих может быть стимулированы к приобретению состояний, подобных стволовым клеткам, и генерировать ретинальные нейроны при соотв. условиях. М клетки грызунов и людей, как было установлено, генерируют как глиальные клетки, так и нейроны in vitro^147-150. Rf Müller клетки потеряли свою способность использовать нейрогенный потенциал после повреждения шм, остается злободневным вопросом. Однако, если бы можно было открыть этот ограниченный регенеративный потенциал Müller глии млекопитающих и воспроизвести способность к самоизлечению, то стало бы возможным восстанавливать сетчатку людей после повреждений и восстанавливать зрение при болезнях дегенерации сетчатки. Кроме того, использование эндогенных Müller клеток, чтобы способствовать регенерации нейронов, избежало бы множественных рисков, связанных с трансплантациями экзогенных клеток и протезов, таких как иммунное отторжение, потенциальнрые этические возражения и возникновение опухолей [151]. С этой целью некоторые группы исследователей использовали рыбок данио в качестве модели, чтобы лучше понять факторы, контролирующие регенерацию сетчатки.

У рыбок данио репрограммирование Müller глии отвечает за регенерацию сетчатки при разных случаях повреждений сетчатки экспозицией света [145], химическими препаратами [152] и механическими повреждениями [143]. После повреждения сетчатки Müller глия дедифференцируется, мигрирует в направлении ONL и подвергается одиночным асимметричным само-обновляющим делениям, которые сохраняют клетки Müller глии, с одной стороны, и продуцируют мультипотентные клетки предшественники, с др. стороны [153]. Эти клетки предшественники пролиферируют, чтобы сформировать кластеры нейральных предшественников, которые мигрируют вдоль радиальных отросков дочерних Müller клеток к поврежденному слою сетчатки, где они выходят из клеточного цикла и могут дифференцироваться во все основные типы клеток сетчатки^{54, 134} (Fig. 2).



Figure 2. Retinal regeneration in zebrafish. Adult M?ller glia (purple) respond to retinal injury with a gliotic response, accompanied by a reprogramming event in which they adopt retinal stem cell properties (yellow). The nuclei of the reprogrammed M?ller glia migrate from the inner nuclear layer (INL) to the outer nuclear layer (ONL), where they divide asymmetrically and subsequently return to the INL, a process called interkinetic nuclear migration. This asymmetric division results in the formation of a multipotent progenitor, which amplifies to create a small population of progenitors capable of the regeneration of all major retinal neuron types. Key: 1, ganglion cell; 2, rod; 3, cone; 4, amacrine cell; 5, horizontal cell; 6, bipolar cell. Modified from 53, 54.

Хотя дальнейшие работы необходимы, чтобы пролить больше света на на молекулярные механизмы, происходящие во время репрограммирования Müller глии у рыбок данио, некоторые белки и сигнальные пути, участвующие в этом процессе, были идентифицированы [54]). Дальнейшие исследования теперь сфокусированы на том, как эти белки могут быть использованы, чтобы сделасть сетчатку млекопитающих способной к регенерации in vivo (Table 2). первые исследования пытались стимулировать пролиферетивные и нейрогенные свойства Müller клеток млекопитающих за счет простой индукции повреждений сетчатки. В 2004, Ooto and colleagues продемонстрировали, что NMDA нейротоксичность RGCs в сетчатке взрослых крыс заставляет небольшие количестваMüller глии пролиферировать и продуцировать новые клетки с маркерами дифференцировки ранних биполярных нейронов и фоторецепторов палочек [154]. Сходным образом, N-methyl-N-nitrosourea (MNU)-индуцированная дегенерация фоторецептопров, как было установлено, инициирует пролиферацию Müller глии у грызунов, что ассоциирует с редкими событиями экспрессии rhodopsin, указывая на регенерацию фоторецепторов [155]. Однако, эта концепция недавно поставлена под сомнеение Kugler et al., которые продемонстрировали, что NMDA-индуцированные excitotoxic повреждения сетчатки грызунов не вызывают дедифференцировку Müller клеток [156]. Сходные наблюдения были описаны др. исследовательской группой, использовавшей экспозицию светом для индукции повреждений нейронов в отсутствии заметной пролиферации Müller клеток [157]. Эти авт. установили, что bromodeoxyuridine (BrdU) был совместно локализован с DNA Ligase IV, маркером репарации ДНК. Это указывает на то, что BrdU, a nucleoside обычно используемый для детекции пролиферации, инкорпорируется в клетки из-за начинающейся репарации ДНК, это не сопровождается пролиферациeй клеток. Тем не менее, NMDA- или MNU-индуцированные повреждения в комбинации с повышенными уровнями ключевых сигнальных факторов, таких как sonic hedgehog (Shh) [158], Wingless/Integrated (Wnt) [159] и achaete-scute homolog 1 (Ascl1)^{160, 161}, или в комбинации с воздействием факторов роста [162] указывают на возникновение способности Müller глии пролиферировать и регенерировать нейроны в сетчатке грызунов. В самом деле, внутриглазные инъекции NMDA, сопрвождаемые одиночной инъекцией epidermal growth factor (EGF), как было установлено, являются многообещающим методом регенрации Müller глии [162]. Экспрессия рецептора EGF в Müller глие постепенно снижается по мере созревания сетчатки, но усиливается после повреждения сетчатки. Стимуляция этрого рецептора с помощью воздействия EGF после повреждения способствует пролиферации Müller клеток и активирует генов предшественников, подобно тому, как это просиходит при регенерации сетчатки у не млекопитающих. Это контрастирует с повреждениями или инъекциями EGF самим по себе, которые оказались неспособны индуцировать пролиферативную реакцию в сетчатке мыши [162]. Фактор, который не активируется после NMDA-индуцированных повреждений, но, как было ранее установлено, необходим для репрограммирования и пролиферации у рыбок данио, это транскрипция пронейрального Ascl1^163-165. У рыбок данио Ascl1 активируется в пролиферирующей Müller глие в течение 6 ч после повреждения сетчатки^{163, 164} а его ингибирование ограничивает дедифференцировку Müller глии [164]. Один из механизмов, с помощью которого Ascl1 влияет на регенерацию сетчатки описан Ramachandran et al., которые продемонстировали, что Ascl1 необходим для экспрессии Lin28, плюрипотентного мРНК-связывающего белка, экспрессирующегося на высоком уровне в эмбриональных стволовых клетках. Авт. продемонстрировали, что Ascl1-зависимая индукция Lin-28 поддерживает дедифференцировку Müller глии частично за счет понижения уровней let-7 miRNA, тем самым репрессию мРНК, важной для дедифференцировки Müller глии [163]. Отсутствие активации Ascl1 в сетчатке млекопитающих после повреждения привело к гипотезе, что путь Ascl1/Lin28/Let7 может диктовать различия в потенциале регенерации между Müller глией млекопитающих и Müller глией др. видов. В самом деле, Pollak et al. показали, что вирусом обусловленная избыточная экспрессия Ascl1 активирует нейрогенную программу в поврежденной Müller глие мышей в культуре и постнатальных эксплантах сетчатки и стимулирует генерацию клеток, экспрессирующих специфические для подтипов сетчатки маркеры и обладающих характерной для нейронов физиологическими реакциями. Хотя Ascl1 управляет экспрессией ранних маркеров большинства ретинальных нейронов, поздние маркеры оказывались более ограниченными биполярными нейронами [166]. та же группа исследователей затем продемонстрировала, что форсированная экспрессия Ascl1 в мышиной Müller глие in vivo способствует пролиферации и используется амакринрными клетками, биполярными клетками и фоторецепторами после повреждений сетчатки [160]. Однако, этот потенциал регенерации, как было установлено, зависит от возраста животных^{160, 167}. Репрограммирование Müller глии с помощью Ascl1 использует ремоделирование хроматина промоторов генов предшественников от репрессированного состояния к активной конфигурации [166]. Принимая во внимание, что доступносвть хроматина ограничека у взрослых, зрелая мышиная Müller глия теряет свою нейрогенную способность, несмотря на избыточную экспрессию Ascl1 [160]. Несмотря на это исследовательская группа Reh недавно сообщила, что избыточная экспрессия Ascl1, купированая с действием histone deacetylase inhibitor, может обойти это ограничение и позволяет взрослым мышам генерировать нейроны внутренней сетчатки из Müller глии после повреждения сетчатки [161]. Кроме того, эти регенерированные нейроны экспрессируют маркеры нейронов внутренней сетчатки, интегрируются в нейрональный circuit, и, как было установлено, реагируют на свет. Это указывает на то, что хотя нейрогенез всё ещё ограничен, вновь сформированные нейроны являются функциональными и могут восстанавливать зрение.

Table 2. Müller cell regeneration in the mammalian retina in vivo

Помимо активации экспрессии lin28, Ascl1 также вносит вклад в репрограммирование Müller кллеток путем регуляции передачи сигналов Wnt и её нижестоящей мишени β-catenin, lh/ крупного пути в регенеративной реакциип у рыбок данио [168]. После повреждения сетчатки рыбок данио этот путь активируется в предшественниках, происходящих из Müller клеток, и контролирует их пролиферацию [165]. Установлено, что Asc1 супрессирует экспрессию Dkk, ингибюитора передачи сигналов Wnt, усиливая тем самым экспрессию Wnt генов, тогда как Wnt, в свою очередь, индуцирует экспрессию Asc1 в активированных Müller клетках [165]. Также в сетчатке мышей, Osakada et al. ранее показали, что передача сигналов Wnt/ β-catenin участвует в пролиферации небольшой фракции Müller клеток, которая появляется после повреждения, которая может далее увеличиваться с помощью добавления агонистов Wnt рецепторов [159].

В то время как поврежденная сетчатка млекопитающих в отдельности или в комбинации в ростовыми и сигнальными факторами, стимулирует пролиферацию Müller глии и приводит к ограниченному нейрогенезу, такое повреждение неизбежно вызывает клеточную гибель, которая неблагоприятна и контрпродуктинва регенерации. Поэтому, стратегия без травм, которая не требует дальнейшего повреждения пораженной сетчатки, была бы предпочтительной. Поэтому, стратегия без травм, которая не потребует дальнейшего повреждения пораженной сетчатки, была бы предпочтительной. Удивительно, субретинальная доставка субтоксических доз glutamate также стимулирует Поэтому, стратегия без травм, которая не потребует дальнейшего повреждения пораженной сетчатки, была бы предпочтительной. Удивительно, субретинальная доставка глютамата также стимулирует Müller глию к повторному вступлению в клеточный цикл и индукции редкой популяции, способной к регенерации без возникновения повреждений сетчатки [169]. Сходным образом, Del Debbio et al. продемонстрировали, что стимуляция передачи сигналов Wnt и Notch у крыс, моделирующих дегенерацию фоторецепторов, приводит к активации Müller глии, которая обнаруживает экспрессию специфических для фоторецепторов палочек маркеров в дегенерирующих наружных ядерных слоях и достоверное временное улучшение восприятия света [170]. Хотя существует строгая корреляция между улучшением восприятия света и количеством активируемой Müller глии, экспрессирующей opsin, авт. оказались неспособны исключить, что это функциональное улучшение (частично) обусловлено жизнеспособностью фоторецепторов хозяина. Более прямыи доказательством является будет подтверждение функциональности этих клеток. В этом исследовании метод двухструпенчатого перепрограммирования использован, чтобы сначала активровать Müller глию с помощью инъекций в стекловидное тело Wntb2 (активирующего Wnt) и Jag1 (активрующего передачу сигналов Notch), а затем инъекция Shh и DAPT (ингибирующих Notch), чтобы способствовать дифференцировке флторецепторов палочек. Недавно сходный подход был опубликован группой Bo Chen, которая предоставила доказательства, что без повреждения, избирательный перенос гена β-catenin в Müller глию (используя ShH10 AAV-вариант) активирует передачу сигналов Wnt и один раунд деления Müller клеток на первой ступени метода репрограммирования. Две недели спустя эта активированная Müller глия должна далее репрограммироваться, чтобы генерировать фоторецепторы палочки с помощью второго переноса гшенов транскрипционного фактора, существенного для детерминации судьбы фоторецепторов палочек, а именно Crx, Otx2 и Nrl. Чтобы удостовериться, что новые фоторецепторы палочки возникли из Müller глии, ген tdTomato, управляемый промотором rhodopsin, был включен в первую инъекцию, чтобы пометить всю трансдуцированную Müller глию. Наконец, из этой Müller глии происходящие палочки, как было установлено, интегрируются в ретинальные circuits и восстанавливают реакцию на свет у мышиных моделей с врожденной слепотой посредством зрительного пути (от сетчатки до чати головного мозга, отвечающей на зрительные сигналы) [171].

Большинство исследований в этой области осуществляется с использованием инъекций BrdU и специфичное для типа клеток мечение для отлежиивания клона Müller клеток. В этих исследованиях присутствие BrdU+ в нейронах в общем служит в качестве доказательства, что они происходят в результате дифференцировки Müller глии. Принимая во внимание, что BrdU может быть включен во вновь синтезированную ДНК реплицирующихся клеток, BrdU+ М глия в этих исследованиях in четко демонстрирует, что повреждения сетчатки и/или альтерации сигнальных путей стимулируют Müller глию активно реплицировать свою ДНК и вступать в клеточный цикл [172]. Однако, отсутствуют прямые доказательства, что BrdU+ нейроны генерируются из Müller глии, поскольку BrdU может также инкорпорироваться в клетки, репарирующие свою ДНК^{157, 173}. Кроме того, также используетсвая промотор-индуцибельные флуоресцентные метки (такие как GFP, β-gal, и tdTomato) это может приводить к смешанным результатам из-за процесса 'material transfer', который был продемострирован в недавних сообщениях 4 разными группами исследоватлей трансплантации фоторецепторов^174-176. Используя различные техники, авт. продемнстрировали, что после трансплантации большинство меченных клеток, обнаруживаемых в сетчатке хозяина не представляли собой интегрированные фоторецепторные клетки, а фактически являются хозяйскими клетками, которые имеют измененные РНК и/или белки как и трансплантированных клетках. Следовательно, результаты исследований по трансплантации нейронов, происходящих из Müller клеток, в частично дегенерировавшей сетчатке также следует интерпретировать с осторожностью, поскольку material transfer может приводить к кажущеся ретинальной интеграции^{148, 150, 177, 178}. Фундаментальный механизм этого процесса на сегодня неизвестен, но он, по-видимому, не обусловлен устойчивым контактом между донорскими и хозяйскими клетками или высвобождением свободного белка или нуклеиновой кислоты во внеклеточное пространство [174]. Напротив, материал может быть перенсен с помощью иммунных клеток или посредством высвобождениея везикул [179].

Механизмы, лежащие в основе регенерации сетчатки сложные и остается ещё много вопросов. Понимание, почему Müller глия рыбок данио эффективно инициирует регенерацию сетчатки и почему её аналоги у млекопитающих не делают этого, имеет очень большое значение. Чтобы идентифицировать факторы, которые могли бы открыть потенциал стимулирующий регенерацию у млекопитающих, экспрессия генов в здоровых и поврежденных Müller клетках рыбок данио необходимо сравнить с транскриптомом Müller клеток млекопитающих. Хотя Müller клетки, по-видимому, получают первые активирующие сигналы от поврежденных клеток, пока нельзя исключить, что др. клетки, такие как микроглия, могут также влиять на процесс репрограммирования [8]. Следовательно, изучение вклада этих клеток в регенерацию сетчатки и их способность активировать Müller глию до состояния нейрональной дифференцировки станет критическим для продвижения к регенерации у млекопитающих.

Индукция экспрессии транскрипционных факторов, которые важны во время детерминации судеб клеток сделает возможным управление клеточными судьбами предшественников, происходящих из Müller глии, и , следовательно, замещение потеряных клеток. Множестово исследований сконцентрировано на двух ключевых факторах с интегралдьной ролью в регенеративной реакции у рыбок данио, а именно, Ascl1 и Wnt. Индукция или избыточная экспрессия этих репрограммирующих факторов и их нижестоящих сигнальных путей демонстрирует обнадеживающие результаты по восстановлению зрения^{161, 171}. Однако, исследование Yao et al. по стимуляции передачи сигналов Wnt подчеркивает важность исследований, касающихся Ascl1 [171]. В самом деле, перенос только гена β-catenin оказывается достаточным, чтобы активировать путь Wnt и индуцировать пролиферацию Müller глии у взрослых мышей, тогда как избыточная экспрессия Ascl1 требует присутствия повреждения, чтобы вызывать значительную пролифераци Müller клеток. Кроме того, авт. продемонстрировали, что стимуляция передачи сигналов Wnt/ β-catenin в комбинации с эктопической экспрессиейфоторецепторных транскрипционных факторов (Crx, Otx2 и Nrl) приводит к генерации новых фоторецепторов палочек. Это контрастирует с Ascl1-обусловленной индукцией дедифференцировки Müller глии, которая в основном приводит к продукции нейронов внутренней сетчатки, таких как биполярные и амакринные клетки. Однако, сегодня неизвестно, действительно ли таже самая комбинация транскрипционных факторов, детерминирующих судьбы фоторецепторов, будет также индуцировать продукцию фоторецепторов палочек, когда купирована со стимуляцией Ascl1. Более детальное понимание молекулярных механизмов, управляющих ретинальными предшественниками, чтобы они становились определенными типами клеток, может быть существенным для развития эффективных терапевтических стратегий. Например, больше известно о детерминации в направлении фоторецепторов палочек, чем судьбы фоторецепторов колбочек. Тем не менее, учитывая их важность для зрения человека, идентификация факторов, которые управляют судьбами фоторецепторов колбочек также имеет важное значение.

Наконец, т.к. большинство исследований регенератисного потенциала Müller клеток осуществлено в комбинации с острыми повреждениями, то остается вопрос, действительно ли этот потенциал будет сохраняться и при хронических болезнях, таких кка RP и AMD, при которых реакции Müller клеток могут быть разными. Учитывая, что gliotic реакция Müller клетокстрого зависит от типа и продолжительнос ти болезни (см. ранее), очень вероятно, что хронические повреждения также смогут влиять на процесс регенерации. В самом деле, Osakada et al. сообщили, что прогрессирование болезни может ограничивать регенерирующую сповобность сетчатки, поскольку инкорпорация BrdU в Müller клетки, по-видимому, теряется по ходу углубления дегенерации [159]. Исследование Yao et al. преоставляет надежду на зависимую от Müller клеток регенеративную терапию у млекопитающих, но использование этой стратегии при более прогрессировавших болезнях, при которых значительно большие количества клеток теряются или которые лишены соотв. синаптических соединений, нуждаются в анализе. Точный анализ того, как новые нейроны подключают сами себя к нервной сети в сетчатке после реген6ерации из Müller клеток, особенно в отсутствие клеток фоторецепторов хозяина, чтобы генерировать здоровые новые circuitry и функцию зрения.

В обзоре продемонстрирована двойная реакция Müller клеток после повреждений.

Показано, что положение Müller клеток делает их многообещающими мишенями.

Обсуждаются методы целенаправленного воздействия на Müller клетки посредством вирусной и не вирусной генотерапии.

Müller клетки могут играть выдающуюся роль в защите зрительных нейронов.

Их потенциал стволовых клеток делает их выдающимися мишенями для регенерации сетчатки. glia (purple) respond to retinal injury with a gliotic response, accompanied by a reprogramming event in which they adopt retinal stem cell properties (yellow). The nuclei of the reprogrammed M?ller glia migrate from the inner nuclear layer (INL) to the outer nuclear layer (ONL), where they divide asymmetrically and subsequently return to the INL, a process called interkinetic nuclear migration. This asymmetric division results in the formation of a multipotent progenitor, which amplifies to create a small population of progenitors capable of the regeneration of all major retinal neuron types. Key: 1, ganglion cell; 2, rod; 3, cone; 4, amacrine cell; 5, horizontal cell; 6, bipolar cell. Modified from 53, 54.

Хотя дальнейшие работы необходимы, чтобы пролить больше света на на молекулярные механизмы, происходящие во время репрограммирования Müller глии у рыбок данио, некоторые белки и сигнальные пути, участвующие в этом процессе, были идентифицированы [54]). Дальнейшие исследования теперь сфокусированы на том, как эти белки могут быть использованы, чтобы сделать сетчатку млекопитающих способной к регенерации in vivo (Table 2). первые исследования пытались стимулировать пролиферативные и нейрогенные свойства Müller клеток млекопитающих за счет простой индукции повреждений сетчатки. В 2004, Ooto and colleagues продемонстрировали, что NMDA нейротоксичность RGCs в сетчатке взрослых крыс заставляет небольшие количества Müller глии пролиферировать и продуцировать новые клетки с маркерами дифференцировки ранних биполярных нейронов и фоторецепторов палочек [154]. Сходным образом, N-methyl-N-nitrosourea (MNU)-индуцированная дегенерация фоторецепторов, как было установлено, инициирует пролиферацию Müller глии у грызунов, что ассоциирует с редкими событиями экспрессии rhodopsin, указывая на регенерацию фоторецепторов [155]. Однако, эта концепция недавно поставлена под сомнение Kugler et al., которые продемонстрировали, что NMDA-индуцированные excitotoxic повреждения сетчатки грызунов не вызывают дедифференцировку Müller клеток [156]. Сходные наблюдения были описаны др. исследовательской группой, использовавшей экспозицию светом для индукции повреждений нейронов в отсутствии заметной пролиферации Müller клеток [157]. Эти авт. установили, что bromodeoxyuridine (BrdU) был совместно локализован с DNA Ligase IV, маркером репарации ДНК. Это указывает на то, что BrdU, a nucleoside обычно используемый для детекции пролиферации, инкорпорируется в клетки из-за начинающейся репарации ДНК, это не сопровождается пролиферациeй клеток. Тем не менее, NMDA- или MNU-индуцированные повреждения в комбинации с повышенными уровнями ключевых сигнальных факторов, таких как sonic hedgehog (Shh) [158], Wingless/Integrated (Wnt) [159] и achaete-scute homolog 1 (Ascl1)^{160, 161}, или в комбинации с воздействием факторов роста [162] указывают на возникновение способности Müller глии пролиферировать и регенерировать нейроны в сетчатке грызунов. В самом деле, внутриглазные инъекции NMDA, сопровождаемые одиночной инъекцией epidermal growth factor (EGF), как было установлено, являются многообещающим методом регенерации Müller глии [162]. Экспрессия рецептора EGF в Müller глие постепенно снижается по мере созревания сетчатки, но усиливается после повреждения сетчатки. Стимуляция этого рецептора с помощью воздействия EGF после повреждения способствует пролиферации Müller клеток и активирует генов предшественников, подобно тому, как это происходит при регенерации сетчатки у не млекопитающих. Это контрастирует с повреждениями или инъекциями EGF самим по себе, которые оказались неспособны индуцировать пролиферативную реакцию в сетчатке мыши [162]. Фактор, который не активируется после NMDA-индуцированных повреждений, но, как было ранее установлено, необходим для репрограммирования и пролиферации у рыбок данио, это транскрипция пронейрального Ascl1^163-165. У рыбок данио Ascl1 активируется в пролиферирующей Müller глие в течение 6 ч после повреждения сетчатки^{163, 164} а его ингибирование ограничивает дедифференцировку Müller глии [164]. Один из механизмов, с помощью которого Ascl1 влияет на регенерацию сетчатки описан Ramachandran et al., которые продемонстрировали, что Ascl1 необходим для экспрессии Lin28, плюрипотентного мРНК-связывающего белка, экспрессирующегося на высоком уровне в эмбриональных стволовых клетках. Авт. продемонстрировали, что Ascl1-зависимая индукция Lin-28 поддерживает дедифференцировку Müller глии частично за счет понижения уровней let-7 miRNA, тем самым репрессию мРНК, важной для дедифференцировки Müller глии [163]. Отсутствие активации Ascl1 в сетчатке млекопитающих после повреждения привело к гипотезе, что путь Ascl1/Lin28/Let7 может диктовать различия в потенциале регенерации между Müller глией млекопитающих и Müller глией др. видов. В самом деле, Pollak et al. показали, что вирусом обусловленная избыточная экспрессия Ascl1 активирует нейрогенную программу в поврежденной Müller глие мышей в культуре и постнатальных эксплантах сетчатки и стимулирует генерацию клеток, экспрессирующих специфические для подтипов сетчатки маркеры и обладающих характерной для нейронов физиологическими реакциями. Хотя Ascl1 управляет экспрессией ранних маркеров большинства ретинальных нейронов, поздние маркеры оказывались более ограниченными биполярными нейронами [166]. та же группа исследователей затем продемонстрировала, что форсированная экспрессия Ascl1 в мышиной Müller глие in vivo способствует пролиферации и используется амакринными клетками, биполярными клетками и фоторецепторами после повреждений сетчатки [160]. Однако, этот потенциал регенерации, как было установлено, зависит от возраста животных^{160, 167}. Репрограммирование Müller глии с помощью Ascl1 использует ремоделирование хроматина промоторов генов предшественников от репрессированного состояния к активной конфигурации [166]. Принимая во внимание, что доступность хроматина ограничена у взрослых, зрелая мышиная Müller глия теряет свою нейрогенную способность, несмотря на избыточную экспрессию Ascl1 [160]. Несмотря на это исследовательская группа Reh недавно сообщила, что избыточная экспрессия Ascl1, купированная с действием histone deacetylase inhibitor, может обойти это ограничение и позволяет взрослым мышам генерировать нейроны внутренней сетчатки из Müller глии после повреждения сетчатки [161]. Кроме того, эти регенерированные нейроны экспрессируют маркеры нейронов внутренней сетчатки, интегрируются в нейрональный circuit, и, как было установлено, реагируют на свет. Это указывает на то, что хотя нейрогенез всё ещё ограничен, вновь сформированные нейроны являются функциональными и могут восстанавливать зрение.

Table 2. Müller cell regeneration in the mammalian retina in vivo

Помимо активации экспрессии lin28, Ascl1 также вносит вклад в репрограммирование Müller клеток путем регуляции передачи сигналов Wnt и её нижестоящей мишени β-catenin, lh/ крупного пути в регенеративной реакции у рыбок данио [168]. После повреждения сетчатки рыбок данио этот путь активируется в предшественниках, происходящих из Müller клеток, и контролирует их пролиферацию [165]. Установлено, что Asc1 супрессирует экспрессию Dkk, ингибитора передачи сигналов Wnt, усиливая тем самым экспрессию Wnt генов, тогда как Wnt, в свою очередь, индуцирует экспрессию Asc1 в активированных Müller клетках [165]. Также в сетчатке мышей, Osakada et al. ранее показали, что передача сигналов Wnt/ β-catenin участвует в пролиферации небольшой фракции Müller клеток, которая появляется после повреждения, которая может далее увеличиваться с помощью добавления агонистов Wnt рецепторов [159].

В то время как поврежденная сетчатка млекопитающих в отдельности или в комбинации в ростовыми и сигнальными факторами, стимулирует пролиферацию Müller глии и приводит к ограниченному нейрогенезу, такое повреждение неизбежно вызывает клеточную гибель, которая неблагоприятна и контрпродуктивна регенерации. Поэтому, стратегия без травм, которая не требует дальнейшего повреждения пораженной сетчатки, была бы предпочтительной. Поэтому, стратегия без травм, которая не потребует дальнейшего повреждения пораженной сетчатки, была бы предпочтительной. Удивительно, субретинальная доставка субтоксических доз glutamate также стимулирует Поэтому, стратегия без травм, которая не потребует дальнейшего повреждения пораженной сетчатки, была бы предпочтительной. Удивительно, субретинальная доставка глютамата также стимулирует Müller глию к повторному вступлению в клеточный цикл и индукции редкой популяции, способной к регенерации без возникновения повреждений сетчатки [169]. Сходным образом, Del Debbio et al. продемонстрировали, что стимуляция передачи сигналов Wnt и Notch у крыс, моделирующих дегенерацию фоторецепторов, приводит к активации Müller глии, которая обнаруживает экспрессию специфических для фоторецепторов палочек маркеров в дегенерирующих наружных ядерных слоях и достоверное временное улучшение восприятия света [170]. Хотя существует строгая корреляция между улучшением восприятия света и количеством активируемой Müller глии, экспрессирующей opsin, авт. оказались неспособны исключить, что это функциональное улучшение (частично) обусловлено жизнеспособностью фоторецепторов хозяина. Более прямым доказательством является будет подтверждение функциональности этих клеток. В этом исследовании метод двух-струпенчатого перепрограммирования использован, чтобы сначала активировать Müller глию с помощью инъекций в стекловидное тело Wntb2 (активирующего Wnt) и Jag1 (активирующего передачу сигналов Notch), а затем инъекция Shh и DAPT (ингибирующих Notch), чтобы способствовать дифференцировке фоторецепторов палочек. Недавно сходный подход был опубликован группой Bo Chen, которая предоставила доказательства, что без повреждения, избирательный перенос гена β-catenin в Müller глию (используя ShH10 AAV-вариант) активирует передачу сигналов Wnt и один раунд деления Müller клеток на первой ступени метода репрограммирования. Две недели спустя эта активированная Müller глия должна далее репрограммироваться, чтобы генерировать фоторецепторы палочки с помощью второго переноса генов транскрипционного фактора, существенного для детерминации судьбы фоторецепторов палочек, а именно Crx, Otx2 и Nrl. Чтобы удостовериться, что новые фоторецепторы палочки возникли из Müller глии, ген tdTomato, управляемый промотором rhodopsin, был включен в первую инъекцию, чтобы пометить всю трансдуцированную Müller глию. Наконец, из этой Müller глии происходящие палочки, как было установлено, интегрируются в ретинальные circuits и восстанавливают реакцию на свет у мышиных моделей с врожденной слепотой посредством зрительного пути (от сетчатки до чати головного мозга, отвечающей на зрительные сигналы) [171].

Большинство исследований в этой области осуществляется с использованием инъекций BrdU и специфичное для типа клеток мечение для отслеживания клона Müller клеток. В этих исследованиях присутствие BrdU+ в нейронах в общем служит в качестве доказательства, что они происходят в результате дифференцировки Müller глии. Принимая во внимание, что BrdU может быть включен во вновь синтезированную ДНК реплицирующихся клеток, BrdU+ М глия в этих исследованиях in четко демонстрирует, что повреждения сетчатки и/или альтерации сигнальных путей стимулируют Müller глию активно реплицировать свою ДНК и вступать в клеточный цикл [172]. Однако, отсутствуют прямые доказательства, что BrdU+ нейроны генерируются из Müller глии, поскольку BrdU может также инкорпорироваться в клетки, репарирующие свою ДНК^{157, 173}. Кроме того, также используются промотор-индуцибельные флуоресцентные метки (такие как GFP, β-gal, и tdTomato) это может приводить к смешанным результатам из-за процесса 'material transfer', который был продемонстрирован в недавних сообщениях 4 разными группами исследователей трансплантации фоторецепторов^174-176. Используя различные техники, авт. продемонстрировали, что после трансплантации большинство меченных клеток, обнаруживаемых в сетчатке хозяина не представляли собой интегрированные фоторецепторные клетки, а фактически являются хозяйскими клетками, которые имеют измененные РНК и/или белки как и трансплантированных клетках. Следовательно, результаты исследований по трансплантации нейронов, происходящих из Müller клеток, в частично дегенерировавшей сетчатке также следует интерпретировать с осторожностью, поскольку material transfer может приводить к кажущейся ретинальной интеграции^{148, 150, 177, 178}. Фундаментальный механизм этого процесса на сегодня неизвестен, но он, по-видимому, не обусловлен устойчивым контактом между донорскими и хозяйскими клетками или высвобождением свободного белка или нуклеиновой кислоты во внеклеточное пространство [174]. Напротив, материал может быть перенсен с помощью иммунных клеток или посредством высвобождения везикул [179].

Механизмы, лежащие в основе регенерации сетчатки сложные и остается ещё много вопросов. Понимание, почему Müller глия рыбок данио эффективно инициирует регенерацию сетчатки и почему её аналоги у млекопитающих не делают этого, имеет очень большое значение. Чтобы идентифицировать факторы, которые могли бы открыть потенциал стимулирующий регенерацию у млекопитающих, экспрессия генов в здоровых и поврежденных Müller клетках рыбок данио необходимо сравнить с транскриптомом Müller клеток млекопитающих. Хотя Müller клетки, по-видимому, получают первые активирующие сигналы от поврежденных клеток, пока нельзя исключить, что др. клетки, такие как микроглия, могут также влиять на процесс репрограммирования [8]. Следовательно, изучение вклада этих клеток в регенерацию сетчатки и их способность активировать Müller глию до состояния нейрональной дифференцировки станет критическим для продвижения к регенерации у млекопитающих.

Индукция экспрессии транскрипционных факторов, которые важны во время детерминации судеб клеток сделает возможным управление клеточными судьбами предшественников, происходящих из Müller глии, и , следовательно, замещение потерянных клеток. Множество исследований сконцентрировано на двух ключевых факторах с интегральной ролью в регенеративной реакции у рыбок данио, а именно, Ascl1 и Wnt. Индукция или избыточная экспрессия этих репрограммирующих факторов и их нижестоящих сигнальных путей демонстрирует обнадеживающие результаты по восстановлению зрения^{161, 171}. Однако, исследование Yao et al. по стимуляции передачи сигналов Wnt подчеркивает важность исследований, касающихся Ascl1 [171]. В самом деле, перенос только гена β-catenin оказывается достаточным, чтобы активировать путь Wnt и индуцировать пролиферацию Müller глии у взрослых мышей, тогда как избыточная экспрессия Ascl1 требует присутствия повреждения, чтобы вызывать значительную пролиферацию Müller клеток. Кроме того, авт. продемонстрировали, что стимуляция передачи сигналов Wnt/ β-catenin в комбинации с эктопической экспрессией фоторецепторных транскрипционных факторов (Crx, Otx2 и Nrl) приводит к генерации новых фоторецепторов палочек. Это контрастирует с Ascl1-обусловленной индукцией дедифференцировки Müller глии, которая в основном приводит к продукции нейронов внутренней сетчатки, таких как биполярные и амакринные клетки. Однако, сегодня неизвестно, действительно ли таже самая комбинация транскрипционных факторов, детерминирующих судьбы фоторецепторов, будет также индуцировать продукцию фоторецепторов палочек, когда купирована со стимуляцией Ascl1. Более детальное понимание молекулярных механизмов, управляющих ретинальными предшественниками, чтобы они становились определенными типами клеток, может быть существенным для развития эффективных терапевтических стратегий. Например, больше известно о детерминации в направлении фоторецепторов палочек, чем судьбы фоторецепторов колбочек. Тем не менее, учитывая их важность для зрения человека, идентификация факторов, которые управляют судьбами фоторецепторов колбочек также имеет важное значение.

Наконец, т.к. большинство исследований регенеративного потенциала Müller клеток осуществлено в комбинации с острыми повреждениями, то остается вопрос, действительно ли этот потенциал будет сохраняться и при хронических болезнях, таких как RP и AMD, при которых реакции Müller клеток могут быть разными. Учитывая, что gliotic реакция Müller клеток строго зависит от типа и продолжительности болезни (см. ранее), очень вероятно, что хронические повреждения также смогут влиять на процесс регенерации. В самом деле, Osakada et al. сообщили, что прогрессирование болезни может ограничивать регенерирующую способность сетчатки, поскольку инкорпорация BrdU в Müller клетки, по-видимому, теряется по ходу углубления дегенерации [159]. Исследование Yao et al. предоставляет надежду на зависимую от Müller клеток регенеративную терапию у млекопитающих, но использование этой стратегии при более прогрессировавших болезнях, при которых значительно большие количества клеток теряются или которые лишены соотв. синаптических соединений, нуждаются в анализе. Точный анализ того, как новые нейроны подключают сами себя к нервной сети в сетчатке после реген6ерации из Müller клеток, особенно в отсутствие клеток фоторецепторов хозяина, чтобы генерировать здоровые новые circuitry и функцию зрения.

В обзоре продемонстрирована двойная реакция Müller клеток после повреждений.

Показано, что положение Müller клеток делает их многообещающими мишенями.

Обсуждаются методы целенаправленного воздействия на Müller клетки посредством вирусной и не вирусной генотерапии.

Müller клетки могут играть выдающуюся роль в защите зрительных нейронов.

Их потенциал стволовых клеток делает их выдающимися мишенями для регенерации сетчатки.