Huntington's disease (HD) моногенное наследственное нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующей атрофией в головном мозге полосатого тела, коры и др. регионов головного мозга, ассоциированной с когнитивными, поведенческими и моторными нарушениями.1-5 Фактором, вызывающим HD, является мутация в экзоне 1 гена huntingtin (HTT), вызывающая экспансию polyglutamine (polyQ) остаток на N-конце белка HTT.1,6,7 Начало и тяжесть болезни зависят от размеров участка polyQ.8 Накопление олигомерного mutant HTT (mHTT) и формирование ядерных включений являются характерными признаками неqропатологии этой болезни.1,9,10 Однако, роль mHTT в патогенезе HD остается неясной. Множественные места протеолитических разрезов создают уникальные паттерны сплайсинга в белке HTT и продуцируют разные N-терминальные фрагменты.1,6,7 Более того, увеличенные участки polyQ провоцируют аберрантный сплайсинг белка HTT, что приводит к возникновению небольших олигомерных фрагментов.1,9,11 Эти олигомерные фрагменты образуют складки, формируют агрегаты, накапливаются в клетках и нарушают клеточные функции.1,9,10 HD остается неизлечимой и поиск эффективного лечения продолжается.
Недавние успехи в репрограммирование клеток предоставили уникальную возможность получать induced pluripotent stem cells (iPSCs) из собственных клеток пациента, делая их идеальным источником клеток для персональной заместительной терапии стволовых клеток с минимальной или отсутствием иммунологического отторжения. Подобно embryonic stem cells (ESCs), iPSCs являются плюрипотентными и способны дифференцироваться во многие типы клеток всех клонов. Однако, пациенты с наследственными генетическими мутациями, таrими как увеличенные polyQ при HD, нуждаются в генетической коррекции перед клеточной терапией. Описаны терапевтические эффекты однонитчатых РНК, mismatch-containing RNAs, antisense oligonucleotide (ASO), small hairpin RNA (shRNA), zinc finger nuclease (ZFN) и Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9 , воздействующих на ген mHTT специфически или не специфически.12-22 одним из основных затруднений, связанным с подходом геномного редактирования с помощью ZFN или CRISPR/Cas9 является неспецифическое воздействие на mHTT аллель и необратимое редактирование генома, особенно нормального HTT аллеля. Хотя устранение HTT у взрослых мышей не вызывает вредных эффектов,23 долговременные эффекты устранеия HTT и эффекты вне мишени при редактировании генома всё ещё обнаруживаются. В недавнем исследовании устранение Htt у взрослых мышей выявило достоверное снижение моторной и поведенческой активности.24 В отличие от редактирования гена, замалчивание гена с помощью shRNA и mHTT понижающей терапии, такой как ASO, являются наиболее подходящими для лечения HD. Недавнее клиническое испытание IONIS-HTTRx (ASO) и WVE-120101 (ASO) оказалось обнадеживающим для лечения HD.25 Однако, ограничения, связанные с методами доставки и биораспределения ASO, RNAi и др. терапевтических реагентов в головной мозг остаются главными препятствиями переноса в клинику.
Трансгенные обезьяны, моделирующие HD, были впервые описаны в 2008 и продолжительные исследования показали прогрессирующие нарушения когнитивной и моторной функции, прогрессивное уменьшение объёма и дегенерацию полосатого тела, снижение N-acetylaspartate (NAA) и прогрессирующие изменения белого вещества во всем головном мозге.26-28 Эти состояния воспроизводят те, что наблюдаются у пациентов с HD, и могут служить моделями при преклинической оценке эффективности новых терапевтических подходов. Мы создали стабильные линии neural progenitor cell (NPC) из WT и HD обезьянних iPSCs29, которые способны дифференцироваться в нейроны in vitro.22,30,31 Далее мы продемонстрировали трансплантировнные NPC в полосатое тело мышей с combined immunodeficiency (SCID) способны дифференцироваться в нейроны, не вызывая возникновения опухолей.22
В этом исследовании мы оценивали эффективность использования комбинированного воздействия стволовых клеток и генотерапии путем трансплантации NPCs, происходящими от WT и HD обезьян, и HD-NPC, экспрессирующих shRNA против HTT (HD-shHD-NPCs) у HD мышей. Мы продемонстрировали, что трансплантации HD-shHD-NPC существенно увеличивают продолжительность жизни HD мышей по сравнению с инъекциями плацебо. Также обе группы HD-shHD-NPC и WT-NPC обнаруживали достоверное улучшение моторной функции у HD мышей по сравнению с трансплантациями HD-NPC и инъекциями плацебо. Более того, мы показали, что трансплантированные клетки были способны дифференцироваться в MAP2, GABA и GFAP экспрессирующие клетки, которые служили маркерами нейронов и астроцитов.
Итак, мы продемонстрировали эффективность комбинированной стволовыми клетками и генотерапии у трансгенных HD мышей (N171-82Q; HD mice), используя от резус обезьян (Macaca mulatta) NPCs. Мы получили обезьяньи NPC клеточные линии из iPSCs, которые могли дифференцироваться в GABAergic нейроны in vitro, а также в головном мозге мышей. NPCs от обезьян дикого типа (WT-NPCs), NPCs , происходящие от трансгенных HD обезьян (HD-NPCs), и генетически модифицированные HD-NPCs с пониженными уровнями mHTT за счет стабильной экспрессии small-hairpin RNA (HD-shHD-NPCs), были трансплантированы в полосатое тело WT и HD мышей. Мыши, которые получали трансплантаты HD-shHD-NPC, обнаруживали достоверное увеличение продолжительности жизни по сравнению с группами с инъекциями плацебо и HD. Трансплантанты WT-NPC и HD-shHD-NPC у мышей HD обнаруживали достоверное улучшение моторной функции. Иммуногистохимия продемонстрировала интеграцию и дифференцировку.