Получение human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) привело к моделированию болезней, генотерапии, открытию лекарств и к регенеративной медицине^{1, 2}. Недавние успехи в технологиях редактирования генома, особенно с помощью системы CRISPR/CRISPR-associated protein (Cas), облегчили целенаправленную интеграцию функциональных ДНК элементов в геном человека для терапевтических вмешательств³.

Основная проблема, связанная с базирующейся на hiPSC терапией, это туморогенность^4,5. Одной из типичных стратегий является наделение клеток суицидальным геном, который может элиминировать капризные вызывающие опухоли клетки. Эта система защиты имеет преимущества в том, что суицидный ген может быть запущен даже после клеточной трансплантации или образования тератом. Это очень ценно, поскольку мутации могут возникать в hiPSCs а их производных во время культивирования⁶ , а дифференцированные клетки могут подвергаться злокачественным трансформациям. Наиболее часто используемым геном является тимидин киназа из herpes simplex virus (HSV-TK), которая фосфорилирует ganciclovir (GCV) и вызывает апоптоз путем ингибирования синтеза ДНК^7-13. Однако, недавнее исследование продемонстрировало возникновение GCV резистентности в iPSCs, экспрессирующих HSV-TK¹⁴, хотя обнаруживается множество различий в экспериментальных параметрах. В предыдущем исследовании ретровирусная трансдукция была использована для случайной инсерции суицидального гена. Следовательно, локализация трансгена и количество вставленных трансгенов не контролировались, это затрудняло предсказание поведения трансгенов и риск их замалчивания после дифференцировки hiPSC¹⁵.

Кроме того, необходимо установить безопасность и мощность путей редактирования генома человека. Специфичность техники редактирования генома с помощью CRISPR повысилась^16-20. Однако, мы всё ещё не знаем о действительном расположении "genomic safe harbors (GSHs)," т.е. о самых надежных подходящих локусах для инсерции трансгенов²¹. Локус для adeno-associated virus integration site 1(AAVS1) наиболее широко используется в качестве GSH. Однако, недавние исследования показали, что этот локус не является столь надежным и пригодным, как полагали, поскольку трансген может нарушать экспрессию миозин связывающей субъединицы 85²² и может быть замалчиваем в разной степени из-за эпигенетического и др. неизвестных механизмов²³. Детальный анализ др. кандидатов на роль GSHs, таких как chemokine (CC motif) receptor 5 (CCR5), человеческий ROSA26 и некоторые вне-генные локусы ещё не был полностью осуществлен. Поэтому характеризация кандидатов на роль GSH у человека важна.

Недавние успехи в биологии хроматина позволили выявить трехмерную архитектуру генома^{24, 25}. Одним из наиболее впечатляющих открытий саталото, что хромосомы пространственно распределены на домены в submegabase шкале, часто обозначаемые как topologically associated domains (TADs)^{26, 27}. Архитектурные белки, такие как CCCTC-binding zinc finger protein (CTCF), ассоциированные с удаленными геномными регионами и формирующие структуры петель. Эти структуры сводят геномные элементы в тесную пространственную близость и делают возможными взаимодействия внутри выделенных в островки доменов²⁸. Экспрессия генов внутри TAD скоординировна на эпигенетическом уровне, демонстрируя, что TADs являются важными функциональными единицами в геноме²⁹. Т.о., анализ TADs в качестве кандидатов на роль GSH может предоставить информацию об особенно перспективных локусах.

Чтобы адресовать эти вопросы, мы сначала проанализировали архитектуру GSH кандидатов у человека. Затем мы отобрали вне-генные GSH кандидаты на хромосоме 1, knocked-in HSV-TK ген, используя систему CRISPR/Cas9, и исследуя поведение трансгенов и пригодность HSV-TK/GCV системы в качестве пригодной и безопасной против туморогенности для будущих базирующихся на hiPSC терапий.

Figure 1

Generation of knockin hiPSCs carrying the HSV-TK transgene at the Chr1-eGSH locus. (A):Topological architecture of an extragenic genomic safe harbor on chromosome 1 (Chr-eGSH). Transcripts and putative topologically associated domains are shown. (B): Experimental flow to create knockin human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). (C): Schematic illustration of the WT and knockin alleles. The left and right homologous arms are indicated as HA?L and HA?R, respectively. The PCR primers used are shown as magenta arrows. Abbreviations: EFp, human elongation factor?1 α promoter; HSV-TK, herpes simplex virus thymidine kinase; IRES2, internal ribosomal entry site 2; puroR, puromycin resistant gene; pA, poly A. (D):Targeted knockin of the HSV-TK cassette detected by genomic PCR. No KI is an iPSC clone electroporated with vectors but without HSV-TK. The results for all isolated clones are shown in Supporting Information Figure S3. (E): Bright field and fluorescence images of the representative knockin iPSC line (TK#1). Scale bar: 100 µm. (F): HSV-TK expression levels in WT and knockin iPSCs. Relative expression to GAPDH (delta CT value) is shown. Data are represented as mean ± SD (n = 3 for each line). Abbreviation: N/D, not detected. (G): Relative expression levels of 5' and 3' proximate genes in WT and knockin iPSCs. Relative expression to GAPDH (delta CT value) is shown. Data are represented as the mean ± SD (n = 3 for each line).

Здесь мы показали, что кандидаты на роль GSH находятся среди архитектурных генов человека, AAVS1, CCR5, человеческий ROSA26, и вне-генный GSH локус на хромосоме 1 (Chr1-eGSH). Chr1-eGSH делает возможной мощную экспрессию трансгена, но на 2 Mb отстоящий ген внутри того же самого топологически ассоциированного домена обнаруживает аберрантную экспрессию. Хотя knockin iPSCs, несущих суицидальный ген, herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK), оказались достаточно чувствительными к ganciclovir in vitro, возникающие тератомы обнаруживали разные степени резистентности к лекарству in vivo. Наши находки подтверждают, что Chr1-eGSH не подходит для интеграции терапевтического гена и подчеркивают, что топологический анализ может облегчить использование GSHs человека для применения в регенеративной медицине. Наши данные показывают, что подход с HSV-TK/ganciclovir суицидным геном может быть не только адекватной защитой против риска тератом но и в комбинации с некоторыми др. подходами может снижать риски, ассоциированные с клеточной терапией.