Посещений:
БОЛЕЗНЬ PELIZAEUS-MERZBACHER
Супрессия с помощью искусственных microRNA
Gene suppressing therapy for Pelizaeus-Merzbacher disease using artificial microRNA Heng Li, Hironori Okada, Sadafumi Suzuki et al. JCI Insight v.4(10); 2019 May 16
|
|
Чувствительные к дозе гены нуждаются в точном количестве генов в геноме для осуществления физиологических функций (1). Изменения количества копий этих генов - даже увеличение только на одну копию гена в результате дупликации - может вызывать патологическое нарушение функции, приводящее к болезни, в целом обозначаемых как геномные нарушения (1). PLP1 (кодирующий proteolipid protein 1) является одним из таких чувствительных к дозе геном; превышение или потеря одиночной копии приводит к hypomyelinating leukodystrophy ЦНС, наз. Pelizaeus-Merzbacher disease (PMD) (2-4). Общие клинические признаки PMD могут быть распознаны в первые годы жизни как гипотония, нистагм и задержка стадий развития , особенно двигательной функции. После этого наступают спастичность, атаксия и choreoathetotic движения, которые становятся всё более выраженной (2). Большинство пациентов пользуются инвалидным креслом и нуждаются в помощи в течение всей жизни. PMD вызывается мутациями в гене PLP1 (4-6), кодирующем главный миелиновый белок ЦНС. Поскольку PLP1 расположен на хромосоме Xq22.1, то PMD наследуется как X-сцепленный рецессивный признак. Разные типы мутаций, включая точечные мутации, геномные дупликации и делеции, вызывают спектр болезненных фенотипов, включая PMD и более умеренные аллельные болезни, spastic paraplegia type 2 (SPG2) (7). Сегодня нет лечения PMD/SPG2.
Геномные дупликации, затрагивающие весь ген PLP1, наиболее часты (60%-70%) случаев PMD (2). Однако, очень мало известно в отношении того, почему дупликация PLP1, предположительно вызывающая избыточную экспрессию PLP1, приводит к выраженному гипомиелинизированию у людей. Plp1-Tg мыши, животные, моделирующие PMD с избыточной экспрессией PLP1, обнаруживают зависимый от дозы арест миелинизации и апоптическую клеточную гибель на завершающей ст. дифференцировки олигодендроцитов (2, 8-11). Предыдущие исследования Plp1-Tg мышей привели к гипотезе, что избыточная экспрессия Plp1 приводит к накоплению белка внутри поздних эндосом/лизосом, связанных с секвестрированием холестерола, и эти агрегаты могут в принципе нарушать поставку в мембраны холестерола или galactosylceramide, который необходим для нормальной миелинизации (12-14).
Хотя точные молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе дупликаций PLP1 , вызывающих тяжелую гипомиелинизацию ЦНС, до конца непонятны, избыточная экспрессия PLP1, скорее всего, является фундаментальной причиной этой болезни. Поскольку избыточная экспрессия PLP1 в основном ограничена олигодендроцитами, поэтому мы исследовали возможность подхода генотерапии путем супрессии Plp1 мРНК, особенно в олигодендроцитах головного мозга мыши. Уже были установлены пределы уровней супрессии Plp1, которые безопасны и эффективны. Пациенты с PLP1-нулевыми мутациями обычно обнаруживают более умеренный фенотип, чем при др. ипах мутаций, включая дупликации PLP1 (15, 16). Это означает, что даже если терапия по супрессии гена приводит к исключительной эффективности, которая полностью уменьшает экспрессию Plp1, мы всё ещё могут ожидать определенные терапевтические эффекты скорее, чем побочные эффекты.
В качестве подходящей платформы для терапии путем супрессии гена при PMD, мы избрали adeno-associated virus (AAV) вектор, т.к. он безопасен благодаря низкой интеграции в геном, высоко эффективен и длительно экспрессируется в ЦНС (17). Однако, олигодендроциты, как известно, являются мало эффективной линией клеток мишеней для трансдукции AAV, даже при использовании мощных повсеместных промоторов, таких как CAG и U6, применяемых для большинства обычных серотипов AAV (18). Чтобы преодолеть эту проблему и разработать AAV вектор, способный эффективно супрессировать специфический для олигодендоцитов ген, мы использовали искусственную систему экспрессии microRNA (miRNA) (19), которая способна экспрессировать ген-специфическую siRNA из miRNA-flanking кассеты, помещенной в 3' UTR кДНК из флуоресцентнго белка Venus (20). Мы помещали систему экспрессии miRNA под контроль RNA polymerase II-управляемого специфичного для олигодендроцитов промотора, а именно, промотора человеческой 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) . Прямая инъекция AAV вектора, содержащего нацеленную на Plp1 искусственную miRNA , в головной мозг Plp1-Tg мышей приводила к достоверным терапевтическим эффектам на продолжительность жизни и поведенческий фенотип; гистологическое восстановление включало снижение цитоплазматических включений Plp1, ослабление снижения количества зрелых олигодендроцитов и нарушений миелинизации, уменьшение воспаления и astrogliosis; и молекулярные изменения, включая восстановление гена миелина и экспрессии белка. Кроме того, мы успешно разработали AAV платформу и предоставили доказательства, что AAV-обеспечиваемая терапия генной супрессии может служить в качестве лечения PMD, возникающей в результате дупликации PLP1.
Discussion
Итак, комбинация человеческого CNP промотора, нацеленной на Plp1 искусственной miRNA кассеты и scAAV вектора осуществляет широко распространенную трансдукцию с высокой специфичностью к олигодендроцитам и обладает достаточной эффективностью по супрессии гена. Мы предоставили доказательства достоверных терапевтических эффектов у Plp1-Tg мышей. Эта платформа может послужить основой для разработки клинически пригодной молекулярной терапии c PMD.
Мы использовали преимущества RNAi , чтобы специфически снизить уровень PLP1 в олигодендроцитах. Мы применили технологию искусственных miRNA в scAAV системе доставки, с shRNA, управляемой RNA polymerase III-mediated промоторами, такими как U6, и обычной single-strand AAV (ssAAV). Мы первоначально клонировали человеческий CNP промотор длиной в 1.8 kb, который короче, чем мышиный Cnp промотор (32-34) или Mbp промотор (22). Человеческий CNP промотор соответствует размеру scAAV вектора. Он обнаруживает более высокую активность по сравнению с CAG промотором и обладает специфичной для олигодендроцитов экспрессий гена in vivo. Во-вторых, искусственная miRNA вызывает меньше побочных эффектов, чем RNA polymerase III-управляемая shRNA (35-38). Она обнаруживает незначительную цитотоксичность, т.к. напоминает эндогенную miRNA-экспрессирующую систему (35). В-третьих, это предоставляет больше свободы при разработке RNAi кассеты. Если одиночной копии miRNA недостаточно, что множественные miRNAs могут быть тандемно сцеплены, чтобы целенаправленно воздействовать н аодну и ту же или разные последовательности в гене, чтобы усилить эффективность молчания. Следовательно, степень супрессии гена может контролироваться путем приготовления единиц. В четвертых, scAAV векторы обладают высокой эффективностью и более быстрой экспрессией, чем обычные ssAAV экспрессионные векторы (39, 40).
Мы продемонстрировали, что человеческий CNP промотор в нашей AAV системе доставки успешно управляет специфичной для олигодендроцитов экспрессий гена. Существенно меньшая экспрессия наблюдается в нейронах, астроцитах и микроглие. Это важно для избегания побочных эффектов в nontargeted клетках. Локально примененный scAAV широко распределяется в головном мозге, включая CC, fimbria и большинство областей CS и IC, спустя 1 неделю. Это важно, поскольку PMD затрагивает все олигодендроциты ЦНС. В-третьих, искусственная Plp1-miRNA эффективно снижает экспрессию Plp1 мРНК и белка. Сила супрессии 40%-50% как на уровне мРНК, так и белка in vivo. Это идеально для лечения PMD, вызываемой дупликацией PLP1.
Мы также предоставили доказательства, подтверждающие, что наша терапевтическая система может достоверно снижать фенотипические отклонения у Plp1-Tg мышей. Накопления в цитозоле Plp1, которые уже присутствуют на ст. P10, когда начинается лечение, в основном исчезают к ст. P25. Накапливаемые Plp1, по-видимому, включают холестерол, чтобы сформировать плоты агрегаты, которые в принципе разрушают доставку в липидные мембраны, предупреждая рециклинг поздних эндосом/лизосом и вызывая деградацию миелиновой мембраны, мешая поступлению сигнальных молекул миелинизации и нарушая процесс миелинизации (12). Цитоплазматические накопления Plp1 играют фундаментальную роль в патогенезе избыточной экспрессии Plp1.
Гистологический и молекулярный анализ показали, что лечение с помощью Plp1-miRNA достоверно восстанавливает миелинизацию. Мы наблюдали увеличение зрелых олигодендроцитов за счет снижения их деградации и увеличения экспрессии миелиновых белков, MBP, MOG и CNPase, , а также за счет ультраструктурного восстановления плотности миелина и толщины слоя миелина. Более того, эффективно устранялись ассоциированные глобальные воспалительные изменения в белом веществе Plp1-Tg мышей, включая astrogliosis и активацию микроглии. Неожиданно, локальное применение AAV и замалчивание Plp1 в ограниченных областях вызывали достоверное увеличение продолжительности жизни, а также улучшение поведенческих фенотипов. Следовательно, даже локальное восстановление миелинизации может улучшать глобальный фенотип.
Перед использованием в клинике необходимо разрешить некоторые вопросы. Во-первых, отбор серотипа с высокой специфичностью инфекции олигодендроцитов обязателен, чтобы снизить риски побочных эффектов на nontarget клетки. Наша система обладает специфичной для олигодендроцитов экспрессией гена исключительно за счет CNP промотора. Однако, возможна утечка экспрессии искусственной miRNA в не олигодендроциты. Фактически, уровень экспрессии CNP в астроглии и микроглии описан (41). Поэтому не исключена возможность, что CNP-управляемый AAV оказывает скрытые эффекты на клетки иные, чем олигодендроциты, это может влиять на жизнеспособность Tg мышей. Оптимизация за счет использования серотипов с более высоким тропизмом к олигодендроцитам, таких как AAV8 (40) или синтетических новых капсид, olig001 (42), может еще больше повысить надежность и клеточную специфичность вирусной инфекции в нашей системе. Во-вторых, разработка систем доставки с более широким hgcghtltktybtv может привести к лучшим терапевтическим результатам. В нашем случае локальное применение AAV приводило к тому, что многочисленны олигодендроциты вне области инфекции всё ещё оставались в нелеченном состоянии. Дистония, основная причина гибели Plp1-Tg мышей, может затрагивать нейрональные сети как базальных ганглиев, так и мозжечка (43), где обнаруживались немногие инфицированные олигодендроциты. Использование системы доставки AAV делает возможным более широкое распространение, т.к. инъекции в желудочки головного мозга или ультразвуковое воздействие, комбинируемые с микропузырьками (44-48), может ещё больше улучшить терапевтический эффект нашей системы AAV воздействия. Платформа, базирующаяся на искусственных miRNA может быть применена для лечения и др. генетических заболеваний, вызываемых сегментными геномными дупликациями, такх как Charcot-Marie-Tooth disease type 1A.
|