Посещений:
БОЛЕЗНЬ ХАНТИНГТОНА (HUNTINGTON’S DISEASE)



Генотерапия

Combination of stem cell and gene therapy ameliorates symptoms in Huntington’s disease mice
In Ki Cho,Carissa Emerson Hunter, Sarah Ye et al.
Regenerative Medicine volume 4, Article number: 7 (2019)

Huntington's disease (HD) моногенное наследственное нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующей атрофией в головном мозге полосатого тела, коры и др. регионов головного мозга, ассоциированной с когнитивными, поведенческими и моторными нарушениями.1-5 Фактором, вызывающим HD, является мутация в экзоне 1 гена huntingtin (HTT), вызывающая экспансию polyglutamine (polyQ) остаток на N-конце белка HTT.1,6,7 Начало и тяжесть болезни зависят от размеров участка polyQ.8 Накопление олигомерного mutant HTT (mHTT) и формирование ядерных включений являются характерными признаками неqропатологии этой болезни.1,9,10 Однако, роль mHTT в патогенезе HD остается неясной. Множественные места протеолитических разрезов создают уникальные паттерны сплайсинга в белке HTT и продуцируют разные N-терминальные фрагменты.1,6,7 Более того, увеличенные участки polyQ провоцируют аберрантный сплайсинг белка HTT, что приводит к возникновению небольших олигомерных фрагментов.1,9,11 Эти олигомерные фрагменты образуют складки, формируют агрегаты, накапливаются в клетках и нарушают клеточные функции.1,9,10 HD остается неизлечимой и поиск эффективного лечения продолжается.
Недавние успехи в репрограммирование клеток предоставили уникальную возможность получать induced pluripotent stem cells (iPSCs) из собственных клеток пациента, делая их идеальным источником клеток для персональной заместительной терапии стволовых клеток с минимальной или отсутствием иммунологического отторжения. Подобно embryonic stem cells (ESCs), iPSCs являются плюрипотентными и способны дифференцироваться во многие типы клеток всех клонов. Однако, пациенты с наследственными генетическими мутациями, таrими как увеличенные polyQ при HD, нуждаются в генетической коррекции перед клеточной терапией. Описаны терапевтические эффекты однонитчатых РНК, mismatch-containing RNAs, antisense oligonucleotide (ASO), small hairpin RNA (shRNA), zinc finger nuclease (ZFN) и Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9 , воздействующих на ген mHTT специфически или не специфически.12-22 одним из основных затруднений, связанным с подходом геномного редактирования с помощью ZFN или CRISPR/Cas9 является неспецифическое воздействие на mHTT аллель и необратимое редактирование генома, особенно нормального HTT аллеля. Хотя устранение HTT у взрослых мышей не вызывает вредных эффектов,23 долговременные эффекты устранеия HTT и эффекты вне мишени при редактировании генома всё ещё обнаруживаются. В недавнем исследовании устранение Htt у взрослых мышей выявило достоверное снижение моторной и поведенческой активности.24 В отличие от редактирования гена, замалчивание гена с помощью shRNA и mHTT понижающей терапии, такой как ASO, являются наиболее подходящими для лечения HD. Недавнее клиническое испытание IONIS-HTTRx (ASO) и WVE-120101 (ASO) оказалось обнадеживающим для лечения HD.25 Однако, ограничения, связанные с методами доставки и биораспределения ASO, RNAi и др. терапевтических реагентов в головной мозг остаются главными препятствиями переноса в клинику.
Трансгенные обезьяны, моделирующие HD, были впервые описаны в 2008 и продолжительные исследования показали прогрессирующие нарушения когнитивной и моторной функции, прогрессивное уменьшение объёма и дегенерацию полосатого тела, снижение N-acetylaspartate (NAA) и прогрессирующие изменения белого вещества во всем головном мозге.26-28 Эти состояния воспроизводят те, что наблюдаются у пациентов с HD, и могут служить моделями при преклинической оценке эффективности новых терапевтических подходов. Мы создали стабильные линии neural progenitor cell (NPC) из WT и HD обезьянних iPSCs29, которые способны дифференцироваться в нейроны in vitro.22,30,31 Далее мы продемонстрировали трансплантировнные NPC в полосатое тело мышей с combined immunodeficiency (SCID) способны дифференцироваться в нейроны, не вызывая возникновения опухолей.22
В этом исследовании мы оценивали эффективность использования комбинированного воздействия стволовых клеток и генотерапии путем трансплантации NPCs, происходящими от WT и HD обезьян, и HD-NPC, экспрессирующих shRNA против HTT (HD-shHD-NPCs) у HD мышей. Мы продемонстрировали, что трансплантации HD-shHD-NPC существенно увеличивают продолжительность жизни HD мышей по сравнению с инъекциями плацебо. Также обе группы HD-shHD-NPC и WT-NPC обнаруживали достоверное улучшение моторной функции у HD мышей по сравнению с трансплантациями HD-NPC и инъекциями плацебо. Более того, мы показали, что трансплантированные клетки были способны дифференцироваться в MAP2, GABA и GFAP экспрессирующие клетки, которые служили маркерами нейронов и астроцитов.
Итак, мы продемонстрировали эффективность комбинированной стволовыми клетками и генотерапии у трансгенных HD мышей (N171-82Q; HD mice), используя от резус обезьян (Macaca mulatta) NPCs. Мы получили обезьяньи NPC клеточные линии из iPSCs, которые могли дифференцироваться в GABAergic нейроны in vitro, а также в головном мозге мышей. NPCs от обезьян дикого типа (WT-NPCs), NPCs , происходящие от трансгенных HD обезьян (HD-NPCs), и генетически модифицированные HD-NPCs с пониженными уровнями mHTT за счет стабильной экспрессии small-hairpin RNA (HD-shHD-NPCs), были трансплантированы в полосатое тело WT и HD мышей. Мыши, которые получали трансплантаты HD-shHD-NPC, обнаруживали достоверное увеличение продолжительности жизни по сравнению с группами с инъекциями плацебо и HD. Трансплантанты WT-NPC и HD-shHD-NPC у мышей HD обнаруживали достоверное улучшение моторной функции. Иммуногистохимия продемонстрировала интеграцию и дифференцировку.