Антитела против активированной микроглии (CD68) и астроцитов (glial fibrillary acid protein, GFAP) были использованы, чтобы оценить пространственно-временное нейральное воспаление и глиоз nGD мышей. В отличие от дикого типа (WTs) и гетерозигот, симптоматика головного мозга на день после рождения (P)12 у нокаутов обнаруживает существенную и широко распространённую активацию микроглии (Supplementary Fig. 1c) особенно в Gi ствола головного мозга, VPM/VPL и в слое V в S1BF. Ни один из регионов не был обойден (Supplementary Table 1). Это подтверждается иммуно-окрашиванием по второму маркеру микроглии, Iba1 (Supplementary Fig. 1f). Значительный астроглиозис (Supplementary Fig. 2c) был подтвержден с помощью порогового анализа и слепой оценки (Supplementary Table 2). В предсимптоматическом возрасте P8, головной мозг нокаутных мышей обнаруживал достоверную активацию микроглии (Supplementary Fig. 1b) и астроцитов (Supplementary Fig. 2b) в таламусе и стволе мозга. Слепая оценка (Supplementary Tables 1 and 2) и Iba1 иммуногистохимия (Supplementary Fig. 1e) предоставили подтверждение. Даже у P1 новорожденных наблюдалась достоверная активация астроцитов (Fig. 1a-c) и микроглии (Fig. 1d-f) в стволе мозга.

">

Fig. 1: Brain disease at birth in nGD mice.

a, GFAP immunostaining in newborn knockout, heterozygous and WT brains. Scale bar, 1?mm. b, Higher magnification of a in the somatosensory barrel field cortex (S1BF), ventral posteromedial/posterolateral nuclei (VPM/VPL) and gigantocellular nucleus (Gi). Scale bar, 0.25?mm. c, Quantification of b (two-way analysis of variance (ANOVA), Tukey's multiple comparison). d, CD68 immunohistochemistry in newborn knockout, heterozygous and WT brains. Scale bar, 1?mm. e, Higher magnification of d. Scale bar, 0.25?mm f, Quantification of e (two-way ANOVA). g, Mass spectrometry analysis of glucosylceramide isoforms, glucopsychosine and lyso-lactosylceramide in knockout, heterozygote and WT brains (two-way ANOVA on log-transformed data; Bonferroni's multiple comparison). Numbers of mice are stated under each group.

Потеря нейронов была количественно определена с помощью серологической оценки Nissl-окрашенных коронарных срезов. Имеется достоверная потеря нейронов в коре, таламусе и стволе мозга нокаутов на ст. P12 (Supplementary Fig. 3b), это приводит к пространст, лишенных клеток, или с крупными вакуолями или скоплениями липидов, определяемыми окраской с помощью hematoxylin и eosin (Supplementary Fig. 3c). У нокаутов на ст. P8 обнаруживается достоверная потеря нейронов коры и среднего мозга (Supplementary Fig. 3a). Потеря нейронов коррлирует с активацией микроглии и астроцитов и согласуется с находками у умеренных моделей nGD³, обнаруживается достоверное истончение коры в S1BF (Supplementary Fig. 3d); однако, не обнаруживаются различия в объёме (Supplementary Fig. 3e).

В отсутствие функциональной glucocerebrosidase (GCase), её субстрат, glucosylceramide (D-glucosyl-β1-1'-N-acyl-D-erythro-sphingosine), и родственные сфинголипиду виды накапливаются у людей и мышиных моделей⁴. В целом glucosylceramide и glucosylsphingosine повышены более чем в 20 раз при рождении у nGD мышей⁵, но небыли определены концентрации др. видов glucosylceramide и ближайших метаболитов. Мы исследовали временной профиль гомогенатов из целого головного мозга, используя жидкостную хроматографию и tandem mass spectrometry. У нокаутов все виды glucosylceramide за исключением C24:0-OH и C24:1-OH были достоверно увеличены на ст. P1, C18:0 и C16:0 и были наиболее многочисленны (Fig. 1g и Supplementary Fig. 4a); glucosylpsychosine был наиболее увеличен (Supplementary Table 3). На ст. P8 и P12, они оставались наиболее высокими как в абсолютных (Supplementary Fig. 4b,c) , так и относительных (Supplementary Table 3) терминах. Как и ожидалось gangliosides GM1a, GD1a, GD1b и GTb оставались неизменными у нокаутов независимо от возраста (Supplementary Fig. 4d-f).

Активация маркеров нейро-воспаления и glycosphingolipids на ст. P1 к нокаутов подтверждают, что профилактическая in utero генотерапия может быть успешной. Мы выбрали adeno-associated virus serotype 9 (AAV9)⁶, как и др.⁷, и наблюдали широко распространенную нейрональную экспрессию green fluorescent protein (GFP), после внутричерепной инъекции у плодов. Мы исследовали профиль экспрессии после введения AAV9 вектора, кодирующего GFP под управлением β-glucuronidase (GUSB) промотора⁸ (Supplementary Fig. 5a). На 16 день беременности плоды получали 5 µl AAV9 вектора (5х10¹⁰ геномных копий) в боковые желудочки. В 30-дневном возрасте сильная двухсторонняя флюоресценция распространялась от обонятельных луковиц в ствол головного мозга (Supplementary Fig. 5b). Двухсторонняя экспрессия и значительное распространение из префорнтальной коры в мозжечок и ствол мозга было подтверждено иммуногистохимически (Supplementary Fig. 5c). Многие GFP-экспрессирующие клетки с морфологией нейронов наблюдались в коре, стриатум, гиппокампе, таламусе, мозжечке и стволе мозга (Supplementary Fig. 5d)...

Генотерапия предупреждает потерю нейронов у нокаутов в таламусе и Gi (Fig. 2d). Окрашивание двумя anti-GCase антителами показало, что нормальная экспрессия энзима восстанавливается, хотя каждая осуществляется за счет разных способностей. Специфичные к С-концу антитела показали, что WT и обработанные AAV9 нокауты обнаруживают разные GCase иммунореактивности в нейронах, которая полностью отсутствует у необработанных нокаутов. Напротив, N-терминальные антитела выявляют строго окрашивание глии скорее, чем нейронов во всех кортикальных слоях, которое отсутствует в WT головном мозге. После воздействия на нокауты AAV9 окрашивание обнаруживалось в нейронах в более глубоких кортикальных слоях, но не в глие (Fig. 2e)...