GSDI, также называется болезнью von Gierke, характеризуется отсутствием продукции эндогенной глюкозы из-за дефицита активности G6Pase. Точнее, GSDIa и GSDIb вызываются мутациями в генах, кодирующих каталитическую субъединицу G6Pase комплекса (G6PC1) или glucose-6 phosphate transporter (SLC37A4 или G6PT), соотв.^6-9 Мутации потери функции в этих двух субъединицах приводят к тяжелой гипогликемии после кратковременного периода голодания, которое может оказаться фатальным, если не вмешаться. Пациенты с GSDI обнаруживают также гепатомегалию и нефромегалию из-за аномального хранения гликогена в печени и почках. В самом деле, накопление glucose-6 phosphate, возникающее в результате снижения гидролиза в глюкозу, приводит к полному перепрограммированию печеночного и почечного метаболизма, характеризующемуся повышенным оборотом глюкозы и активацией de novo липогенеза и пути pentose phosphate.^10-12 Как следствие, GSDI пациенты обнаруживают раздутые гепатоциты и клетки почечного эпителия из-за накопления высоких уровней гликогена и липидов, что приводит к ожирению печени, повреждениям почек и вторичным биохимическим аномалиям, включая hyperlactatemia, hyperuricemia и hyperlipidemia.^8,9 Гепатоцеллюлярные аденомы (HCAs) возникают у 70-80% пациентов старше 25 лет с высокой вероятностью трансформации в гепатоцеллюлярные карциномы (HCCs), которые могут потребовать трансплантации печени.^3,9 В самом деле, мы обнаружили сходство в метаболизме GSDI гепатоцитов и опухолевых клеток, оба характеризуются повышенной клеточной пролиферацией и потерей некоторых опухолевых супрессоров.¹⁰ Большинство GSDI пациентов старше 25 лет имеет почечную болезнь.⁹ Исследования на мышиных моделях показали, что накопление липидов ответственно за почечные нарушения, приводящие к хронической почечной болезни (CKD),^11,13,14, которая может потребовать диализа или трансплантаций почек пациенту.^8,9 GSDI также обнаруживают кишечные симптомы, которые оказываются более серьезными при GSDIb.⁹ При GSDIb, в отличие от GSDIa, у пациентов присутствуют тяжелые инфекционные осложнения, обусловленные neutropenia и функциональными дефектами нейтрофилов и моноцитов.⁹ При GSDI, нормогликемия поддерживается частыми приемами пищи, обогащенной сырым кукурузным крахмалом, даже ночь или постоянным питанием через трубочку.^9,15 Чтобы ограничить накопление гликогена и жира д. быть исключены лактоза, фруктоза и продукты, содержащие свободные сахара. Т.о., частое питание в дневное время, внутрижелудочные постоянные вливания и строгий пищевой режим позволяют контролировать гипогликемию и уменьшать метаболические нарушения. Хотя строгий метаболический контроль может задержать или в некоторых случаях привести к регрессии долговременных осложнений при GSDI, печеночные и/или почечные трансплантации являются единственным лечением при этой болезни.^9,16-20

GSDIII или болезнь Cori вызывается мутациями в AGL, что приводит к снижению активности GDE, который деградирует разветвленный гликоген.²¹ Дефицит GDE приводит к накоплению аномального гликогена (наз. limit dextrin) практически во всех тканях. GSDIII имеет разные признаки, затрагивающие в целом как печень, так и мышцы (тип IIIa, представляющий 85% случаев) или только печень (ип IIIb; ~15% случаев). Болезнь проявляется в детстве гепатомегалией, гипогликемией и гиперлипидемией. Пищевой режим базируется на частых приемах пищи, обогащенной сырым кукурузным крахмалом, как и в случае GSDI, чтобы предупредить гипогликемию и гиперкетонемию.^21,22 Отличием от GSDI пациентов является то, что активация глюконеогенеза запускается диетой, обогащенной белками и жирами, которая позволяет лучше контролировать уровни глюкозы в крови у GSDIII пациентов.^21-26 Несмотря на это во время детства контроль гликемии у GSDIII пациентов совершенно изменчивый и они переживают эпизоды угрожающей жизни тяжелой гипогликемии. У большинства GSDIII пациентов гепатомегалия и контроль гликемии улучшается с возрастом. Однако, уменьшение размера печени может быть обманчивым из-за прогрессирующего печеночного цирроза и печеночной недостаточности.^21,27,28 Недавние результаты показали, что пролиферация и дифференцировка звездчатых клеток приводит к развитию фиброза, который играет центральную роль в прогрессировании печеночной болезни.²⁹ В редких случаях описываются HCA и HCC.^27,28 Кроме того, плазматические transaminases обычно повышены у GSDIII пациентов, подтверждая тяжелые печеночные повреждения.²¹ На мышечном уровне подъем creatine kinase, мышечные боли после упражнений и дистальная и проксимальная миопатии описываются у пациентов с GSDIII.^21,30-32 Непереносимость упражнений, по-видимому, только частично связана с низким уровнем глюкозы в крови.³³ Тщательная характеристика мышечных функций показывает прогрессирующую дегенерацию, начинающуюся в третей декаде.^30,31 В целом гипотония и мышечная слабость приводят к непереносимости упражнений и в некоторых случаях к потере самостоятельного хождения. Вовлечение сердца связано с гипертрофией левого желудочка или др. формами гипертрофии у 58% молодых пациентов (средний возраст: 20.6 лет в пределах 1-64.1).²¹ В некоторой группе, 15% пациентов имеют кардиомиопатию, характеризующуюся тяжелой непереносимостью к упражнениям и/или использованию фармакологического лечения симптомов сердечной недостаточности. Важно, что диета богатая жиром, белками и бедная углеводами может вызывать улучшения кардиальных проявлений.²³

Итак, GSDI и GSDIII характеризуются накоплением гликогена в печени, что прямо или косвенно вызывает стресс действительно во всех гепатоцитах, приводя к аномалиям паренхимы печени и печеночным осложнениям. Интересно, что усиление пролиферации гепатоцитов наблюдается при GSDIa и GSDIII задолго до образования печеночных опухолей.^10,29 Кроме того, метаболизм гепатоцитов, охарактеризованный у GSDIa мышей был очень сходен с таковым в опухолевых клетках,^10,12 указывая на высокий потенциал трансформации GSDI гепатоцитов. Принимая во внимание риск возникновения опухолей у GSDI и GSDIII пациентов, важно определить остаточный уровень активности, необходимый , чтобы избежать развития опухолей длительное время.

Др. важным свойством, общим двум болезням, является проявления во многих органах. Помимо гипогликемии и печеночной патологии, встречаются почечные, миелоидные или мышечные осложнения у GSDI и GSDIII пациентов и нуждаются в лечении. При GSDI, краткосрочные наблюдения за трансплантированными пациентами и одновременная трансплантация печени и почек делают профилактику заболеваний почек путем трансплантации печени все еще открытым вопросом.^34,35 У животных моделей GSDI, нацеленная на печень терапия не предупреждает дегенерации почек и CKD в течение длительного времени.^36,37 Кроме того, целенаправленная делеция G6Pase в почках оказывается достаточной, чтобы индуцировать характерную для GSDI нефропатию у мышей.¹³ Сходным образом, у GSDIII пациентов трансплантации печени не устраняют кардиальные и мышечные функциональные нарушения,^38,39 и нацеленная на печень, и нацеленная на мышцы генотерапия необходимы для устранения фенотипических отклонений у модельных мышей с GSDIII.⁴⁰ Т.о., ключевой проблемой для успешной генотерапии при GSDI и GSDIII является разработка инструментов генотерапии, эффективной для почек и мышц помимо печени, что делалао бы эффективной генотерапию, нацеленную на печень. ⁴⁴ Более того, печень является предпочтительной мишенью для AAV векторов, благодаря её уникальным анатомическим свойствам с фенестрированным эндотелием, что приводит к эффективному накоплению AAV векторов внутри печени после системного применения. Кроме того, AAV геномы относительно стабильны в покоящихся гепатоцитах, обычно находясь в эписомной форме.^45,46

Начиная с идентификации молекулярных основ GSDs, были тестированы разные подходы к восстановлению экспрессии мутантных белков и устранению болезненного фенотипа у животных моделей печеночных GSDs. Векторы, использованные для доставки откорректированной копии трансгена, включали аденовирусы,^47-50 лентивирусы,^51,52 и голую ДНК в комбинации с ультразвуковой доставкой.⁵³ Начиная с 2006, AAV становятся векторами выбора для замещения генов при печеночных GSDs. Недавно были использованы мРНК липидные наночастицы для целенаправленного воздействия на редкие генетические метаболические болезни⁵⁴ и GSD.⁵⁵ Преимущества и ограничения этих терапевтических стратегий для доставки ДНК или РНК в клетки обсуждаются.^56,57

Более 20 лет тому назад доступность мышиных и кроличьих моделей GSDIa и GSDIb стимулировали разработку стратегий по гено-замещению для этих болезней. К сожалению, эти животных модели страдают от тяжелой гипогликемии и обнаруживают очень низкую продолжительность жизни, что делает их непригодными для изучения эффектов генной терапии на GSDI долгосрочные осложнения. В целом у G6pc-/- мышей или собак, чтобы избежать преждевременной смерти, перед инъекцией AAV проводилась глюкозотерапия, то есть инъекции глюкозы, дача обогащенной глюкозой воды или пищевых добавок. Недавно получены ткане-специфические нокаутные модельные мыши с увеличенной продолжительностью жизни.⁵⁸ Печень-специфические G6pc-/- мыши воспроизводят печеночные болезни человека, включая непереносимость голодания, метаболические нарушения и возникновение опухолей,⁵⁹ тогда как почечно-специфичные G6pc-/- мыши обладают CKD, как это описано для GSDIa пациентов.^11,13

Др. важным преимуществом GSDI относительно AAV генотерапии является то, что G6PC или G6PT трансгены являются относительно короткими и это предоставляет относительную свободу для выбора элементов, составляющих трансгены экспрессирующие кассету (Table 1).

Table 1. Adeno-associated viral vector-based gene therapies in hepatic glycogen storage diseases type I и type III

Наконец, восстановление низкого уровня активности печеночной G6Pase достаточно , чтобы контролировать гликемию. В самом деле, первые данные, полученные при AAV генотерапии у собачьих и мышиных моделей GSDIa, подтвердили, что низкие уровни экспрессии G6PC трансгена, т.е. составляющие 3-5% от активности дикого типа (WT), были достаточны для предупреждения гипогликемии.^60-62 Сходным образом, при GSDIb, генотерапия с помощью AAV векторов приводит к улучшению жизнеспособности и долговременной коррекции гипогликемии у G6pt-/- мышей, в дозах сравнимых с теми, что использованы при GSDIa.^63,64 Как и ожидалось, благодаря очень низкой величине интеграции AAV векторов, генотерапия вызывала временное исправление миелоидных аномалий у G6pt-/- мышей.⁶³

Однако, эти пионерские исследования подчеркнули и некоторые ограничения AAV генотерапии при GSDI. Во-первых, воздействие на 2-недельных мышей приводит к потере генома вектора возможно из-за дегенерации печени и почек, лежащих в основе патологии болезни, и/или роста печени.³⁷ Несмотря на разбавление вектора коррекция печеночных нарушений была стабильной до 6 мес. у мышей и 1 года у собак после использования AAV8 вектора, экспрессирующего G6PC трансген.⁶⁵ Долговременные исследования, проведенные на собаках сообщают от прогрессирующей потере трансгена, так что необходимо более трех повторных применений AAV векторов, псевдотипированных на разных серотипах, чтобы избежать IgG-обусловленной нейтрализации и достигнуть устойчивой эффективности (Table 1).^36,66-68 Необходимость одновременного воздействия на печень и почки составляет второй технический барьер для коррекции болезни при системном уровне с некоторыми AAV серотипами, которые оказались очень не эффективными при целенаправленном воздействии на почки. ^37,65 Несмотря на эти ограничения, коррекция болезней почек и печени частично достигается с помощью однонитчатых AAV1 векторов.⁶⁹ Отличающиеся от WT AAV, который имеет однонитчатый (ssAAV) геном, рекомбинантные AAV векторы могут быть одно- и двунитчатыми геномами. Использование двунитчатых AAV (dsAAV) векторов может улучшить эффективность трансдукции и геномную стабильность AAV вектора.^70,71 Соотв., при GSDIa, dsAAV9 векторы делают возможной эффективную экспрессию G6PC в печени и почках и устраняют накопления гликогена, гликемию и восстанавливают функцию почек.⁷² Однако, была получена низкая эффективность трансдукции и потеря экспрессии трансгена в почках после длительного времени (~1 год после инъекции вектора), подтверждая, что дегенерация ткани, ассоциированная с болезненным состоянием, не полностью корректируется с помощью генотерапии.⁷² Др. возможная причина низкого сохранения трансгена G6PC может быть обусловлена формированием иммунной реакцией на анти-трансген, приводящей к очистке клеток, экспрессирующих трансген. Ранние находки показали, что использование конституитивного промотора (cytomegalovirus early enhancer/chicken beta actin promoter [CAG]) , чтобы экспрессировать G6PC было ассоциировано с более высокими CD8 позитивными инфильтратами в печени и низким сохранением трансгена.⁷³ Однако, подобная трансген-экспрессирующая кассета была использована, чтобы трансдуцировать гепатоциты при GSDIa у собак без каких либо доказательств иммунной реакции, даже после повторного применения.⁶⁸ Это указывает на то, что анти-трансгенная иммунная реакция может играть маргинальную роль в низкой персистенции трансгена, наблюдаемой у разных модельных животных.

Второе ограничение касается предупреждения долговременных печеночных и почечных осложнений, превалирующих в популяции GSDI,⁹ при AAV генотерапии. Пре-клинические исследования, проведенные на G6pc-/- мышах показали, что долговременная экспрессия трансгена G6PC, находящегося под транскрипционным контролем промотора G6PC человека (hGPE) , предупреждает образование печеночных опухолей (Table 1).^61,62,74,75 Поученные результаты показали, что низкий процент активности G6Pase (более 2% от нормальной активности G6Pase) может быть достаточен, чтобы избегнуть формирования HCA у GSDIa мышей.⁶¹ У GSDIb модельных мышей самый высокий процент (6-8%) активности WT G6PT необходим, чтобы предупредить образование HCA у 60-78-недельных животных.⁶³ Предупреждение возникновения опухолей с помощью AAV генотерапии у GSDIa собак менее четкое и противоречивое. В самом деле, в одном исследовании, несмотря на высокую активность G6Pase activity (21% - 52% от нормальной печеночной активности G6Pase), 4 из 5 обработанных собак обнаруживали образование HCA и HCC.³⁶ Более того, у 3-х из 5 обработанных собак three of возникала CKD из-за очень низкой почечной трансдукции.³⁶ Во втором исследовании ни у одной из собак не возникали долговременные осложнения.⁶⁷ эти отличия приписываются строгому контролю за приемом пищи, что позволило лучше контролировать печеночную дегенерацию, это может объяснить и улучшение эффективности генотерапии^76,77 и подтверждает использование комбинированной терапии при переносе гонов⁷⁸ Однако, необходимо отметить, что во втором исследовании подвергшиеся лечению GSDIa собаки обнаруживали зависимое от времени снижение в крови глюкозы и гибели в среднем возрасте 5.9 лет, несмотря на строгий метаболический контроль и последовательное применение двух AAV векторов.⁶⁷

Эксперименты, проводимые более 20 лет завершились фазой 1/2 клинического испытания с открытой меткой (NCT03517085; Ultragenyx Pharmaceutical, Inc.). Полученные предварительные результаты от трех пациентов в группе снизкой дозой (2.0 х 10¹² vg/kg) продемонстрировали эффективность в среднем с 80% улучшением во время гипогликемического события вместе с 38% снижением ежедневного потребления кукурузного крахмала.⁷⁹ Использование AAV8 векторов, экспрессирующих человеческий G6PC в низкой дозе, было ассоциировано с подъемом alanine aminotransferase (ALT) у двух из трех пациентов.⁷⁹ Базируясь на полученных результатах клинического испытания с использованием AAV8 при гемофилии B, подъем ALT, наблюдаемый при испытании GSDIa, скорее всего, ассоциирован с иммунной реакцией на капсиду AAV вектора и может контролироваться кратким курсом кортикостероидов.⁸⁰ Однако, кинетика образования иммунной реакции у пациента 1, которому потребовалось два воздействия кортикостероидами на 8 и 20 неделе, может указывать на др. механизм по сравнению с испытанием при гемофилии B⁸⁰ Принимая во внимание демонстрацию эффективности и приемлемый профиль безопасности, Data Monitoring Committee осторожное позитивное решение о продолжении испытания с привлечением ещё двух пациентов с воздействием дозы 6.0 х 10¹² vg/kg.