Посещений:
болезни лизосомного накопления



Генотерапия сердечных проявлений

Effects of gene therapy on cardiovascular symptoms of lysosomal storage diseases
Edina Poletto, Gabriela Pasqualim, Roberto Giuglian, et al.
Genet. Mol. Biol. vol.42 no.1 supl.1 Ribeir?o Preto 2019 Epub May 23, 2019 http://dx.doi.org/10.1590/1678-4685-gmb-2018-0100

Lysosomal storage diseases (LSDs) - это группа наследственных нарушений, характеризующихся нарушениями функции лизосом из-за накопления не деградирующих или частично деградировавших метаболитов. Известно более 50 нарушений, вызываемых главным образом дефицитом лизосомных энзимов, а также снижением функции мембранных белков или не энзиматических растворимых белков, что в конечном итоге приводит к накоплению субстрата, снижению лизосомного трафика и к дисфункции клеток (Platt et al., 2012; Boustany, 2013).
Даже если LSDs являются моногенными, фенотипические отклонения могут варьировать существенно между индивидами с одной и той же болезнью в зависимости от профиля мутации - поскольку некоторые аллели продуцируют белки с остаточной активностью, а др. приводят к полной потере функции. Следовательно, клинический спектр среди LSDs варьирует в основном в соответствии с остаточной функцией белка в дополнение к типу накапливаемого метаболита (Segatori, 2014).
LSDs являются мультисистемными и прогрессирующими, обычно не обнаруживающимися при рождении, но приводящие к преждевременной гибели при отсутствии лечения (Platt et al., 2012). Распространенными симптомами, общими для большинства из них, являются увеличение размеров органов, когнитивные нарушения, дефекты скелета и грубые лицевые признаки, всё это в разной степени (Ortolano et al., 2014). Некоторые затрагивают сердечно-сосудистую систему, тогда сердечная недостаточность становится главной причиной гибели (Braunlin et al., 2011).
В этом контексте дефекты метаболизма гликогена, липидов или гликозамингликанов приводят к нарушениям продукции энергии, изменениями клеточного гомеостаза и последующей кардиомиопатии (Guertl et al., 2000). Болезни, такие как glycosphyngolipidoses, mucopolyssacharidoses и накопления гликогена, обычно характеризуются значительными сердечно-сосудистыми проявлениями, включая гепертрофическую и дилятационную кардиомиопатию, болезнь коронарных артерий и болезнь клапанов (Linhart and Elliott, 2007) (Table 1).

Table 1 Lysosomal storage diseases with cardiovascular involvement.

Современное лечение для LSDs, такое как внутривенная enzyme replacement therapy (ERT) и hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), обычно вызывают удовлетворительную реакцию в некоторых висцеральных органах, таких как печень и селезенка, но они недостаточны для коррекции специфических тканевых проявлений в головном мозге, костях и некоторых сердечно-сосудистых симптомов. ЦНС трудна для воздействия из-за гемато-энцефалического барьера, который в основном непроницаем для экзогенных энзимов и большей части лекарственной терапии, использующей обычные пути применения (Parenti et al., 2013). Кости обычно реагируют плохо на лечение из-за низкого кровоснабжения, что мешает достигать затронутой области (Clarke and Hollak, 2015). Соотв., сердечно-сосудистые структуры, такие как клапаны сердца и аорта, также плохо васкуляризированы (Ma et al., 2007; Brands et al., 2013).
Большинство терапевтических подходов к LSDs базируется на событии перекрестной коррекции, при которой клетки могут потреблять внеклеточные лизосомные энзимы - применяемые экзогенно или секретируемые др. клетками - посредством рецепторов mannose-6-phosphate (M6P) и маршрутов их к лизосомам, при этом pH кислая и они могут работать нормально (Sands and Davidson, 2006). Кроме того, предполагается, что восстановление лишь 10% ферментативной активности является достаточным, чтобы предотвратить или даже обернуть вспять большинство клинических проявлений (Leinekugel et al., 1992; Sands and Davidson 2006). Следовательно, модификация немногих клеток может быть достаточной для достижения удовлетворительной терапии при некоторых LSDs.

Gene therapy


Исключительной причиной генотерапии является генетическая модификация клеток мишеней (Cotrim and Baum, 2008). Генотерапия типично применяется для коррекции мутантных генов или для добавления функциональных копий необходимой последовательности, хотя она может также использоваться, чтобы вызвать новые функции в клетках или даже замалчивать гены с избыточной экспрессией. Разные её подходы зависят от патологического состояния и ткани мишени (Collins and Thrasher, 2015).
Для LSDs, генотерапия, по-видимому, обладает огромным потенциалом. В противовес ERT, многообещающая генотерапия заключается в том, что метод переноса хорошего гена д. обходить гемато-энцефалический барьер и модифицировать клетки головного мозга, которые, в свою очередь, будут продуцировать отсутствующие энзимы и возможно тормозить проявления в ЦНС (Zhang et al., 2011).
Существуют разные способы доставки интересующего гена в клетки: используя вирусные или не вирусные векторы, а также осуществляя перенос генов in vivo или ex vivo. Простейшим способом доставки гена является клонирование его в плазмиде вместе с регуляторными последовательностями, которые обеспечивают его транскрипцию, а затем инъецировать его в клетки - это, однако, мало эффективно. Хотя не вирусные векторы очень безопасны, благодаря своей эписомной конформации и очень низкой иммуногенности, их главным недостатком является низкая эффективность трансфекции. Были разработаны многие стратегии для улучшения не вирусной доставки генов (Wang et al., 2013; Jayant et al., 2016), такие как электропортация, выстреливание генов, гидродинамические инъекции, носители, базирующиеся на нанотехнологии (Schuh et al., 2016), минициркулярные ДНК (Osborn et al., 2011) и транспозоны (Aronovich et al., 2009), но у всех у них остается низкая эффективность трансфекции и специфические ограничения процедур.
Вирусные векторы являются рекомбинантными вирусами, лишенными последовательности для ауторепликации, это обеспечивает только одним, необходимым для трансдукции клетки, плюс интересующим геном. Поэтому они всё ещё экспрессируют поверхностные белки, специфичные для определенного типа клеток, это позволяет трансгену проникать возможно посредством клеточного эндоцитоза, но они неспособны реплицироваться и лизировать клетки(Wang and Gao, 2014). Процесс трансдукции клеток обычно очень эффективен, что делает вирусные векторы преимущественным выбором во многих исследованиях. Большинство использую ретровирусы (RV), лентивирусы (LV), аденовирусы (AV) и adeno-associated virus (AAV).
Адено-ассоциированные вирусы обладают строгим тропизмом к определенным типам клеток благодаря своему серотипу капсид, гарантирующему целенаправленное воздействие на специфическую ткань (Wu et al., 2006). Они лишены иммуногенности и имеют стабильную эписомную конформацию ДНК, которая способствует долговременной экспрессии трансгена с минимальным риском инсерционного мутагенеза. AAV векторы единственные способны к инсерции небольших трансгенных кассет, менее чем в 5Kb (Salganik et al., 2015).
Вирусные векторы постоянно улучшаются для разработки надежных версий путем удаления последовательностей, взаимодействующих с соседними генами (такими как Long Terminal Repeat, LTR), или предупреждающих инсерционный мутагенез путем мутирования integrase или используя инструменты для редактирования генов для прямой интеграции в определенные сайты (Wang and Gao, 2014).

Gene therapy in LSD


Проводится множество исследований по генотерапии при LSDs с разными типами векторов, административных протоколов и/или вспомогательных лекарств. Сообщения, связанные с эффектами генотерапии на сердечную систему, всё ещё находятся на преклинической стадии.

Glycogen Storage Diseases (GSD)


Pompe Disease (GSD Type II a)


Pompe disease или Glycogen Storage Disease type II a (GSD-IIa), вызывается дефицитом лизосомной acid α-1-4-glucosidase (GAA). При этом нарушении гликоген накапливается в основном внутри сердца и мышц, среди др. органов. Болезнь сердца характеризуется гипертрофической кардиомиопатией, повышенной жесткостью аорты (Wens et al., 2014), широкими высоковольтными комплексами QRS, и коротким интервалом PR на ЭКГ (ECG) (Linhart and Elliott, 2007).
Генотерапия для GSD-IIa активно исследуется, при этом многие отличающиеся подходы сфокусированы в основном на коренном улучшении скелетных и сердечных мышц. В одном исследовании описывается использование лентивирусов с положительными результатами на сердце, в виде снижения накопления гликогена (Kyosen et al., 2010), хотя большинство опубликованных работ описывает попытки улучшить эффективность трансдукции и контроль иммунной реакции с использованием или аденовирусов или AAV.
В 1998, протокол генотерапии "был разработан" с использованием инъекций в миокард аденовирусного вектора с GAA (AV-GAA) новорожденным крысам (Pauly et al., 1998). Активность GAA измеряли в экстрактах из целого сердца на 7-й день, когда животных забивали, и было выявлены 10-кратные значения по сравнению с контрольными группами (не подвергавшихся воздействия или получавших плацебо). При этом не выявлено вредных эффектов ни в одной из групп. Впоследствии анализ последовательностей векторов в разных органах показал, что активность GAA, наблюдаемая в сердце, была обусловлена трансдукцией клеток в печени, которая функционирует как фабрика ферментов, которые могут быть поглощены другими органами (Pauly et al., 2001). Этот результат подтолкнул др. исследования, сконцентрированные на эффективности трансдукции в печени или мышцах, чтобы продуцировать достаточные количества энзимов для всего тела.
Сходные исходы наблюдались и при использовании аденовирусов, при этом также наблюдали при использовании молодых (Ding et al., 2001) и старых (Xu et al., 2005) GAA-нокаутных (GAA-KO) мышей. Несмотря на первоначальные обнадеживающие результаты, снижение гликогена в мышцах старых животных было отмечено. Среди др. возможностей была высказана одна, что слияние эндосом, содержащих GAA с предсуществующими лизосомами, полными гликогена, может нарушать ферментативную активность, т.к. GAA-KO пожилые мыши характеризуются дефицитом активности активных и правильно преобразованных GAA.
Относительно терапии с помощью AAV векторов, новорожденные мыши, получавшие вектор с цитомегаловирусным промотором (CMV) AAV1-CMV-GAA внутривенно, обнаруживали в результате первоначально supraphysiologic уровни GAA в сердцах, с соотв. снижением уровней энзима по мере старения мышей (Mah et al., 2005). После этого функция сердца оценивалась с помощью ЭКГ и AAV1-обработанные животные обнаруживали достоверно удлиненный интервал PR, со значениями между необработанными GAA-KO и дикого типа мышами. Более того, масса левого желудочка была очень сходной с дикого типа соотв. возраста контролем. Хотя биохимический, гистологический и функциональный анализ демонстрировал улучшения в сердечной ткани после AAV1 терапии, она лишь частично корректировала патологию (Mah et al., 2007).
Многие AAV векторы с разными промоторами и серотипами, обеспечивали безопасное и эффективное увеличение активности GAA и уменьшение отложений гликогена в сердцах GAA-KO мышей (Table 2), такие как AAV2 (Fraites et al., 2002), AAV7-MCK (MCK - Muscle Creatine Kinase Promoter) (Sun et al., 2005a), AAV2/8 (Franco et al., 2005; Sun et al., 2005b; Wang et al., 2014), AAV8/DC190 (DC190 - Human Serum Albumin Promoter) (Ziegler et al., 2008) и AAV9-DES (DES - Desmin Promoter) (Falk et al., 2015), этот последний приводил также к элонгации интервала PR, повышению фракции выброса и уменьшению массы левого желудочка. Комбинация AV и AAV также была эффективной в отношении долговременной продукции GAA в сердце, даже если вводились в мышцу gastrocnemius (Sun et al., 2003).

Table 2 Effects of gene therapy on cardiovascular system in Glycogen Storage Diseases (Pompe Disease).

Одним из главных недостатков вирусных векторов является возникновение иммунной реакции, против самого вектора или против трансгена, вызываемым экспрессией вирусом GAA, это снижает эффективность терапии, поскольку anti-GAA антитела, по-видимому, подавляют перекрестную коррекцию периферических тканей. Xu et al. (2004) проиллюстрировали это, использовав GAA-KO/SCID (SCID - Severe Combined Immunodeficiency) мышей для анализа реакции на AV-GAA терапию в условиях иммунодефицита и пришли к выводу, что отсутствие anti-GAA антител, обнаруживаемое у GAA-KO/SCID мышей возникает в результате более высокой активности GAA , а устранение гликогена сохраняется дольше, чем в предыдущих исследованиях с использованием иммунокомпетентных GAA-KO мышей (Xu et al., 2004). Использовали многие стратегии: предварительное воздействие GAA чтобы вызвать толерантность (Cresawn et al., 2005) или воздействие anti-CD4, чтобы подавить образование антител (Han et al., 2015); приспособления в разработке векторов, использовав кодон-оптимизированные GAA, управляемые не вирусными промоторами (Kiang et al., 2006; Doerfler et al., 2016). Интересно, что предварительная обработка с генотерапией с использованием AAV2/8 может предупредить формирование IgG антител позднее при ERT, действуя как pre-conditioning терапия, которая может повышать эффективность ERT (Han et al., 2017).
Недавно использовали salmeterol, агонист β2-рецептора в качестве вспомогательного средства, т.к. это лекарство может усиливать экспрессию катион-независимого mannose-6-phosphate рецептора (CI-M6PR) и тем самым улучшать реакцию на ERT или генотерапию сердечной ткани (Han et al., 2016). Такое воздействие повышает шансы реакции сердца на генотерапию, но необходимо дальнейшие тестирование.
Помимо сравнения между разными векторами или условиями предварительного воздействия, постоянно анализируются альтернативные маршруты введения. Внутрисердечное (Pauly et al., 1998; Fraites et al., 2002), внутримышечное (Sun et al., 2003, 2010), внутриплевральное (Falk et al., 2013) и внутриоболочечное (intrathecal) (Hordeaux et al., 2017) введение уже были протестированы и установлена трансдукция различных тканей. Из них внутримышечное введение ограничивало эффект местом инъекции (Sun et al., 2003, 2010), тогда как intrathecal инъекции AAV9 вектора неожиданно приводили к уменьшению накапливания субстрата в сердце и соотв. к уменьшению толщины стенки левого желудочка (Hordeaux et al., 2017). Внутриплевральное введение AAV9 также ослабляло кардиальные симптомы, это сопровождалось улучшением фракции выброса и объема инфаркта (Falk et al., 2013).
В противовес др. LSDs, трансплантации гематопоэтических стволовых клеток оказались не эффективным подходом при GSD-II (Watson et al., 1986) несмотря на то, что HSC были модифицированы ex vivo, чтобы они продуцировали избыточные уровни энзима, достаточные для перекрестной коррекции периферических тканей (van Til et al., 2010). Поэтому эта стратегия была протестирована вместе с исследованием лентивирусных векторов, когда HSC получали от доноров GAA-KO мышей, модифицированных in vitro и трансплантированных внутривенно GAA-KO мышам реципиентам после сублетального облучения. Это первое исследование (Douillard-Guilloux et al., 2009) не обнаружило достоверного улучшения позднее в сердцах обработанных животных (van Til et al., 2010) , правда выявлено улучшение эхокардиографических показателей, сопровождаемое снижением относительных масс правого и левого желудочков и восстановлением активности GAA со значительным уменьшением гликогена в сердце. Др. стратегии оказались более эффективными в контексте GSD-II.
Наконец, для оценки безопасности и эффективности у др. модельных животных, Rastall et al. (2016) использовали бабуинов, которым посредством катетра вводили helper dependent adenovirus (HD-AV), экспрессирующий GAA, затем происзодилась оценка с помощью Western Blot и ферментативного анализа.

Mucopolysaccharidoses (MPS)


MPS Type I


MPS I (Hurler, Scheie или Hurler-Scheie болезнь) вызывается мутациями в гене IDUA, приводящими к дефициту α-L-iduronidase (IDUA), фермента, необходимого для пути деградации glycosaminoglycans (GAGs) heparan и dermatan sulphate. Наиболее распространенными сердечно-сосудистыми проявлениями являются дилятационная кардиомиопатия, аномалии сердечных клапанов, такие как утолщение клапанов, стеноз и regurgitation, болезнь коронарных артерий, обусловленная диффузной пролиферацией интимы вокруг отложений GAG и расширением аорты с редуцированной эластичностью аорты (Braunlin et al., 2011). Более того, сердечно-сосудистые осложнения, такие как сердечная недостаточность, внезапная гибель от аритмии и закупорки коронарных артерий, являются главными причинами смертности (Braunlin et al., 2011).
Проведены многочисленные исследования с использование генотерапии для лечения мышей, собак и кошек, моделирующих MPS I (Table 3), у которых также обнаруживаются кардиальные болезни, хотя и с небольшими отличиями (Jordan et al., 2005; Braunlin et al., 2006; Sleeper et al., 2008). Большинство из этих исследований сконцентрировано на ЦНС и нейрологических проявлениях с ограниченным анализом сердца только в отношении активности IDUA и отложений GAG в сердце. Некоторые работы описывают использование лентивирусов (Di Domenico et al., 2005; Kobayashi et al., 2005; Ou et al., 2016), адено-ассоциированных вирусов (Hartung et al., 2004) и не вирусных ДНК минициркулярных векторов (Osborn et al., 2011), Sleeping Beauty транспозонов (Aronovich et al., 2009), и микрокапсул, содержащих рекомбинантные клетки с избыточной экспрессией IDUA (Baldo et al., 2012; Lizzi Lagranha et al., 2017) для лечения MPS I. Результаты от всех их показывали увеличение активности IDUA и снижение хранилищ GAG в сердце после лечения.

Table 3 Effects of gene therapy on cardiovascular system in the Mucopolysaccharidoses.

Ma et al. (2007) воздействовали на 6-недельных MPS I вышей, вводя внутривенно RV экспрессирующий собачий IDUA под контролем специфичного для печени Human α 1-Antitrypsin Promoter (hAAT-cIDUA-WPRE) и Woodchuck Hepatitis Virus Post-Transcriptional Regulatory Element (WPRE),это приводило к умеренному улучшению сердечно-сосудистых структур у животных, экспрессирующих стабильную активность энзима в сыворотке. Лизосомные накопления достоверно уменьшались в аортальных клапанах и паренхиме сердца, но не в аорте. Аорта в этом случае у мышей оставалась расширенной с фрагментированными эластичными волокнами (Ma et al., 2007). Соотв., в др. исследовании (Herati et al., 2008), активность энзима составляла 37% от нормы в аорте RV леченых мышей, уровни GAG оставались высокими в этой ткани и у 75% обработанных животных развивалась недостаточность аорты.
С др. стороны, исследование с использованием новорожденных MPS I собак и RV hAAT-cIDUA-WPRE генотерапии продемонстрировало существенное улучшение болезни сердца, сопровождаемое уменьшением диаметра аорты, утолщения митрального клапана и фрагментации эластических волокон (Traas et al., 2007). Ферментативная активность, обнаруживаемая в сердце и аорте составляла 30% и 20% от нормы, соотв., и бло уменьшено лизосомные накопления в обеих тканях. Более того, при MPS I у кошек (Hinderer et al., 2014), был использован AAV8 вектор, экспрессирующий кошачий IDUA с помощью печень-специфического промотора. Аорта и миокард демонстрировали тотальное исправление повреждений накопления, а клапаны аорты обнаруживали почти полное восстановление у животных с устойчивой экспрессией энзима. Кроме того, структуры коллагена в фиброзном слое клапанов у леченных кошек были очень сходны с таковыми в норме. Одна кошка обнаруживала снижение активности IDUA и соотв. имела плохой исход, но антитела против IDUA не были обнаружены с помощью ELISA тестов.
В др. исследовании MPS I мышей лечили высокими дозами RV hAAT-cIDUA-WPRE, что приводило к обнадеживающим результатам: the эхокардиограмы у леченных мышей были полностью нормальными - не обнаружено достоверных изменений толщины стенки, индекса массы левого желудочка или конечного размера камеры левого желудочка в конце диастолы - не обнаружено дилятации аорты или аортальной недостаточности (Liu et al., 2005). Кроме того, отсутствовали лизосомные накопления в большинстве регионов аорты, митральных клапанах и миокарде при использовании высоких доз RV, тогда как они присутствовали у контрольной группе. Высокие дозы RV давали 9-кратное по сравнению с нормой увеличение активности IDUA в сердце и аорте. Уровни hexosaminidase - лизосомного энзима с повышенной активностью, обусловленной вторичными эффектами MPS I - также были нормальными, как и уровни GAG в обоих органах. Интересно, что низкими дозами RV, леченные MPS I мыши, обнаруживают 14% от нормальной активности IDUA в аорте и этого было недостаточно для предупреждения болезни сердца, что можно бы объяснить неравномерным распределением фермента по структуре (Liu et al., 2005).
Наконец, немногие исследования использовали HSCT вместе с генотерапией, модифицированных ex vivo клеток с избыточной экспрессией IDUA при использовании вирусных векторов. Первоначально, в исследовании использовали ретровирусный вектор, содержащий IDUA, только одна из каждых 10 леченных мышей обнаруживала умеренное улучшение в сердце (Jordan et al., 2005). С др. стороны, Visigalli et al. (2010) сравнивали нормальные и модифицированные HSC от MPS I доноров, чтобы обеспечить избыточную экспрессию IDUA посредством трансдукции с помощью лентивируса. Уровни IDUA в плазме были значительно выше при использовании модифицированных HSC, чем в др. группах и в результате приводили к почти полному отсутствию лизосомных хранилищ и др. патологических состояний, тогда как трансплантации нормальных HSC давали лишь умеренное улучшение. Это исследование подчеркивает тот факт, что полное устранение кардиальных проявлений в очень значительной степени зависит от supraphysiologic уровней фермента, иначе лечение оказывается неэффективным для hard-to-target органов (Visigalli et al., 2010).

MPS Type II


MPS II (Hunter болезнь) является X-сцепленным рецессивным заболеванием, вызываемым дефицитом iduronate 2-sulfatase (IDS), приводящим к накоплению dermatan и heparan sulfate. Вовлечение сердца такое же как и при MPS I, но пациенты с MPS II могут также обнаруживать нарушения проводимости сердца и синусовую тахикардию (Braunlin et al., 2011).
Поиски генотерапии MPS II начались в 1990 с модификаций in vitro клеток, экспрессирующих IDS, базируясь на вирусных векторах (Braun et al., 1993, 1996 Whitley et al., 1996; Di Francesco et al., 1997; Stroncek et al., 1999) и на не вирусных подходах в 2002 (Tomanin et al., 2002). Только в 2006 появилась первая работа, описывающая in vivo генотерапию MPS II (Cardone et al., 2006), после создания мышиной модели. Трансдукция была нацелена на печень, с использованием AAV2/8-TBG-IDS вектора. В последнем случае наблюдалась повышенная активность IDS в сердце, а также опорожнение лизосомных хранилищ GAG. Др. анализы, касающиеся сердечно-сосудистой функции, не были осуществлены. Затем были использованы др. мышиные модели и сходные векторы (Jung et al., 2010). Когда был применен плазмидный вектор в мышце quadriceps с использованием electro-gene переноса, то активность IDS не обнаруживалась в висцеральных органах, включая сердце, оставалась ограниченной областью инъекции (Friso et al., 2008). Три недавних исследования описывают ЦНС-нацеленное введение AAV9 у MPS II мышей, приведшее к увеличению активности IDS в сердце и к коррекции лизосомных накоплений (Laoharawee et al., 2017; Motas et al., 2016) или к частичному снижении GAG хранилищ (Hinderer et al., 2016). Т.к. орган не содержал достаточного количества копий AAV, то было предположено возникновение перекрестной коррекции дефицита IDS благодаря проникновению энзима в кровообращение.
Исследования (Visigalli et al., 2010), Wakabayashi et al. (2015) показали, что ex vivo генотерапия HSC с использованием лентивирусных векторов улучшает биохимические аномалии у MPS II мышей, включая сердце, повышая активность IDS более чем в 3 раза по сравнению с нормой и нормализуя содержание GAG в лизосомах. К сожалению, эхокардиографический анализ не проводился (Wakabayashi et al., 2015).

MPS Type IV A


MPS IV A (Morquio A болезнь) вызывается отложениями keratan и chondroitin sulfate, обусловленными дефицитом лизосомного энзима N-acetylgalactosamine-6 sulfatase (GALNS). Клинические находки обычно включают сердечно-сосудистые нарушения, с умеренной митральной и аортальной regurgitation и утолщением клапанов (Hendriksz et al., 2013). Сердечная недостаточность является наиболее частой причиной гибели пациентов (Rigante and Segni 2002).
Первое сообщение о генотерапии MPS IV A приходится на 2001, когда фибробласты пациентов и клетки др. линий были трансдуцированы in vitro с помощью ретровирусного вектора, содержащего кДНК GALNS и эффективно продуцировали недостающий фермент от 5 до 50 раз выше по сравнению с базовой активностью фермента в нормальных клетках (Toietta et al., 2001). Только одна работа описала использование генотерапии in vivo у MPS IV A мышей, которые подвергнуты действию AAV вектора, несущего кДНК GALNS. Спустя 12 недель после воздействия активность GALNS составляла около 30% от дикого типа в сердце (Tomatsu et al., 2014).

MPS Type VI


MPS VI (Maroteaux-Lamy синдром) аутосомно рецессивная болезнь, вызываемая мутациями в гене arylsulfatase B (ARSB), приводящей к снижению или отсутствию активности фермента arylsulfatase B (ARSB), ответственной за разрушение dermatan sulphate. Кардиальная болезнь частая у MPS VI пациентов и является важной причиной болезненности смертности (Braunlin et al., 2011). Распространенными признаками являются стеноз и/или недостаточность клапанов, при этом митральные клапаны затрагиваются у 96% пациентов (Valayannopoulos et al., 2010).
Генотерапия MPS VI в основном использует AAV векторы, предназначенные для целенаправленного воздействия на печень, используя этот орган в качестве фактории, который секретирует достаточно энзимов, чтобы влиять на все тело. Тесты были осуществлены на кошках и крысах и было обнаружено усиление активности ARSB и очистки от GAG в сердцах обоих модельных животных после внутривенного или внутримышечного введения AAV (Tessitore et al., 2008). Внутримышечное введение обнаруживало положительную реакцию в висцеральных органах, возможно из-за протекания вектора в др. ткани, следовательно, трансдукция др. типов клеток скорее, чем перекрестная коррекция. Кроме того, было выявлена гуморальная иммунная реакция у крыс в результате разрушения уровней ARSB. Последующее исследование (Cotugno et al., 2010), с тем же самым AAV2/8-TBG-hARSB вектором с печень-специфическим промотором TBG (Thyroxine Binding Globulin), с внутривенным введением у MPS VI крыс, новорожденных и молодых одновременно с введением иммуносупрессивных лекарств (IS) для минимизации возможной отрицательной реакции, вызываемой иммунной реакцией. GAG хранилища в сердечных клапанах были одинаковы у леченных AVV и не леченных MPS VI крыс, тогда как они были уменьшены в группе AAV+IS. Несмотря на это результаты варьировали существенно и не получено воспроизводимых результатов у модельных кошек, это может быть объяснено смешанным генетическим фоном у этих моделей и различиями в осуществлении опытов.
Cotugno et al. (2011) использовали тот же самый AAV2/8-TBG-fARSB вектор внутривенно у 5 и 50-дневных MPS VI кошек (newborn and juvenile groups, respectively). Вскоре после введения высоких доз вектора (6 x 1013 gc/kg) у 5-дневных котят активность в сыворотке ARSB была в 30 раз выше, чем в норме, но вскоре снижалась до нормального уровня из-за интенсивной пролиферации гепатоцитов, приводящей к разведению вектора, поскольку AAV не является интегративным. С др. стороны, те же самые дозы вектора, введенные в ювенильной группе вызывают стабильную высокую активность ARSB и она поддерживается на более высоком или в нормальных пределах в последующее время, подтверждая, что поздняя генотерапия с помощью вектора AAV2/8 может оказаться благоприятной для клинического использования, поскольку MPS VI пациенты обычно обнаруживаются при рождении. В этом исследовании эхокардиографический анализ проводили у 9-12 мес. животных. У кошек в контроле обнаруживали утолщения митрального клапана, тогда как леченных кошек это состояние уменьшалось или нормализовалось (Cotugno et al., 2011).
У мышей AAV2/8-TBG-hARSB вектор был использован в виде внутривенных инъекций у 30-дневных MPS VI мышей в сравнении с ERT (Ferla et al., 2014). Оба воздействия обнаруживали эффективное снижение накоплений GAG в миокарде и клапанах сердца, хотя генотерапия обеспечивала стабильные уровни ARSB (в среднем в 17% от нормальных уровней) без кинетики в сыворотке в виде пиков и падений, наблюдаемых при ERT. С др. стороны, т.к. высокие дозы вектора могут нарушать функцию печени, то ассоциации между генотерапией и ERT тестировали с использованием одиночного введения IV низкой дозы AAV2/8 (менее 2 x 1012gc/kg) и ежемесячны вливаний энзима, приводивших в результате к повышению активности ARSB и к снижению GAGs в клапанах сердца и миокарде по сравнению лишь с одной ERT (Alliegro et al., 2016).
Наконец, вектор AAV2/8-TBG-hARSB, по-видимому, безопасный и эффективный вплоть до 180 post-administration у MPS VI мышей (Ferla et al., 2017), демонстрирует осуществимость возможного переноса в клинику такой терапии.
Ретровирусный вектор был также протестирован у MPS VI модельных животных. Котята MPS VI были подвергнуты действию RV вектора hAAT-fARSB-WPRE спустя 4 дня после рождения. Как результат отложения GAG резко уменьшались во всех проанализировнных тканях. Напротив, активность ARSB в сыворотке в RV группе увеличивалась в среднем в 13 раз по сравнению гомозиготными нормальными кошками и в 60 раз по сравнению с не леченной группой MPS VI. Однако, активность энзима в висцеральных органах, включая сердце и аорту составляла 9-85% от значений у нормальных кошек, демонстрируя, что энзим не воспринимается клетками эффективно даже в случае сверхфизиологических уровней в кровотоке. Не леченные MPS VI кошки в конечном итоге имели дилятацию аорты в синусе Valsalva и в sinotubular соединении, regurgitation аортальных клапанов, утолщение створок аортальных клапанов и митрального клапана. Подобные состояния не присутствовали у нормальных кошек, а все кроме утолщенных митральных клапанов, были достоверно уменьшены у RV обработанных животных. Следовательно, генотерапия новорожденных, по-видимому, предупреждает дилятацию аорты и утолщение аортальных клапанов, хотя это не указывает на выздоровление от сердечной болезни (Ponder et al., 2012).

MPS Type VII


Mucopolysaccharidosis типа VII, или Sly синдром, вызывается дефицитом β-glucoronidase (GUSB), приводящему к возникновению лизосом, накапливающих chondroitin, dermatan и heparan sulfate. Кардиальные симптомы включают болезнь коронарных артерий, расширение аорты, утолщение и стеноз створок аортальных клапанов, утолщение интимы аорты и гипертрофия левого желудочка (Braunlin et al., 2011; Gniadek et al., 2015).
С конца 1990s, опубликовано несколько работ, анализирующих эффект генотерапии на сердечно-сосудистую систему у животных, моделирующих MPS VII . Daly et al. (1999) инъецировали внутривенно AAV вектор с человеческой GUSB кДНК новорожденным мышатам с MPS VII , в результате наблюдалась стабильная экспрессия GUSB , более высокая. чем в норме вплоть до 16 недель в сердце. Напротив, RV вектор hAAT-GUSB с предварительной обработкой AV-CMV-HGF (HGF - Hepatocyte Growth Factor) - который индуцировал временную репликацию гепатоцитов, делая возможной тем самым трансдукцию RV вектора в делящиеся клетки - увеличивал активность GUSB в сердце лишь слегка (примерно на 5%) и не устранял лизосомных хранилищ (Gao et al., 2000).
Ретровирусный вектор hAAT-cGUSB-WPRE давал лучшие результаты на мышиных и собачьих моделях MPS VII. Три новорожденные собаки с MPS VII подвергались внутривенному воздействию (Ponder et al., 2002), ни одна из низ не обнаруживала недостаточности аортальных клапанов или утолщения митральных клапанов в собак в возрасте 8-9 мес., обычный признак у взрослых MPS VII собак и только одна имела умеренную митральную regurgitation. Впоследствии Sleeper et al.(2004) производили воздействие на новорожденных собак RV вектором hAAT-cGUSB-WPRE, это привело к улучшению эхокардиографических показателей - толщина трехстворчатого, аортального и пульмонального клапанов была нормальной у всех леченных собак, ни одна не имела murmurs, а диаметр аорты оставался в нормальных пределах. У двух собак отмечалась незначительная митральная regurgitation на 9 - 11 мес.; а в 2 года одна из них обнаруживала минимальную митральную regurgitation, но то же самое происходило у 3 из 7 нормальных собак. Активность GUSB в аорте и миокарде составляла примерно 17% и 19% от нормы, сооьв., а содержание GAG было снижено на 178% от нормы в аорте и миокарде.
Гистологически аорта собак после воздействия RV имела веретенообразные миоциты с минимальными гипертрофией и вакуолизацией цитоплазмы, в противовес округлым, сильно гипертрофичным и васкулизированным мышечным клеткам в аортах не леченных собак. Не леченные MPS VII собаки также имели важные узловатые утолщения митрального клапана, тогда как только легкое утолщение наблюдали в группе леченых собак. Хотя воздействие не очищало хранилища GAG полностью, эти результаты показывали, что внутривенная RV генотерапия у новорожденных может уменьшать сердечно-сосудистые аномалии у собак с MPS VII, при отсутствии побочных эффектов.
Кроме того, MPS I и VII собаки подвергались воздействию RV вектора hAAT-cIDUA-WPRE и hAAT-cGUSB-WPRE, соотв., на 2 - 3 день после рождения (Metcalf et al., 2010). Все подвергшиеся воздействию MPS VII собаки обнаруживали стабильную высокую активность GUSB в сыворотке в течение всего периода наблюдения, в среднем более 8 лет для некоторых собак, хотя активность GUSB в аорте была относительно низкой, что отражало плохую диффузию энзима в эту структуру. Аорта выглядела нормальной у 6-мес. обработанных RV MPS VII собак с высокой активностью энзима в сыворотке, , однако, 8-летних леченых собак аорта оказывалась расширенной, а аортальные клапаны утолщены, что сопровождалось снижением движений. первая собака имела 148% от нормальной активности энзима, а вторая имела 52%, это, по-видимому, и внесло вклад в различия в результатах. Итак, аорты у собак после воздействия выглядели нормально в течение первых 5 лет после генотерапии, но она становилась растянутой (dilated) спустя 8 лет. Поскольку экспрессия GUSB оставалась стабильной воздействие генотерапии задерживало становление патологии аорты, но не предупреждало её.
Прогрессирование болезни митрального клапана у MPS VII собак также оценивали в той же группе (Bigg et al., 2013). Авт. предположили, что regurgitation возникает из-за снижения содержания коллагена и его аномальной структуры в митральном клапане, по оценке с помощью Masson's trichrome и Picrosirius-red окрашивания, соотв. Нормальные и леченые собаки обнаруживали более высокое содержание коллагена, чем MPS VII животные. Относительно структуры коллагена RV генотерапия улучшала целостность волокон до 45% от нормы и в 5 раз значения нелеченых MPS VII собак в возрасте 6 мес. Биохимический анализ показал почти полное исчезновение хранилищ GAGs и снижение протеазной активности, такой как cysteine cathepsins в RV обработанных выборках.
У мышей активность GUSB статистически выше в сердце, леченных с помощью hAAT-cGUSB-WPRE, чем в группе не леченных, а хранилища GAG оказывались очищенными в клапанах сердца и аорте в RV группах в высокими уровнями GUSB в кровообращении (Xu et al., 2002). В др. исследовании с тем же самым протоколом, активность GUSB в аортах леченых животных была статистически выше с 5-кратным увеличением по сравнению с нормальными мышами и с 325-кратным увеличением по сравнению с не леченной группой. Уровни GAG были в 111 выше нормы у MPS VII мышей в аорте и достоверно снижены до 5% у RV обработанных мышей. Хотя биохимические параметры были улучшены, диаметр аорты у обработанных животных составлял 155% от нормы в возрасте 10 мес., значит болезнь аорты всё ещё развивается и прогрессирует, указывая на то, что протокол генотерапии не полностью эффективен в отношении аномалий аорты (Baldo et al., 2011).
Др. исследование было проведено без осуществления функционального анализа сердца и с использованием разных подходов. Серотипа 2 AAV вектор, экспрессирующий человеческий GUSB, вводили внутрь печени MPS VII взрослых мышей, получаемая в результате активность GUSB составляла 15% от нормы (Sferra et al., 2004). Помимо AAV вектора, был использован лентивирусный вектор, происходящий из Human Immunodeficiency Vector pHIV-1EF1α-GUSB (1EF1α - Eukaryotic Translation Elongation Factor 1 α1), вводимый внутривенно новорожденным pups спустя 2 дня после рождения. Мыши из двух разных линий были использованы, GUStm(L175)Sly и GUSmps/mps, представляющих собой ослабленную и тяжелую формы болезни, соотв. Трансдукция сердечных миоцитов была более эффективной у GUStm(L175)Sly животных, у них активность GUSB достигала примерно 60% от нормы. GAG хранилища уменьшались, но всё ещё присутствовали у животных обеих линий (Derrick-Roberts et al., 2014). При воздействии на более старых мышей результаты получались более умеренными (Derrick-Roberts et al., 2016).

Sphingolipidoses


Fabry Disease


Fabry Disease это Х-сцепленное нарушение, вызываемое дефицитом лизосомной гидролазы α-galactosidase A (α-GalA) с последующим накоплением globotriaosylceramide (Gb3) в лизосомах. Кардиальные симптомы обычно одинаковые у мужчин и женщин с классической формой и с кардиальным вариантом. Более того, они являются основной причиной болезненности и смертности. Симптомы включают: кардиальную гипертрофию, ассоциированную с депрессией сократимости и нарушениями заполнения во время диастолы, коронарной недостаточностью, нарушениями предсердно-желудочного проведения, аритмией и нарушениями клапанов (Linhart and Elliott, 2007)
В первом сообщении о генотерапии при болезни Fabry использовался аденовирусный вектор (Ziegler et al., 1999) (Table 4). Вектор AV-CMV-α-GalA вводили через хвостовую вену модельным мышам. Активность энзима и уровни Gb3 было нормализованы в нескольких тканях, включая и сердце. Однако, экспрессия быстро снижалась и возобновлялось накопление субстрата спустя 6 мес. Иммуносупрессия с помощью моноклональных антител против лиганда CD40 улучшала результаты повторного использования вектора. Та же самая группа также продемонстрировала, что как деплеция Купферовских клеток так и предварительное воздействие гамма-глобулинов могут существенно повышать трансдукцию AV (Ziegler et al., 2002) и что пульмональные вливания были эффективным методом воздействия (Li et al., 2002).

Table 4Effects of gene therapy on cardiovascular system in the Sphingolipidoses.

Адено-ассоциированные векторы наиболее часто используются в качестве векторов для оценки кардиальной ткани. Jung et al. (2001) установили повышенную активность фермента и пониженное накопление субстрата в сердце Fabry мышей в возрасте 25 недель после инъекции вектора AAV2. Использование др. вектора AAV2 введенного в quadriceps увеличивало ферментативную активность на 30 неделе без возникновения антител (Takahashi et al., 2002). Эхокардиография показала, что гипертрофия сердца сильно снижена. Хотя авт. установили удаление из сердца Gb3, толщина стенок не нормализовалась. Поскольку животные были в возрасте 3 мес., когда производили инъекции, то вполне возможно, что необратимые структурные изменения уже были установлены и лечение не могло из устранить. Этого типа вектор кажется более эффективным, др. авт. также отмечают увеличение ферментативной активности, по крайней мере, до нормального уровня и/или полную очистку от отложений Gb3 до 60 недель при использовании внутривенного введения AAV1 (Ogawa et al., 2009), AAV2 (Park et al., 2003; Ziegler et al., 2004; Choi et al., 2010) или AAV8 (Ziegler et al., 2007) векторов.
Лентивирусные векторы были инъецированы в височную вену новорожденных Fabry мышей (Yoshimitsu et al., 2004; Higuchi et al., 2010). Спустя 26 - 28 недель оба исследования сообщили о снижении Gb3 и увеличении активности α-GalA в сердце. Более позднее исследование продемонстрировало, что слияние α-GalA с трансдукционным доменом белка (PTD) из HIV transactivator of transcription (Tat) белка усиливает снижение Gb3. Прямые инъекции в желудочки сердца LV также вызывало снижение тяжести болезни в кардиальной ткани в течение короткого периода (Yoshimitsu et al., 2006).
Комбинированное использование генотерапии и HSCT также было оценено. Takenaka et al. (2000) использовали α-Gal-дефицитные HSC от 10-нед. мышей доноров, которым были трансдуцированы 4 раза с помощью ретровирусов, кодирующих α-GalA. Затем клетки были трансплантированы в сублетально и летально облученным α-GalA-дефицитным мышам. Спустя 26 недель, повышенная активность α-GalA и снижение накоплений Gb3 обнаруживали в сердце и др. органах, особенно в группе летально облученных. Эти результаты наблюдали даже после осуществления вторичной трансплантации (Takenaka et al., 2000). Qin et al. (2001) использовали бицистронный ретровирусный вектор, который экспрессировал α-GalA и селектируемый маркер (CD25 - Interleukin 2 Receptor α). Они получали HSC от 6- 10-недельных самцов мышей с Fabry и трансдуцировали по разу в день в течение 5 дней. Клетки затем были отсортированы с помощью проточеной цитометрии и immunoaffinity обогащения и инъецированы в хвостовую вену нескольких групп, включая летально облученных мышей Fabry. Анализ тканей спустя 6 мес. показал, почти нормальные уровни α-GalA levels в сердце этих животных. Более того, вторичные трансплантации клеток, собранных от этих первично трансплантированных мышей, показали, что у 3-х из 5 таких мышей уровень энзима был равным или выше нормы в плазме. Оценка GB3 не производилась (Qin et al., 2001). Позднее были проанализированы разные Reduced-intensity Conditioning Regimens, помимо предварительной селекции. Liang et al. (2007) описали. что как облучение конечностей в летальной дозе рентгеновскими лучами, так и воздействие Fludarabine и Cyclophosphamide повышали ферментативную активность после трансдукции теми же самыми RV как и в предыдущем исследовании. Только мыши, летально облученные давали почти нормальные уровни активности энзима в сердце и избавление от Gb3. Др группа использовала LV, чтобы трансдуцировать моноядерные клетки костного мозга и трансплантировать их мышам Fabry. Воздействие оказалось эффективным и давало сверхфизиологические уровни энзима и общее очищение от субстрата в сердце и др. тканях. После вторичной трансплантации уровни энзима также оставались повышенными в некоторых тканях по сравнению с не леченными мышами (Yoshimitsu et al., 2007).
Наконец, описано использование не вирусных векторов в качестве голых плазмид и катионовых lipid-pDNA комплексов (Przybylska et al., 2004; Nakamura et al., 2008). Эти векторы были не столь эффективны как вирусные векторы и были неспособны нормализовать болезнь у мышиных моделей.

Galactosialidosis


Galactosialidosis (GS) является аутосомно рецессивной болезнью, вызываемой мутациями в гене Cathepsin A (CTSA), кодирующем protective protein/cathepsin A (PPCA). Дефекты PPCA приводят к вторичному комбинированному дефициту β-galactosidase и neuraminidase, приводя к накоплению sialyloligosaccharides и glycopeptides. Пациенты с типичными проявлениями лизосомных нарушений, таких как грубое лицо и скелетные деформации (Okamura-Oho et al., 1994). Ткань миокарда утолщается и накапливает вакуоли и могут появляться сердечно-сосудистые болезни с утолщениями митрального и аортальных клапанов, ведущих к недостаточности клапанов (Bursi et al., 2003) и дилятации левого желудочка (Okamura-Oho et al., 1994).
Первоначально исследования генотерапии были сконцентрированы на разработке избыточной экспрессии PCAA трансгенных мышей, чтобы использовать в качестве HSC доноров для трансплантации PCAA-KO мышам, которые приводили к умеренному улучшению фенотипа (Hahn et al., 1998; Zhou et al., 1995). Позднее был протестирован протокол ex vivo генотерапии с использованием RV MSCV-PPCA (MSCV - Murine Stem Cell Virus) модифицированных PCAA-KO клеток гематопоэтических предшественников для трансплантации PCAA-KO мышам. Хотя количество PPCA экспрессирующих клеток варьирует у обработанных мышей, наблюдалась системная коррекция у всех животных, которым трансплантировали MSCV-PPCA. В гомогенатах сердца активность cathepsin A обнаруживалась на более высоких уровнях, чем в не леченной группе в течение 10 мес. (Leimig et al., 2002).
В самом последнем исследовании по генотерапии использовали вектор AAV2/8-LP1-PPCA (LP1 - Liver Specific Promoter) для лечения 60 30-дневных PCAA-KO мышей, внутривенно с тремя дозами векторов. Помимо улучшения общего состояния и восстановления плодовитости, гистологические срезы сердца выявили полное избавление от раздутых лизосом, как и в др. тканях.

Gaucher Disease


Gaucher disease (GD) наиболее распространенная LSD, с показателем по миру 1:75000 (Huang et al., 2015). Она вызывается дефицитом фермента glucocerebrosidase (GCase) и как следствие отложением субстрата glucocerebroside в печени, селезенке и костях. Существует три классические формы в зависимости от тяжести и начала симптомов - type I (наиболее распространенный без вовлечения ЦНС), type II (острая нейропатическая форма) и type III (хроническая нейропатическая форма). Последняя характеризуется более слабыми фенотипическими отклонениями с умеренными нейропатическими повреждениями и висцеральными проявлениями, включая и кардиальные симптомы.
Пациенты с Gaucher болезнью type III (GD III) обычно обнаруживают распространенную кальцификацию сердечно-сосудистых структур, таких как восходящая аорта, коронарные и каротидные артерии и сердечные клапаны, приводящие к стенозу клапанов, дилятационной кардиомиопатии и возможно к застойной сердечной недостаточности (Guertl et al., 2000).
Большинство исследований по генотерапии GD было осуществлено в 1990's, сконцентрировавшись в основном на протоколах in vitro HSC трансдукции для HSCT. После получения мышиной модели GD некоторые исследования были посвящены ex или in vivo генотерапии у мвшей, в одном из них получено увеличение активности GCase в сердце (Kim et al., 2004). Однако, генотерапия для GD оказалась безуспешной по сравнению с др. LSDs, возможно потому, что GCase обычно не секретируется за исключением клеток с высокими уровнями энзима, требующих очень эффективных векторов для доставки или индукции существенной экспрессии генов (Marshall et al., 2002).

GM1 Gangliosidosis


GM1 gangliosidosis характеризуется накоплениями GM1 gangliosides и родственных glycoconjugates в лизосомах из-за дефицита β-galactosidase (β-gal). Помимо проявлений, общих большинству LSDs, треть пациентов в GM1 gangliosidosis имеет застойную кардиомиопатию, независимо от классификации болезни (infantile, juvenile and adult) (Guertl et al., 2000; Morrone et al., 2000; Brunetti-Pierri and Scaglia, 2008).
Поскольку сердце вовлечено не у всех пациентов, а нейрологические проявления очень выражены, то протокол генотерапии разрабатывался для проявлений в ЦНС. Исследования были нацелены на увеличении активности β-gal в ЦНС, сердце и др. висцеральных тканях с использованием или AV вектора (Takaura et al., 2003) или AAV (Weismann et al., 2015) при воздействии на мышей с GM1 gangliosidosis.

Niemann-Pick Disease types A and B


Niemann-Pick disease (NPD) вызывается накоплениями sphingomyelin в лизосомах главным образом в моноцитах и макрофагах. Болезни Niemann-Pick types A и B ассоциированы с мутациями в гене Sphingomyelin Phosphodiesterase 1 (SMPD1) , а type C вызывается мутациями в генах Intracellular Cholesterol Transporter (NPC1 или NPC2), демонстрируя др. клинические проявления. Оба types A и B обусловлены дефицитом acid sphingomyelinase (ASM), благодаря чему NPD-A затрагивает нейроны, тогда как NPD-B только висцеральные органы (Schuchman and Wasserstein, 2015).
Ранние сердечно-сосудистые заболевания появляются у некоторых пациентов с NPD-A и NPD-B, проявляющихся в болезнях клапанов или коронарных артерий, которые, в свою очередь, вызываются, как полагают, аномальным профилем атерогенных липидов у большинства пациентов. Механизмы, качающиеся болезней клапанов, пока неизвестны (McGovern et al., 2013).
Первая работа, описавшая генотерапию для NPD использовала 2-дневных ASM-KO мышей, которым инъецировали с клетками костного мозга предварительно модифицированными ретровирусным вектором, содержащим ASM (acid sphingomyelinase). Уровни ASM и хранилищ sphingomyelin в сердце леченных животных не отличались статистически достоверно от не леченных мышей. В др. органах результаты были несколько лучше, это ослабляло проявления болезни. Однако, у всех трансплантированных мышей в конечном счете развивалась атаксия и они умирали раньше, чем нормальные мыши (Miranda et al., 2000). Впоследствии сходный подход использовал два типа трансплантаций - один с модифицированными клетками костного мозга, вводимых на 3-й день после рождения и др. с модифицированными мезенхимными стволовыми клетками вводимыми в головной мозг на 30 день - это приводило к улучшению нейрологических признаков, а активность ASM первоначально увеличивалась в сердце, затем снижалась только до 2% от нормы после 24 недель (Jin and Schuchman, 2003). Не была оценена эффективность генотерапии в отношении сердечной болезни при NPD.

Sialidosis


Sialidosis вызывается прогрессирующим накоплением sialylated glycopeptides и oligosaccharides из-за дефицита neuraminidase 1 (NEU1), известна также как sialidase. Главные клинические проявления включают мегалию висцеральных органов, грубое лицо, dysostosis multiplex и умственную отсталость. Пациенты могут также иметь сердечные аномалии, включая болезни клапанов и увеличение толщины стенки желудочков (Senocak et al., 1994). На сегодня нет лечения.
Генетический перенос NEU кДНК в фибробласты пациентов проводили, чтобы индуцировать временную экспрессию отсутствующего фермента. Уровни NEU в фибробластах были восстановлены до нормальных пределов и увеличивались более чем в 10 раз при совместной трансфекции с кДНК cathepsin A (PPCA, шаперон, необходимый для определения маршрутов лизосом) (Igdoura et al., 1998); аномальные отложения sialylglycoprotein уменьшались до нормальных уровней (Oheda et al., 2006). In vivo генотерапия с использованием AAV2/8 вектора для доставки кДНК PPCA приводила к косвенному увеличению активности NEU по сравнению с , как было установлено, остаточными уровнями, включая и сердце.

Conclusion and final considerations


Gene therapy is being tested along the last three decades for many diseases, and it seems very promising to treat LSDs. Since cardiovascular disease is an important feature of many of them - normally being one of the main causes of mortality among patients - it is important to evaluate how efficient this therapy is on the cardiovascular system and how it can impact on the patient's life.
Many gene therapy protocols have already been tested and, so far, they showed better results when performed in young and in immunodeficient/pre-conditioned animals. Intravenous injection is the most used route of administration because it is the one that distributes the vector more homogenously. Retrovirus and adeno-associated virus are the most used vectors and have not yet produced serious adverse effects in these animal models, being efficient and apparently safe.
The heart seems to be much beneficiated from most of gene therapy protocols, ameliorating or normalizing many of analysed parameters (Figure 1), such as wall thickness, electric conductance and heart rate. On the other hand, heart valves and aorta do not respond so well, probably due to poor and/or uneven vascularization, even when there are supraphysiologic levels of missing enzyme in the bloodstream. Aortic dilatation, valve thickening, valve regurgitation and valve insufficiency were delayed in most treated animals with MPS, but they still developed these conditions eventually. For Fabry and Pompe diseases, a similar outcome was observed - all treated mice had improvement in cardiac tissues, but the overall pathology was only partially corrected. For other diseases cited in this revierw, reduction of substrate and increase in enzyme activity was achieved after gene therapy, but this does not indicate cardiac disease resolution due to lack of more specific functional analysis.

Figure 1 Cardiovascular response to gene therapy depending on vector used, according to studies for lysosomal storage diseases. Schematic representation of the heart and the aorta showing the most prominent cardiovascular manifestations of lysosomal storage diseases (right) with the results obtained from in vivo gene therapy using different vectors (bottom). Retroviral and adeno-associated viral vectors resulted in better outcome for many aspects of the disease (although most studies using other vectors did not analyse thoroughly the effect of gene therapy on cardiovascular manifestations and there is no data available). Valves and aorta are most difficult to treat, as most vectors do not reach these structures as easily as the myocardium. Some features were only restored or prevented when treated in the first days of life (represented by * next to the vector symbol).