Посещений: 
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ
Способы
Epigenetic therapy in immune-oncology • Peter A. Jones,
• Hitoshi Ohtani,
• Ankur Chakravarthy &
• Daniel D. De Carvalho
 Nature Reviews Cancer volume 19, pages151–161 (2019)
| |
|
Рак является как генетической, так и эпигенетической болезнью, которая наделяет опухолевые клетки некоторыми уязвимостями для воздействия. Накопление генетических альтераций и мутаций и глобальных изменений ландшафта хроматина вносят вклад в инициацию и прогрессирование рака. Более того, имеется интересное взаимодействие между генетическими и эпигенетическими альтерациями. Напр., гены, кодирующие регулирующие хроматин энзимы, находятся среди наиболее частых мутирующих генов в раковых опухолях взрослых и детей и эти мутации ассоциируют с изменениями эпигенома1. Напротив, метилирование ДНК делает цитозин более чувствительным к дезаминированию, приводя к мутациям перехода C->T. В самом деле, многие горячие точки онкогенных мутаций, обнаруживаются в метилированных CpG сайтах2, подчёркивая что взаимоотношения между генетикой и эпигенетикой при раке могут быть двунаправленными1. В терминах метилирования ДНК, опухоли часто обнаруживают глобальную потерю метилирования ДНК3 , при этом наблюдается избыточное фокальное метилирование ДНК в CpG-богатых сайтах4. Это кажущееся расхождение, скорее всего, обусловлено тем, что большая часть ДНК 5-methylcytosine в геноме локализуется в мобильных элементах5 (которые и являются основным фокусом данного обзора ) и поэтому как положено исключается из высоко-производительного анализа, используемого в The Cancer Genome Atlas (TCGA).
Принимая во внимание обширные альтерации метилома при раковых опухолях человека, неудивительно, что они могут стать мишенями для новой терапии. DNA methyltransferase inhibitors (DNMTi) являются теперь главной опорой для терапии myelodysplastic syndromes (MDS) и acute myeloid leukaemia (AML) в качестве единственных агентов, но не все пациенты получают пользу при использовании их в качестве монотерапии6. Кроме того, они могут быть неэффективны для лечения солидных опухолей в качетве единственных агентов. Это подчеркивает необходимость в новых эффективных биомаркерах и в разумных обоснованных решениях по комбинационной терапии с др. агентами, особенно с вновь синтезированными нацеленными на хроматин лекарствами, и всё больше с иммунотерапией. Иммунотерапия, как недавно было установлено, участвует в воздействиях на некоторые типы солидных опухолей, но всё равно эффективна только приблизительно у 15-25% пациентов, снова указывая на необходимость комбинированной терапии6.
Кстати, большое внимание к механизмам действия DNMTi было привлечено обратным действием (reversal) приобретенного аберрантного метилирования ДНК опухолевых супрессоров и др. генов, имеющих отношение к инициации и поддержанию трансформированного состояния4,7. Однако, теперь интерес переключился на роль активации эндогенно метилированных последовательностей, таких как cancer-testis antigens (CTAs) и endogenous retroviruses (ERVs) человека, которые супрессируются с помощью метилирования ДНК в большинстве соматических клеток. Активация этих cancer-testis генов и повторяющихся последовательностей могут в принципе иметь результатом появление нео-антигенов в клетках после воздействия, повышая тем самым узнаваемость иммунным надзором хозяина8. В соответствии с этим, ERVs, экспрессирующиеся в clear cell renal cell carcinomas (ccRCCs), как было установлено, кодируют пептиды, которые выявляют иммунореактивность T клеток и B клеток9. Существует также потенциал активации укороченных происходящих из вирусов long terminal repeats (LTRs), внедренных в интроны, это может приводить к продукции нео-антигенов согласно Brocks et al.10. Активация ERVs и возможно др. мобильных элементов, таких как Alu элементы и long interspersed elements (LINEs) может приводить к состоянию вирусной мимикрии11 при этом после воздействия рак интерпретирует индуцированную экспрессию, как обусловленную инфекцией экзогенного вируса и развивает реакцию врожденного иммунитета, приводя к продукции type I и type III interferon и др. цитокинов11,12.
Общим результатом реакции вирусной мимикрии является снижение жизнеспособности раковых клеток и привлечение cytotoxic T lymphocytes (CTLs) к tumour microenvironment (TME). Такой побочный эффект может быть критическим для деструкции опухолевых клеток, которые при этом не были прямо подвергнуты действию DNMTi , поскольку они не были в S фазе во время экспозиции, что абсолютно необходимо для инкорпорации в ДНК, чтобы индуцировать пассивное деметилирование13. Кроме того, это свойство пригодно потому, что сберегает неделящиеся нормальные клетки, которые составляют большинство массы тела индивида, от вредных эффектов, связанных с ингибированием метилирования ДНК вне мишени. Более того, пропитывающие иммунные клетки также обнаруживают эпигенетические аномалии, которые могут подвергаться целенаправленному воздействию эпигенетической терапии14-17. Ярким примером являются CTLs, которые могут оказаться истощенными во время хронической стимуляции в TME. Этот истощенный фенотип характеризуется аберрантным метилированием ДНК в генах, ассоциированных с эффекторными функциями T клеток, таких как interferon-γ (IFNγ)16. Терапия с современной блокадой иммунного КПП (checkpoint), включая anti-programmed cell death 1 (PD1) и anti-PD1 ligand 1 (PDL1), не всегда способна полностью репрограммировать истощенные CTLs обратно в эффекторные клетки14,15,17 (Box 1). Однако, DNMTi могут работать путем ухода от начала истощения и репрограммирования истощенных CTLs в эффекторный фенотип 16. Хотя эти недавние открытия подчеркивают тот факт, что DNMTi могут работать синергично с иммунотерапией путем воздействия как на раковые клетки, там и иммунные клетки, чтобы усилить противоопухлевую иммунную реакцию. Безусловно целенаправленное воздействие др. эпигенетических модификаторов, таких как SET domain, bifurcated 1 (SETDB1), lysine demethylase 1 (LSD1; известна также как KDM1A) и cyclin-dependent kinase 9 (CDK9), как было установлено, обнаруживают сходную индукцию вирусной мимикрии в ответ и действуют синергично с PD1 блокадой в мышиных моделях18-20.
В этом обзоре мы анализируем недавние открытия, показывающие, что эпигенетическая терапия на примере DNMTi может действовать, повышая иммуногенность раковых клеток, преобразуя иммунное TME и непосредственно репрограммируя иммунные клетки. Хотя существует множество ингибиторов модифицирующих гистоны энзимов, лежащих в основе развития, мы в основном оценивали DNMTi, принимая во внимание, что существует значительно больше данных, пригодных благодаря их потенциальным механизмам действия. Мы сфокусировались на аргументе. что DNMTi вряд ли являются столь же эффективными в качестве единственных агентов, особенно в солидных опухолях. Кроме того, мы подчеркиваем, как они могут работать синергично с иммунотерапией путем воздействия на раковые клетки и иммунные клетки в TME, чтобы усиливать противоопухолевые иммунные реакции и в конечном итоге улучшая клинические исходы.
|
Box 1 Principles of immune checkpoint inhibitors
The adaptive immune response is a potent mediator of cytolysis of target cells or pathogens. The potential for autoimmune disease has led to the evolution of mechanisms that can regulate and fine-tune the duration and magnitude of an immune response. Thus, there are multiple factors that serve to either stimulate or dampen the adaptive immune response. Some of these factors work directly through ligand-receptor signalling, such as the well-characterized immune checkpoints and clinically validated immunotherapy targets cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA4)97 and programmed cell death 1 (PD1)98. The field has been comprehensively reviewed previously99,100. |
По мере прогрессирования рака иммунные КПП (checkpoints) запускаются на T клетках или с помощью лигандов, секретируемых или экспрессируемых опухолями, или с помощью др. супрессирующих иммунитет популяций клеток в микроокружении. Др. иммунные подавляющие пути работают путем метаболической модификации тканевого микроокружения так, что ключевые метаболиты, необходимые для активации Т клеток, теряются. Прекрасным примером такого класса механизма могут служить indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) и IDO2, продуцируемые иммунодепрессивными миелоидными клетками101, и передача сигналов аденозиновыми рецепторами102.
Некоторые из этих иммунных checkpoints и иммунодепрессивных механизмов стали предметом терапевтических разработок с использованием антител, блокирующих взаимодействия лиганд-рецептор путем конкурентного связывания с любой из мишеней. Антитела, нацеленные на рецепторы иммунного checkpoint CTLA4 и PD1, также как и антитела, нацеленные на PD1 ligand 1 (PDL1), демонстрируют клиническую пригодность при метастатических меланомах, раке легких103, метастатическом раке мочевого пузыря104, Merkel cell карциномах105 и дефицитных по mismatch репарации раках106.
Целенаправленное воздействие стимулирующих checkpoints, таких как OX40 (известен также как TNFRSF4)-OX40L (известен также как TNFSF4) взаимодействие было изучено в преклинических исследованиях с использованием агонистических антител. Клиническая эффективность anti-PD1 и anti-CTLA4 агентов продемонстрировала осуществимость трансляционного подхода, при котором пары лиганд-рецептор впервые участвуют в модуляции функции Т клеток, сопровождаемой разработкой агонистов и/или антагонистов и последующей клинической оценкой, это привело к быстрому увеличению количества иммунотерапевтических агентов и их комбинаций, находящихся в разработке 107.
Epigenetic drugs move into the clinic
Эпигенетическая терапия уже известна длительное время и известна как эффективное лечение гематологических и солидных опухолей, идет множество клинических испытаний по разработке дальнейших лекарств и комбинационных терапий4,7. Эпигенетическая терапия, сегдня тестируемая в клинических испытаниях, может быть подразделена на два больших класса, обширные 'reprogrammers' и целенаправленную терапию для лечения специфических субнаборов пациентов4. Широкие репрограммисты включают DNMTi и histone deacetylaseinhibitors (HDACi), которые приводят к генерализованным изменениям в эпигеноме. Целенаправленные терапии используются для лечения специфических генетических альтераций в эпигенетических путях. Напр., мутации isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) и IDH2 при AML могут подвергнуться целенаправленному воздействию с использованием IDH ингибиторов, а мутации избыточности функции enhancer of zeste homologue 2 (EZH2) при лимфомах может быть подвергнуты целенаправленному действию EZH2 ингибиторов. Более того, целенаправленные терапии могут быть использованы, чтобы эксплуатировать синтетические летали. Напр., ингибиторы histone H3 lysine residue 79 (H3K79) methyltransferase DOT1L наиболее активны при лейкемиях, при лейкемиях, несущих транслокацию гена histone methyltransferase mixed-lineage leukaemia (MLL; известен также как KMT2A), а EZH2 ингибиторы наиболее активны в опухолях с мутациями в энзиме SMARCB1, ремоделирующем хроматин (ref.4).
Эти клинические активности, демонстрирующие эффективность эпигенетической терапии при раковых опухолях человека, приводят к вопросу: почему пациенты реагируют? Хотя до сих пор основное внимание было обращено потенциалу преобразования эпигенома с учетом экспрессии белок-кодирующих генов, теперь возник значительный интерес к потенциалу таких терапий, чтобы активировать приобретенные иммунные реакции, позволяя тем самым повысить распознаваемость опухолей с помощью иммунной системы хозяина. В самом деле, недавние работы с пациентами с MDS установили, что эти пациенты, реагирующие на DNMTi 5-azacytidine (Vidaza), были способны индуцировать экспрессию генов, ассоциированных с реакциями на воспаление и иммунными реакциями, включая гены, стоящие ниже пути вирусной мимикрии21. Это обеспечило возможность in vivo клинической оценки концепции, что вирусная мимикрия является ключевым противоопухолевым механизмом, индуцируемым с помощью агентов, деметилирующих ДНК.
5-Azacytidine, как впервые было установлено, обладает активностью при AML в 1976 (ref.22), спустя 33 года Fenaux et al.23 продемонстрировали его эффективность при лечении низкими дозами пожилых пациентов с низким содержанием в костном мозге blast и с AML. Клинические разработки были замедлены до некоторой степени из-за того, что первоначально использовали высокие дозы соединения, вызывающие побочные эффекты. Давно известно, что DNMTi имеют колоколообразные кривые дозовой зависимости для индукции экспрессии генов24. Высшие дозы могут вызывать избыточную цитотоксичность, особенно в костном мозге, не позволяя у пациентов добиться позитивной реакции. Последние 9 лет инъекции, 5-azacytidine были одобрены US Food and Drug Administration (FDA), Health Canada и the European Medicines Agency и теперь они является стандартом при лечении MDS во всем мире. 5-Aza-2'-deoxycytidine (decitabine), deoxy производное 5-azacytidine,также был разрешен для лечения MDS и его внутривенные инъекции скорее, чем подкожные, как и в случае 5-azacytidine. Имеется значительный интерес к разработке его соединений, принимаемых через рот, учитывая, что его прием необходим ежедневно в течение 5 дней. Лекарственные компании теперь также разрабатывают следующего поколения DNMTi, включая guadecitabine, который является динуклеотидным prodrug для decitabine25 и который становится предметом значительного интереса, принимая во внимание, что он хорошо переносится пациентами с MDS. Это обусловлено более продолжительным периодам полу-жизни и биодоступностью guadecitabine26.
HDACi vorinostat, как было установлено, эффективен для лечения кожных T клеточных лимфом27,28, и, по крайней мере, 4 др. HDACi были одобрены FDA, и много ещё находится на клинических испытаниях4. Фокус внимания смещается на целенаправленные ингибиторы, которые являются специфичными ингибиторами определенных изоформ HDACs, в надежде, что они окажутся более эффективными с меньшими побочными эффектами. Фармацевтические фирмы взбудоражены возможностью целенаправленного воздействия др. ассоциированных с хроматином белков, включая разработку bromodomain and extraterminal inhibitors (BET inhibitors)29 и CDK9 ингибиторов30, которые также способны изменять экспрессию генов в раковых опухолях. Многие из этих ингибиторов находятся на клинических испытаниях с надеждой, что некоторые из них будут пригодны для лечения гематологических и солидных злокачественных новообразований.
Поскольку эпигенетические процессы, такие как метилирование ДНК и модификации гистонов часто работают параллельно как самоупрочивающиеся системы, то сегодня огромное внимание уделяется тестированию комбинаций лекарств , которые могут повышать эффективность таких одиночных агентов. В табл. 1 представлен частичный список лекарственных комбинаций с использованием DNMTi в качестве основного лечения. Напр., комбинация HDACi с DNMTi может увеличивать количество и уровни, индуцированных генов и microRNAs 31-34 , а также независимо активацию внутригенных LTRs 10. Сходным образом, EZH2-обеспечиваемое метилирование гистонов и метилирование ДНК часто действительно взаимоисключающие в отношении из расположения в хроматине, но оба воздействуют на на CpG островки для их замалчивания 35. Часто, когда устраняется метилирование ДНК генетически или фармакологически, то CpG островки становятся молчащими за счет EZH2 , чтобы поддерживать покоящееся состояние определенных генов 35,36, включая ERV LTRs, которые являются предположительно промоторами ERVs 37. Эти результаты указывают на то, что комбинирование эпигенетических терапий, таких как DNMTi с EZH2 ингибиторами или ингибиторами др. гистоновых метилтрансфераз, может обнаруживать значительную эффективность в индукции вирусной мимикрии. Довольно неожиданно адекватные физиологические концентрации витамина C (кофактора для ten-eleven translocation (TET) энзимов) необходимы для обеспечения наивысших уровней экспрессии ERVs в клетках, подвергшихся воздействию DNMTi 38. И снова экспериментальная оценка такой комбинации на преклинических моделях 38 подтвердила, что строгую синергию можно ожидать у пациентов 39, а клинические испытания, предлагаемые для тестирования этого, уже проводятся. В табл. 1 приводится неполный список этих терапевтических комбинаций с DNMTi , используемых для сенсибилизации опухолевых клеток к др. формам эпигенетической терапии, химиотерапии, трансплантаций или иммунотерапии. Многие будущие испытания будут использовать комбинации лекарств, нацеленных на эпигеном в дополнение к др. подходам.
 Table 1 Examples of combination treatments with DNA methyltransferase inhibitors and other agents
The retroviruses within us
Evolution of ERV integrations into the human genome
ERVs человека занимают приблизительно 8.5% нашей ДНК 40, и пока они не изучаются активно из-за их повторяющейся природы, которая осложняет картирование. Эта ситуация меняется с разработкой технологий глубокого секвенирования, которая сегодня позволяет аккуратное картирование приблизительно 90% из 750000 интактных и фрагментированных кусочков ДНК, которые происходят из этих ERVs 37. Интактные ERVs, по-видимому, сходны с экзогенными ретровирусами тем, что они приблизительно в 7 kilobases длиной и содержат 3-4 гена и 2 LTRs, которые представляют регуляторные элементы ERV (Fig. 1a). Чтобы ERVs колонизировать зародышевую линию человека, необходимо, чтобы они умеренно интактными, что позволило бы их успешную интеграцию в зародышвую линию. В последствии в ходе эволюции они фрагментируются и оказываются не компетентными к репликации со временем. Мы недавно картировали позиции таких ERVs в геноме человека 37 и установили, что они располагаются почти повсеместно в геноме человека за исключением сателлитных регионов ДНК и точек старта транскрипции генов 41.
Fig. 1: Genome structure and activity of endogenous retroviruses.
a | Transposable elements are categorized into two groups: long terminal repeat (LTR) retrotransposons, which include endogenous retroviruses (ERVs), and non-LTR retrotransposons, which include long interspersed nuclear elements (LINEs) and short interspersed nuclear elements (SINEs). An intact ERV consists of 5? and 3? LTRs and three viral genes (gag, which encodes a structural protein, pol, which encodes a reverse transcriptase, and env, which encodes an envelope protein). In the genome, most ERVs exist as non-intact ERVs, such as solitary LTRs and degenerated viral genes. Furthermore, a subset of ERVs can form double-stranded RNAs. b | 5-Methylcytosine depletes CpGs in LTRs. Evolutionarily young ERVs are silenced by DNA methylation at LTRs, but CpG sites are lost owing to CpG deamination during human genome evolution. Evolutionarily old ERVs eventually become inactive by the accumulation of loss-of-function genetic mutations. The evolutionarily young ERVs can be activated by treatment with DNA methyltransferase inhibitors (DNMTi), but older ERVs cannot.
ERVs колонизовали зародышевую линию приматов волнами и разные семейства и подсемейства ERVs интегрировались в зародышевую линию приблизительно в течение последних 100 миллионов лет эволюции приматов. Предпочтительным механизмом замалчивания экспрессии вновь интегрированных ERVs явилось метилирование цитозина, особенно внутри LTR регионов 42,43. Молчание необходимо, чтобы гарантировать их транскрипционный покой; однако, некоторые ERVs оказываются активированными во время специфических фаз развития. Интересно, что субнабор эволюционно молодых ERVs избегает деметилирования и, следовательно, активируется при развитии, подчеркивая важность метилирования ДНК для супрессии ERVs 44. Хотя метилирование ДНК является преимущественным первоначальным механизмом замалчивания, но хорошо известна склонность 5-methylcytosine к дезаминированию тимидина4 5,46 приводящего к постепенной потере сайтов CpG как функции возраста ERV относительно того, когда они были интегрированы в зародышевую линию (Fig. 1b). Это означает, что LTR не могут больше замалчиваться эффективно за счет метилирования ДНК, на этой стадии становятся более важными модификации гистонов для их репрессии 37.
Reactivation of ERVs by DNMTi and other epigenetic therapies
Поскольку метилирование цитозина является ключом к регуляции большого количества ERVs, то реактивация с помощью DNMTi является быстрой и эффективной после воздействия DNMTi. Это может порождать реакции врожденного иммунитета на изменения, воспринимаемые как инфекция ретровирусов, приводящая к активации реакции type I и type III интерферона11,12.
Было бы важно предопределить относительную роль метилирования ДНК и модификаций гистонов в замалчивании ERVs, если мы хотим разработать эффективную терапию, базирующуюся на гипотезе, что вирусная мимикрия является критическим компонентом терапевтической реакции. Важность модификаций хроматина и индивидуальных транскрипционных факторов, включая TRIM28 (известен также как TIF1β) ко-репрессор для замалчивания транскрипции ретровирусов и их активации во время специфической фазы развития, рассмотрены в др. работах 47-49. Такой кооперативный эффект метилирования ДНК и гистоновых меток также подтверждает, что комбинированная терапия с использованием разных эпигенетических лекарств может быть более эффективной в индукции более сильной и мощной экспрессии широкого диапазона ERVs. В самом деле мы установили, что метилирование ДНК ингибиторов действует более эффективно вследствие нокдауна некоторых гистон-модифицирующих ферментов 37. необходимо также исследовать возможность, что удаление одной метки, такой как метилирование ДНК, может приводить к быстрому накоплению меток альтернативного молчания, таких как H3K27me3, катализируемых с помощью EZH2. Этот процесс, наз. 'epigenetic switch' 35,36, обычно обнаруживается в онтогенетически важных генах. Др. работа продемонстрировала, что RB опухолевый супрессор может рекрутировать EZH2 на повторяющиеся регионы, включая и ERVs 50, подтверждая, что подавление EZH2 также может быть потенциальным индуктором транскрипции повторяющихся элементов при раке. Др. лекарства, нацеленные на ассоциированные с хроматином факторы, могут также оказаться способными вызывать экспрессию ERVs и активировать реакцию вирусной мимикрии; важно, что в недавней работе было показано, что подавление гистоновой demethylase LSD1 может стимулировать противоопухолевый иммунитет и возможно повышать чувствительность к блокаде иммунного checkpoint, преимущественно за счет активации ERVs и индукции реакции вирусной мимикрии 19. HDACi сами по себе или в комбинации с DNMTi также может индуцировать экспрессию в ERV LTRs, включая и локализованные в них гены, которые затем будут действовать как новые промоторы, генерирующие новые транскрипты 10. В др. примере, CDK4 и CDK6 ингибиторы, как недавно было установлено, снижают уровни DNMT1, приводя к деметилированию ДНК ERVs и активации вирусной мимикрии 51.
Consequences of ERV reactivation: increasing tumour immunogenicity
Будучи активированными повторяющиеся элементы могут формировать молекулы нуклеиновых кислот разных конфигураций, которые затем будут восприниматься аппаратом врожденного иммунитета, чтобы запускать иммунную реакцию, включая индукцию генов защиты от вирусов. Если формируется двунитевая РНК (dsRNA) за счет двунаправленной транскрипции, sense-antisense спаривания или как промежуточное образование во время обратной транскрипции, то она может ощущаться сенсорами dsRNA, известными также как pattern recognition receptors (PRRs), RIG-I, MDA5 (известен также как IFIH1) и Toll-like receptor 3 (TLR3), которые в свою очередь активируют сигнальный каскад, обеспечиваемый посредством агрегации mitochondrial antiviral-signalling protein (MAVS) и активации нижестоящего interferon regulatory factor 3 (IRF3) и IRF7 (refs11,12) (Fig. 2). Пока неизвестно, действительно ли разные классы повторяющихся элементов преимущественно активируют разные PRRs и действительно ли это будет приводить к определенным нижестоящим биологическим реакциям.
 Fig. 2: The viral mimicry state induced by epigenetic therapy.
This schematic shows the steps leading to induction of an antitumour immune response following treatment of cancer cells with epigenetic therapies. (Step 1) Reactivation of repressed endogenous retroviruses (ERVs) by epigenetic therapies such as DNA demethylating drugs and lysine demethylase 1 (LSD1) inhibitors leads to formation of double-stranded RNAs (dsRNAs).?(Step 2) The presence of these dsRNAs in the cytoplasm of cancer cells is sensed by pattern recognition receptors, such as MDA5. (Step 3) This causes mitochondrial antiviral-signalling protein (MAVS) aggregation and interferon regulatory factor 7 (IRF7) activation through TBK1 phosphorylation. (Step 4) Activated IRF7 then translocates into the nucleus to induce transcription of type I and type III interferon genes, leading to the production, transport and (step 5) secretion of type I and type III interferons into the tumour microenvironment. Индуцированная экспрессия в раковых опухолях ERV может действовать посредством множественных механизмов, наиболее выдающимся среди которых является реакция nterferon. В предыдущей работе было показано, что активация повторяющихся элементов и программы вирусной мимикрии, которая индуцируется как следствие восприятия dsRNA посредством MDA5-MAVS-IRF7, могут вызывать реакцию interferon, которая является иммуногенной, а также вредной для потенциала инициации рака в опухолевых клетках 11,12,39. Интерфероны сами по себе обладают мощными стимулирующими функциями в иммунной реакции и одним из последствий передачи сигналов активированного интерферона является индукция транскрипции аппарата презентации антигена среди широкого круга интерфероном стимулируемых генов 52 (Fig. 3). Сюда входит экспрессия аллелей major histocompatibility complex (MHC) класса I, β 2-microglobulin (β 2m), который необходим для сборки и функционирования класса I MHC, и, наконец, transporter involved in antigen processing 1 (TAP1; известен также как APT1), который участвует в транспорте пептидов для загрузки на молекулы класса I MHC 53. Этот аппарат, по-видимому, является ключевым в реакции на иммунотерапию и в cancer-immunity цикле, т.к. многие из этих генов, как известно, теряются или благодаря мутациям, вызывающим потерю функции 54-56, потере гетерозиготности 57 или потере всего стимулируемого интерфероном каскада генов благодаря потере Janus kinase (JAK)-signal transducer и пути activator of transcription (STAT). Такой сценарий часто наблюдается у пациентов, которые неспособны отвечать на иммунотерапию, т.к. приобрели резистентный фенотип 58,59. Кроме того, возможно, что эпигенетическая терапия может также усиливать экспрессию чувствительных к интерферону генов непосредственно с помощью эпигенетического репрограммирования и независимой экспрессии ERV. Напр., IFNγ-чувствительные гены CXC-chemokine ligand 9 (CXCL9) и CXCL10 могут непосредственно регулироваться с помощью метилирования ДНК и модификаций гистонов 60,61, а PDL1 может регулироваться с помощью HDACi 62.
 Fig. 3: Increased tumour immunogenicity mediated by viral mimicry.
Type I and type III interferon production induced by viral mimicry pathways will increase antigen presentation and processing on bystander cancer cells within the tumour microenvironment. Cancer cells will respond to the type I and type III interferons present in the tumour milieu, causing activation of the Janus kinase (JAK)-signal transducer and activator of transcription (STAT) pathway. Specifically, following binding of type I and type II interferons to receptor complexes and subsequent phosphorylation of these receptors by JAK1, signal transduction proceeds with the STAT heterodimers associating with interferon regulatory factor 9 (IRF9). These signalling complexes then translocate to the nucleus to induce interferon-stimulated genes from interferon-stimulated response elements (ISREs) in DNA. The result is the increased expression of antigen processing and antigen presentation machinery, increasing the ability of cancer cells to present antigens, such as mutated genes, translocations, cancer-testis antigens (CTAs) and endogenous retroviruses (ERVs). Ultimately, this process will increase the visibility of the cancer cell to the adaptive immune system. IFNAR, interferon α/β receptor; IFNLR1, interferon-λ receptor 1; MHC, major histocompatibility complex; P, phosphorylation.
Недавно получены дополнительные доказательства роли ретровирусных элементов в модулировании реакции интерферона посредством механизмов, которые не участвуют в непосредственном восприятии с помощью PRRs. Многие ретровирусные элементы функционально используются как энхансеры транскрипции интерфероном стимулируемых генов63. Более того, некоторые ретровирусные элементы, располагающиеся в 3' не транслируемых регионах (3'UTRs) стимулируемых интерфероном генов могут непосредственно активироваться в ответ на передачу сигналов интерферона. Эти 3' антисмысловые ретровирусом кодируемые последовательности ориентированы обратным образом в 3'UTRs специфических стимулируемых интерфероном генов, приводя к образованию dsRNA с помощью двунаправленной транскрипции после воздействия IFNγ. Эти dsRNAs затем могут восприниматься с помощью PRRs, поддерживая петли положительной обратной связи и умножая передачу сигнальных каскадов, ответственных за индукцию и поддержание реакций интерфероном стимулируемых соотв. генов64.
Более того, ERVs сами по себе могут быть предполагаемым источником антигенов и предполагается, что экспрессия ERVs связана с клиническими прогнозами и реакциями на иммунотерапию 9,65,66. Напр., экспрессия ERV3-2 коррелирует с активацией иммунного checkpoint в 11 солидных раках в соотв. с данными TCGA, экспрессия ERV3-2 наиболее высокая в ccRCC опухолях у пациентов, которые реагируют на блокаду PD1 или PDL1 66, а крупная популяция инфильтрирующих опухоли CD8+ T клеток в ccRCC специфична для ERV 4700 эпитопов 9. Более того, воздействие DNMTi и HDACi могут приводить к скрытой экспрессии тысяч не-аннотированных сайтов старта транскрипции, приводя к продукции укороченных или химерных белков с предсказуемым иммуногенным потенциалом. то часто вызывается с помощью однонаправленной реактивации LTRs в семействе ERV9-LTR12, открывая др. механизм действия для эпигенетической терапии помимо двунаправленной транскрипции полной длины ERVs. Наконец, было предположено, что эпигенетическая терапия может увеличивать иммуногенность опухолей с помощью транскрипции происходящих из LTR нео-антигенов, которые могут быть представлены на MHC класса I для распознавания с помощью CD8+ T клеток 10. Эти исследования подчеркивают клинический потенциал реактивации ERV человека при использовании эпигенетической терапии, чтобы модулировать иммунное TME и реакцию на иммунотерапию.
The role of CTA activation
Regulation by DNA methylation and reactivation using DNMTi
Роль почти 225 генов, которые представляют CTAs, была предметом недавнего обзора 67. Эти гены играют ключевые роли в развитии зародышевых клеток, а их экспрессия в основном, но не всегда, ограничивается присутствием в immune-privileged нишах тестисов. Однако, они часто эктопически активируются при раке. Их потенциальная функция, заключающаяся в поддержании ракового фенотипа, теперь изучена и некоторые из них обнаруживают четкие роли в организации хроматина. Напр., CTA PRAME часто обнаруживает избыточную экспрессию в раковых опухолях, таких как хроническая миелоидная лейкемия, меланома и легочная аденокарцинома и, как известно, рекрутирует EZH2 на гены, ассоциированные с гибелью клеток 68. CTAs часто являются предметом контроля метилирования ДНК в соматических клетках и они могут быть быстро и мощно реактивированы путем воздействия DNMTi, как первоначально было установлено Weber et al. 69 и позднее подтверждено нами 70. Принимая во внимание потерю иммунной привилегии, когда эти гены экспрессируются вне ткани гонад, они представляют определенный интерес как мишени для противоопухолевых иммунных реакций.
A potential target for antitumour immune responses
CTAs являются потенциальным источником новых антигенов на поверхности опухолевых клеток и существенные успехи достигнуты в разработке вакцин, которые могут целенаправленно воздействовать на CTAs; однако, клиническая успешность этих подходов не была особенно впечатляющей. Вакцинации с помощью векторов, несущих CTAs 71 и вливания с chimeric antigen receptor (CAR) T клеток, нацеленных на CTAs 72 прежде приводили к обнадеживающим реакциям у ряда пациентов с раковыми опухолями, такими как высокого риска миелома, но они также вызывали тяжелые токсикации вне мишеней в некоторых случаях, поскольку CTAs, как оказалось экспрессируются также в нормальных тканях 73 или T cell receptors (TCRs) на этих CAR T клетках, где обнаруживается перекрестная реактивность с др. белками, присутствующими в нормальных тканях 74. Однако, эти помехи в разработке CTA-управляемой иммунотерапии, не устранили их дальнейшего развития. Вместо их строгой активации после воздействия с помощью ингибиторов метилирования ДНК, было предположено, что они могут выполнять роль в предоставлении нео-антигенов на поверхности опухолевых клеток, на которые хозяин может реагировать, принимая во внимание, что они обычно экспрессируются в иммуно-толерантных сайтах. Потенциальной проблемой в разработке вакцин, целенаправленно воздействующих на эти индуцированные антигены, может быть то, что они экспрессируются гетерогенным образом в опухолях, так что вакцина целенаправленно действует только на определенный субнабор опухолевых клеток. В это контексте, CTAs д. быть аналогичны субклональным нео-антигенам, которые вызывают более бедные реакции на блокаду иммунного checkpoint 75. Однако, соединение подхода блокады иммунного checkpoint с DNMTi может оказаться более действенным за счет использования преимуществ побочного эффекта путем привлечения Т клеток к опухолям и одновременно усиливая униформную экспрессию и демонстрируя CTAs.
Epigenetic modulation of the immune TME
В дополнение к ERV-ассоциированной иммунной модуляции посредством реакции интерферона, блокада эпигенетических модуляторов может также преобразовывать иммунное TME в пользу адаптивной противоопухолевой реакции с помощью множественных механизмов.
Из перспективы приобретенного иммунитета, иммунные TMEs могут быть подразделены в соответствии с воспаленным состоянием, где T клетки активно используются и разрушают опухолевые клетки, в соответствии с immune-excluded состоянием, при котором Т клетки не могут взаимодействовать с опухолевыми клетками, и, наконец, иммунная пустыня или immune-cold состояние, при котором Т клетки отсутствуют (rev.76; Box 2). T клетки воспаленного состояния ассоциированы с каскадом цитокинов, наз. реакцией клеток типа T helper 1 (TH1), и эти иммунные сигнатуры ассоциированы с эффективным противоопухолевым иммунитетом как в предварительно обработанных раковых опухолях, так и в тех, что подвергали воздействию блокады иммунного checkpoint77,78. Очевидно, эти цитокины, как известно, супрессируются эпигенетически, по крайней мере, в некоторых модельных системах, при этом эпигенетическая блокада EZH2 и DNMT1 приводит к реактивации экспрессии цитокина TH1 типа клеток и сопровождается блокадой PDL160. В дополнение к комбинации эпигенетической терапии с DNMTi и HDACi , как было установлено, что индуцируется секреция этих цитокинов79. Более того, некоторые цитокины, такие как CC-chemokine ligand 5 (CCL5) , как известно, необходимы для рекрутирования субнабора дендритных клеток, которые являются критическими для становления T клеточного воспаленного состояния у мышиных моделей меланомы80. Эпигенетическая терапия с помощью HDACi и DNMTi , как было установлено, модулирует экспрессию гена CCL5 путем снижения уровней передачи сигналов MYC79, возможно посредством де метилирования тела гена81, предопределяя далее пути, с помощью которых эпигенетическая терапия может преобразовать TME в противоопухолевое состояние.
Ключевая потребность в иммунном ответе, управляемая с помощью CD8+ T клеток, заключается в презентации антигена посредством класса I MHC. Без этой ступени взаимодействие между TCRs на CD8+ T клетках и соотв. антигеном, не может произойти. Гены, участвующие в этом пути, транскрипционно регулируются с помощью класса I транс-активатора, кодируемого интерфероном индуцируемого гена NLRC5 (ref.82). Экспрессия класса I MHC генов замалчивается в большой фракции разных раковых опухолей, а уровни транскриптов этих генов обратным образом связаны с метилированием промотора NLRC583. Было продемонстрировано, что DNMTi может реактивировать экспрессию NLRC5 и приводить к сопутствующему увеличению экспрессии класса I MHC генов83. Итак, эти находки показывают зависимые от ERV механизмы, с помощью которых эпигенетическая терапия может модулировать иммунное микроокружение и synergize с блокадой иммунного checkpoint и противоопухолевыми эффектами, осуществляются посредством ERV-зависимых механизмов. Эпигенетическая терапия может не только изменять состав иммунного микроокружения подобным способом, но и также влиять на функцию Т клеток, уже присутствующих в опухолях, подтверждая хорошо известные роли эпигенетической регуляции в предопределении их судьбы и функции.
Наконец, важно подчеркнуть, что каждый тип иммунных клеток обладает отличающимся эпигеномным профилем, который изменяется в соответствии с их дифференцировкой, активацией и функциональным состоянием. Здесь мы сфокусировались прежде всего на CD8+ T клетках, но важно упомянуть, что метилирование ДНК и состояние хроматина играют вездесущую роль в нормальном функционировании, а также в нарушении функции при раке многих др. субнаборов иммунных клеток, присутствующих в TME. Напр., эпигенетические изменения ассоциируют с поляризацией макрофагов, функцией супрессорных клеток, происходящих из миелоида, превращением фибробластов в ассоциированные с раком фибробласты, развитие и функция регуляторных T cell (Treg cell), среди множества др. иммунных типов клеток 84-87.
|
Box 2 Exogenous stimulation of immune function
The immune microenvironment in tumours may be classified into three broad subtypes: inflamed tumours, where a T cell infiltrate is actively engaged in an immune response with cancer cells; an excluded subtype, where T cell infiltrates are present but are not interfacing with the cancer cells, thereby resulting in a failure to mount an effective, inflammatory, antitumour adaptive response; and an immune-cold subtype, wherein T cells are absent from the tumour microenvironment76. Immune-cold and immune-excluded tumours may still have cancer cells that are vulnerable to immune attack, and the failure to mount an effective immune response may have been due to inadequate fulfilment of the steps that define and perpetuate a cancer-immunity cycle108. | Одним из методов становления воспаленного состояния является стимулирование реакции врожденного иммунитета, которая может влиять инструкциями на опухолевой микроокружение, чтобы осуществить сдвиг в том направлении, где воспалительная адаптивная реакция оказывается возможной. Существует множество агентов, которые были разработаны с этой целью или были найдены сначала как эффективные, а позднее были связаны механистически с этим подходом. Самым старым прецедентом потенциального использования этого иммуномодуляторного подхода стал набор Coley's токсинов, которые состоят из бактериальных продуктов, которые позднеет были идентифицированы как агонисты Toll-like receptor (TLR), в качестве средства регрессии опухолей 109. Недавно локальное применение агонистов TLR, таких как imiquimod стало частью клинического применения при кожных злокачественных новообразоаниях, таких как поверхностные базальноклеточные карциномы 110. Сходным образом, и др. агенты находятся на преклинических и клинических испытаниях, чтобы достичь эффективного действия врожденного иммунитета, включая poly(ICLC), которые продемонстрировали некоторую эффективность в качестве автономного воздействия с помощью инъекций внутрь опухоли в случае рака головы и шеи 111 и при использовании в качестве vaccine adjuvant путем вакцинации персонализованных нео-антигенов при меланоме 112, и разные агонисты cyclic GMP-AMP synthase (cGAS)-stimulator of interferon genes (STING) (ДНК сенсор) 113,114. Наконец, онколитические вирусы были преобразованы и использованы в качестве средства модификации опухолевого микроокружения. Впечатляющий пример касается granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)-секретируемый вирусом herpes simplex (talimogene laherparepvec), который эффективно устанавливает воспалительное микроокружение опухоли и synergizes с блокадой programmed cell death 1 (PD1) в меланоме, чтобы продуцировать удивительно высокую скорость завершающей реакции 115, и онколитические polioviruses 116, которые модифицируют иммунное микроокружение при glioblastoma 117 и обеспечивают устойчивую реакцию у некоторых пациентов с многообещающим урегулированием болезни. Итак, клиническая пригодность таких подходов подтверждает, что активация путей, чтобы преобразовать локальную среду врожденного иммунитета является жизненно важной стратегией для облегчения более эффективного противоопухолевого иммунитета. Очевидно, эпигенетическая терапия также модулирует сходные пути путем активации эндогенных повторяющихся последовательностей и транскриптов, которые используют соотв. паттерн распознавания рецепторов и тем самым вызывают те же самые фенотипические эффекты, как и упомянутые выше агенты.
Epigenetics in T cell fate and function
Role of DNA methylation in T cell states
В терминах своей онтогенетической траектории CD8+ T клетки грубо могут быть классифицированы как являющиеся 'нативными' перед воздействием на них антигена и после экспозиции антигена, как являющийся 'эффектором', с реакцией, направленной против клеток, обладающих соотв. антигенами. 'Состояние памяти', при этом в некоторых CD8+ T клетках сохраняется, чтобы управлять будущими реакциями после повторной стимуляции антигеном, в результате происходит прогрессия от нативных к эффекторным memory T клеток88. На эпигенетическом уровне стимуляция антигенами мышиных CD8+ T клеток вызывает крупно-масштабное эпигенетическое моделирование, при этом сотни из тысяч регионов генов метилируются дифференциально, включая замалчивание критических транскрипционных факторов, подобных T клеточному фактору 7 (Tcf7), деметилирование и активацию эффекторных генов, подобных генам, кодирующим IFNγ (Ifng) granzyme B (Gzmb) экспрессию репрессивных иммунных checkpoints, таких как ген, кодирующий PD1 (Pdcd1)89.
Иммунопреципитация хроматина, сопровождаемая секвенированием (ChIP-seq) мышиных CD8+ T клеток после воздействия вируса гриппа, выявили сложные паттерны, включая потерю репрессивного H3K27 триметилирования (H3K27me3) с бивалентных хроматиновых меток (H3K4me3 и H3K27me3) в генах, ассоциированных с клеточной репликацией и дифференцировкой в эффекторных и memory T клетках, и с избытком ранее отсутствовавшей гистоновой метки, H3K4me3, в иммунном эффекторном генетическом локусе после стимуляции и дифференцировки 90. Более того, отличающиеся паттерны метилирования ДНК отличают эффекторные CD8+ T клетки от нативных T клеток, независимо от потенциала памяти, в исследованиях с использованием инфекции lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). Однако, имеются дальнейшие de novo изменения метилирования, которые возникают в памяти предшественников эффекторных T клеток и эти вновь приобретенные состояния метилирования ДНК характеризуют нативные CD8+ T клетки в memory фазе. Напр., цитозольные эффекторы Gzmb и perforin 1 (Prf1) являются не метилированными как в memory предшественниках, так и в терминальных эффекторах, тогда как др. гены в memory предшественниках стремятся к подобному нативному состоянию метилирования, включая CC-chemokine receptor 7 (Ccr7), ген, кодирующий L-selectin (Sell) и Tcf7 (ref.88). Безусловно de novo природа событий гиперметилирования при дифференцировке и становлении иммунологической памяти устраняется посредством генетического удаления Dnmt3a у мышей 88. Сходные изменения предположительно возникают в присутствии раковых антигенов. Т.о., на уровне как модификации хроматина, так и метилирования ДНК эпигенетические программы в конечном итоге связаны с дифференцировкой и детерминацией судеб CD8+ T клеток. Следовательно, эти процессы создают пути для модуляции судеб и функции Т клеток для использования в эпигенетической терапии.
Reprogramming T cell exhaustion with DNMTi and immune checkpoint inhibitors
Функция Т клеток является исключительно функцией Т клеток, зависящей от динамики взаимодействий с загружаемым антигеном. Первоначально обнаруженная при хронической вирусной инфекции LCMV, устойчивая стимуляция с помощью антигенов приводит к неспособности большого количества эффективных иммунных реакций, несмотря на присутствие активированных Т клеток, которые тем не менее не обладают эффекторной активностью и экспрессируют высокие уровни ингибирующих рецепторов, процесс, наз. T клеточным истощением91. Это состояние Т клеточного истощения позднее распознается также и на определенных CD8+ T клетках в TME. Блокада PD1 может устранять истощение Т клеток в ограниченной степени в условиях хронической вирусной инфекции и ассоциирует с reinvigoration специфического субнабора частично истощенных CD8+ T клеток, обеспечиваемого умеренными уровнями экспрессии PD1, тогда как более истощенные CD8+ T клетки неспособны реагировать92. Сходным образом, в модели LCMV, специфический субнабор CD8+ T клеток транскрипционно сходен с CD4+ фолликулярными TH клетками, а CD8+ memory предшественники представляют популяцию, которая реагирует на блокаду PD1 посредством пролиферативного взрыва93. Следовательно, это, скорее всего, транскрипционно отличающееся состояние CD8+ T клеток, обеспечивающее реакцию на блокаду PD1. Безусловно, этот процесс ,как было установлено, преходящий, т.к. reinvigoration CD8+ T в модели LCMV является короткоживущей, и T клетки возвращаются к дисфункциональному состоянию после снятия блокады PD1 в линии с крупно-масштабными изменениями доступности хроматина15.
Различия в доступности хроматина также демаркируют дисфункциональные Т клетки от функциональных memory T клеток, включая экспрессию гена, кодирующего PD1, подтверждая, что эпигенетические программы также обусловливают истощение 14. Это ставит вопрос, действительно ли блокада иммунного checkpoint может успешно омолаживать истощенные Т клетки, которые эпигенетически репрограммированы. В самом деле, два самостоятельных функциональных состояния достигаются в опухолях у мышей в отношении способности к репрограммированию, пластическое дисфункциональное состояние, которое может быть устранено, и фиксированное состояние дисфункции, при котором подобное восстановление функции эффектора недостижимо 17. Дисфункциональное состояние особенно заметно при отсутствии доступности хроматина Ifng, ключевого эффекторного цитокина TH1 клеток, а избыток энхансера для Pdcd1, сходен с тем, что при вирусной инфекции, это еще больше подтверждает существование эпигенетичеких программ, обеспечивающих истощение, как имеющее отношение к противоопухолевому иммунитету (Fig. 4).
Fig. 4: Epigenetic reprogramming during CD8+ T cell dysfunction.
Naive CD8+ T cells encountering their cognate tumour antigen will activate into a functional effector state characterized by the induction of transcriptional programmes that drive rapid expansion, expression of key cytokines, such as interleukin-2 (IL-2) and interferon-γ (IFNγ), and effector proteins necessary for cell killing, such as granzymes and perforins, and the capacity to migrate into tumour tissue.? These changes are accompanied by an epigenome-wide remodelling. However, continuous antigen stimulation can lead to a dysfunctional state, where CD8+ T cells become non-responsive. The dysfunctional state can be subdivided into an initial plastic dysfunctional state, from which T cells can be rescued, and later on a fixed dysfunctional state, in which the cells are resistant to reprogramming. Both dysfunctional states are characterized by distinct chromatin states. The goal of immunotherapy is to revert the dysfunctional state into a functional effector state. However, it may be necessary to combine immunotherapy with epigenetic therapy to revert the fixed dysfunctional state (denoted by the dashed arrow).
Истощенный фенотип обычно приписывается крупно-масштабному de novo метилированию ДНК с помощью DNMT3A на пост-эффекторной стадии, а генетическое устранение Dnmt3a приводит к заметному улучшению продукции эффекторных цитокинов, несмотря на хроническую TCR стимуляцию, которая определяет истощение в мышиной модели инфекции LCMV 16. Более того, программы метилирования ДНК были индуцированы с помощью хронической TCR стимуляции даже при генерации высоко функциональных memory T клеток в случае острой инфекции LCMV и целенаправленного воздействия Tcf7, Ccr7, Ifng и Myc, а также ключевых ассоциированных с истощением транскрипционных факторов Tbet (известен также как Tbx21) и Eomes. Блокада PD1 сама по себе не стирает этих программ, указывая, что метилирование ДНК и изменения в доступности хроматина являются единым целым для преходящей природы reinvigoration, индуцируемой с помощью блокады PD1, и эти программы сохраняются опухоль инфильтрирующими лимфоцитами и anti-LCMV лимфоцитами. Однако, устранение Dnmt3a, также как и предварительная обработка ДНК деметилирующим агентом decitabine перед блокадой PD1, приводят к фенотипам выраженной Т клеточной экспансии и к повышению контроля за опухолью у мышей 16, указывая тем самым, что подходы по восстановлении функции (functionalize) эпигеномов окончательно истощенных, не способных к репрограммированию Т клеток, скорее всего, будут заметно усиливать эффективность блокады иммунного checkpoint.
Future perspectives
In summary, the work reviewed here suggests a prominent role for activation of ERVs and a viral mimicry state with concomitant bystander increases in antitumour immune response as being important mechanisms for the success of epigenetic therapy. This highlights the potential for combining these agents with immunotherapy approaches. In addition to the translational implication of these findings, they also raise more fundamental biological questions. For instance, if epigenetic mechanisms play a key role in silencing immunogenic ERVs, is it possible that somatic cells use ERVs and viral mimicry as an 'epigenetic checkpoint' to recognize and eliminate cells with deleterious loss of heterochromatin that would otherwise allow genomic instability8? Moreover, the work reviewed here also suggests a prominent role for modulating immune cells by epigenetic therapy. This is a paradigm shift from the traditional goal of reprogramming cancer cells. Therefore, much more research is necessary to understand how dosing and scheduling of these drugs in the clinical setting will modulate the immune response.
Finally, as a counterbalance, it is worth noting that epigenetic therapy can also be immunosuppressive. EZH2 inhibition and DNA demethylating agents were shown to decrease graft-versus-host disease in mice after allogeneic bone marrow transplant, favouring the differentiation of immunosuppressive Treg cells94,95. In addition, DNMTi can upregulate PD1 in T cells in patients with MDS and AML, possibly limiting the efficacy of epigenetic therapy in the absence of immunotherapy96. Therefore, more research is still needed to identify the best approaches to induce pro-immunogenic versus immunosuppressive properties using epigenetic therapies.
|