Детальные знания мутаций, ассоциированных с патогенетическим механизмом, как в случае epidermolysis bullosa simplex (EBS), могло бы улучшить успешность лечения, обеспечивая молекулярное считывание маркеров болезни. Целенаправленное воздействие на мутации epidermolysis bullosa (EB) на геномном уровне могло бы обеспечить устойчивость исправления.¹ Однако, альтернативный подход, базирующийся замещении определенных сегментов мутантной мРНК посредством терапевтических молекул РНК, может быть использован для большой кагорты пациентов. Более того, наиболее продвинутая терапия по замещению гена не может преодолеть эффект доминантно нарушенного аллеля^2-4, даже если он был успешно использован в многочисленных случаях дефектов рецессивно наследуемых генов, таких как EB-ассоциированный ген LAMB3. Это подчеркивает, что на сегодня не существует терапии без потенциальных недостатков, а только набор терапевтических опций, которые могут быть применены в зависимости от конкретных условий и генетического заболевания.

Некоторые исследования с использованием обеспечиваемого сплайсесомами транс-сплайсинга mRNA (SMaRT) сделали выполнимым этот подход по коррекции доминантных и рецессивных мутаций на уровне мРНК, путем замещения последовательностей в 4·5 kb.^{5, 6} Основой SMaRT является искусственное преобразование RNA trans-splicing molecule (RTM). Это обеспечивает (i) замещение кодирующего региона, или в 5', 3' или центральной части гена; (ii) функциональный сплайсинг и особенно в сильных сайтах сплайсинга, это усиливает транс- по сравнению с цис-сплайсингом и (iii) связывающий домен, который гибридизируется с определенной мРНК мишенью. Для этого необходимы две pre-mRNAs, находящиеся в соединении (apposition), облегчающие транс-сплайсинг.⁷ Функциональность этого подхода, как было установлено ранее, при кистозном фиброзе,^{8, 9} spinal muscular atrophy,¹⁰ Duchenne muscular dystrophy,¹¹ DNA protein kinase deficiency,¹² Huntington disease,¹³ X-linked immunodeficiency¹⁴ и многих др. болезнях. Более того, ранее мы продемонстрировали успешную коррекцию мРНК, содержащих мутации, ассоциированные с многочисленными подтипами EB.^15-20

Среди гетерогенной группы генодерматозов, EB характеризуется образованием волдырей и эрозий кожи и слизистых мембран, как результат возникают дефекты соединения между эпидермисом и дермисом. Чтобы корректировать доминантно наследуемые мутации горячих точек (c.373C>T; p.R125H) в гене keratin 14 (KRT14), которые вызывают генерализованные тяжелые подтипы EBS (EBS gen sev), мы избрали стратегию 5' trans-splicing.²¹ В базальных кератиноцитах, которые представляют большинство клеток в базальном эпидермальном слое, KRT14 кодирует промежуточные белковые филаменты keratin 14. EBS gen sev считается одним из наиболее тяжелых ассоциированных с KRT14 EBS подтипом . Это обусловлено постоянно активированным путем стрессов, способствующих воспалению, запускаемым посредством патологического накопления агрегатов, содержащих keratin 14 в цитоплазме кератиноцитов.

Keratin 14 гетерополимеризуется с keratin 5, чтобы создавать сеть из промежуточных филамент кератина (KIF) . Эта сеть занимает цитоплазму, прикрепляется к десмосомам и полу-десмосомам. Эти похожие на бляшки структуры соединяют кератиноциты с соседними клетками и базальной мембраной, соотв. Доминантные точечные мутации в любом из этих двух огенов кератина чаще всего затрагивают концы центрального палочковидного домена кератинов 14 и 5, которые ответственны за гетеродимеризацию, приводя к коллапсу KIF сети после минимальной механической травмы. Это также приводит к характерным KIF агрегатам, которые накапливаются на периферии цитоплазмы. Очевидно, что клетки пытаются освободиться от этих агрегатов, секретируется способствующий воспалению цитокин interleukin (IL)-1 β и активируется во всё увеличивающихся уровнях, как это наблюдается при болезни Гентингтона.^{22, 23}

Вместе с созданием воспалительной среды в коже, IL-1 β также запускает cJun N-terminal kinase (JNK)-вызываемый стрессовый путь аутокринным способом. Это , в свою очередь, активирует транскрипцию AP-1-чувствительные гены, такие как matrix metalloproteinase 1 (MMP1), kallikrein 7 (KLK7), rho guanine nucleotide exchange factors (ARHGEF family) и др., а также KRT14 и самого себя IL1B.²⁴ Возникающая в результате позитивная петля обратной связи и избыточная экспрессия keratin 14 в конечном итоге становятся причиной тяжелого фенотипа EBS gen sev. Разрушение этой петли обратной связи в EBS кератиноцитах путем ингибирования IL-1 β приводит к стабилизации сети KIF, восстанавливая резистентность к механическим воздействиям.²³

Сегодня лечение EBS gen sev ограничивается воздействиями на симптомы и стандартным лечением ран.²⁵ Первые клинические испытания были опубликованы, в них были использованы малые молекулы, чтобы облегчить вторичные проявления болезни не целенаправленным способом. Мы недавно продемонстрировали влияние малой молекулы diacerein на индуцируемый с помощью IL-1 β путь JNK стресса. Это было показано in vitro и привело в результате к клинически значимому сокращению волдырей в пилотной и фазе II/III клинических испытаний.²⁶ Использование diacerein или др. субстанций, нацеленных на путь JNK стресса (напр. anakinra, rilonacept), обеспечивает только временный эффект уменьшения волдырей. Однако, их потенциальная кратковременная доступность на сегодня делает такие подходы привлекательными для повышения качества жизни пациентов. Особенно для причинной терапии, которая направлена на исправление генетических мутаций, остается несколько препятствий.^{26, 27} .

В этом исследовании мы продемонстрировали пригодность SMaRT для снижения избыточной экспрессии keratin 14 и для фенотипической коррекции кератиноцитов пациентов в ксенотрансплантантах мышиных моделей. Подтверждая предыдущие находки по патологическому механизму, наши данные показали, что снижение экспрессии мутантного аллеля по сравнению с аллелем дикого типа после транс-сплайсингом обеспечиваемой коррекции приводит к подавлению IL-1 β- обеспечиваемой передачи сигналов JNK, указывая на потенциально высокое влияние этого лечения при EBS.

Итак, мы представили ex vivo базирующийся на RNA trans-splicing терапевтический подход для коррекции фенотипа. Чтобы откорректировать мутацию в экзоне 1 гена KRT14, использовали подход 5'-trans-splicing, при котором любая мутация внутри первых 7 экзонах, может быть замещена одиночной терапевтической молекулой.

Терапевтическая RNA trans-splicing молекула, содержащая дикого типа экзоны 1-7 стабильно трансдуцируется в кератиноциты от EBS пациентов. Транс-сплайсинг осуществляется посредством reverse-transcriptase polymerase chain reaction, Western blotting и immunofluorescence microscopy. Эквиваленты кожи были сформированы из исправленных кератиноцитов, которые были трансплантированы мышам nude и проанализированы спустя 8 недель после трансплантации в отношении регулярности стратификации эпидермиса, экспрессии индуцированного зеленого флуоресцентного белка и образования волдырей.

Эквиваленты трансплантированной кожи, сгенерированные из откорректированных с помощью транс-сплайсинга кератиноцитов, показали наличие стабильного, лишенного волдырей эпидермиса. Коррекция KRT14 разрушала ассоциированную передачу про-воспалительных сигналов EBS gen sev, что продемонстрировано на уровне мРНК и белка. Разрушение патогенетической петли обратной связи помимо общего подавления экспрессии KRT14 подчеркивало эффект коррекции KRT14 на патологический механизм EBS.