Врожденные болезни дегенерации сетчатки затрагивают одного на 3000 человек в мире [11-13]. Существует только одно, разрешенное FDA, лечение дегенерации сетчатки, Second Sight Electronic протезирование [14]. На сегодня имеется немного клинических испытаний в Фазе I/II генотерапии, почти все касаются ранних стадий моногенных заболеваний по поддержанию жизнеспособности фоторецепторов. Эти испытания в основном ограничены "замещением генов" при болезнях, возникших в результате рецессивных нулевых мутаций причинных генов, при этом кодирующий регион меньше 8 kb, размер, подходящий для AAV или лентивирусных векторов.

При заболеваниях сетчатки многие промежуточные нейроны сетчатки выживают в физиологически и метаболически функциональном состоянии в течение длительного периода (годы), открывая возможность лечения путем генетического добавления им свет-воспринимающей функции [15, 16]. Один из подходов, используемый несколькими группами, заключается в добавлении свет-воспринимающей функции выживающим нейронам внутренней сетчатки, путем экспрессии микробного opsin [1-10]. В 2014 FDA одобрило клиническое испытание RST-001 (RetroSense Inc.), вводимого внутрь стекловидного тела AAV2 вектора для переноса Channelrhodopsin-2 (ChR2) клеткам ретинальных ганглиев [17]. GenSight, Inc., начало клиническое испытание с использованием введения в стекловидное тело AAV для доставки ChrimsonR во внутренние сегменты колбочек [4] пациентам с тяжелым дефицитом зрения из-за гибели палочковидных фоторецепторов и потери чувствительных к свету наружных сегментов колбочек.

Плохая светочувствительность одна из крупнейших проблем восстановления оптогенетикой зрения. Необходимо достижение порога интенсивности, чтобы активировать ChR2-сенсибилизированные биполярные клетки и клетки ганглиев, составляющую 10¹⁵ фотонов/см² сек [9, 10] (see Fig. 1). Halorhodopsin (NpHR) экспрессируется в колбочках, обладает наилучшей чувствительностью к свету, нуждаясь минимум в 10¹³ фотонах/cm2 s, чтобы создавать обнаружимый ток (photocurrent) [3]. Для сравнения, порог активации эндогенных фотопигментов в палочках (10⁶ photons/cm2 s) и в колбочках (10¹⁰ photons/cm2 s) существенно ниже [9].



Fig. 1 Comparison of the light sensitivities of natural and artificial photoreceptor systems. Rod and cone photoreceptor sensitivities and melanopsin-expressing retinal ganglion cell sensitivity are compared with those of halorhodopsin (NpHR), wild-type channelrhodopsin 2 (ChR2) , and vertebrate rhodopsin installed in various cell types. Light sensitivities are given in photons/cm2 s The wavelengths for the respective therapeutic approaches are color-coded and indicated as numbers in white. All optogenetic channel light sensitivities are based on in vitro retinal whole-mount recordings from retinal ganglion cells (Figure modified from [27])

Более того, микробные опсины имеют ограниченный диапазон чувствительности ChR2 и NpHR, адаптируясь только к изменениям интенсивности в 2-3 порядка величин, тогда как палочки и колбочки приспосабливают свои реакции к 8-9 порядкам величин [3, 4]. ChR2 и NpHR оперируют как одиночные единицы (без GPCR каскада), требуя очень высокой интенсивности света для стимуляции. Кроме того, интенсивность диапазона света может тщательно регулироваться, так что не может быть насыщенной клеточной реакции, которая может вызывать неспособность клеток отвечать на стимуляцию высокими частотами [18, 19].

Недавно, Acucela, Inc. получила лицензию на оптогенетическую генотерапии, базирующуюся на родопсине человека [20] для лечения RP из Univ. of Manchester [21], которая обещает более высокую чувствительность, чем варианты ChR2. В их исследовании AAV-обеспечиваемая экспрессия rhodopsin как в RGCs, так и нейронах внутреннего ядерного слоя генерирует воспроизводимые реакции на пульсовые световые воздействия по интенсивности ниже 10¹² photons/cm2 s, в диапазоне освещения, встречающегося в ежедневной жизни. Мы обнаружили очень сходную чувствительность, обеспечиваемую AAV экспрессию родопсина в специфических классах ретинальных клеток (see Fig. 1) [22].

Во всех этих подходах ранние реакции пациентов говорят нам значительно больше о том, что необходимо для рабочего ретинального протезирования. Становится ясно, что эти подходы обнаруживают недостатки: (1) экспрессия микробных генов в тканях млекопитающих вызывает потенциальное беспокойство , (2) начав экспрессироваться, opsin не может быть заглушен в случае побочных реакций и (3) микробные опсины оперируют в узком диапазоне света и только при высокой интенсивности, интенсивности, которая способна вызывать световые повреждения выживших ретинальных клеток.

Здесь мы описываем генотерапию, базирующуюся на методе доставки light gated GPCR родопсина позвоночных в сетчатку слепых мышей. Мы показали, как определять экспрессию родопсина в ткани сетчатки и как брать выборки преобразованной сетчатки для определения реакции на свет in vitro. Далее мы описали в деталях, как тестировать реакции на свет in vivo, прежде всего регистрируя вызываемые зрительные реакции в зрительной коре и затем тестируя поведение, зависимое от зрения, у преобразованных мышей.

Итак, экспрессия чувствительных к свету G protein coupled receptors (GPCRs), таких как родопсин позвоночных, может увеличивать чувствительность за счет умножения сигналов.