В последние годы разработанная иммунная checkpoint-based иммунотерапия, такая как лечение PD-1/PD-L1 моноклональными антителами, используется при разных опухолях и обнаруживает хорошие клинические результаты. Однако, иммунные checkpoint воздействия эффективны только для небольшого количества раковых пациентов¹. Соотв. T клеточная терапия является быстро развивающимся методом иммунотерапии опухолей. Принцип внесения больших количеств in vitro размноженных эффекторных клеток пациентам, чтобы продуцировать вызвать непосредственный эффект уничтожения опухолевых клеток. Существует два типа генетически модифицированных специфических T клеток для adoptive иммунотерапии, chimeric antigen receptor T cells (CAR-T) и T cell receptor-engineered T cells (TCR-T), привлекательных для лечения пациентов со злокачественными опухолями^2,3. CAR-T клеточная терапия дает значительные клинические результаты при гематологических опухолях, но она специфична лишь для поверхностных антигенов и обнаруживает ограниченные возможности при солидных опухолях^4,5. Напротив, TCR-T клетки распознают фрагменты антигенов как пептиды, связанные с молекулами major histocompatibility complex (MHC) и дают хорошие клинические эффекты при лечении солидных опухолей. Три NY-ESO-1/HLA-A2-специфические TCR-T клинических испытания в 2011 и 2015 показали, что более 50% пациентов с синовиальной саркомой, злокачественной меланомой и множественными миеломами обнаруживают действительную клиническую реакцию, это побуждает к разработке новых TCR-T клеточных иммунотерапий^6-8.

Однако, описаны направленные на мишень вредные события при TCR генотерапии, целенаправленно воздействующие на дифференцировку антигенов меланоцитов, таких как melanoma antigen (MART)-1 или gp100, и т.д. Нормальные ткани. такие как кожа, головной мозг, экспрессирующие антигены со сходными последовательностями, обнаруживают перекрестное распознавание TCR-T клетками и тяжелые деструкции, особенно, когда используются TCR с высоким сродством. Т.о., оптимальный выбор антигенов является критическим для лечения с помощью TCR-T^9-11.

Раковые и тестикулярные антигены являются особенно привлекательными мишенями для иммунотерапии, поскольку они экспрессируются на высоком уровне в зародышевых клетках взрослых самцов или в раковых клетках, но не в нормальных взрослых тканях^12,13. Семейство антигенов Melanoma-associated antigen (MAGE) экспрессируется главным образом во многих злокачественных опухолях, таких как меланома, но обнаруживают низкий уровнь экспрессии в нормальных тканях. Иммунотерапевтические стратегии для воздействия на эти антигены хорошо изучены^14,15. Высокая экспрессия MAGE-A4, члена семейства MAGE-A, описана в раке яичников, меланоме, в не мелкоклеточном раке легких и сквамозно-клеточной карциноме пищевода16-18. Это указывает на то. что TCR-T клеточная терапия, нацеленная на MAGE-A4 осуществима и многообещающая при злокачественных опухолях.

Во время внесения экзогенных TCR в T клетки, присутствие эндогенных TCR, приводит к плохому сочетанию (mismatch) между двумя типами TCRs, это может привести к распознаванию неизвестных антигенов, экспрессирующихся в нормальных тканях и вызывать повреждения тканей. Существуют несколько вновь предложенных стратегий для минимизации риска от смешанных димерных TCR и улучшения экспрессии вносимых TCR, таких как zinc-finger nucleases, meganucleases, non-viral genome targeting, TALEN technology, CRISPR technology, TCR inhibitory molecular (TIM) пептиды, а также RNAi-обеспечиваемый TCR нокдаун^19-26. Редактирование генов с помощью zinc-finger нуклеаз является привлекательным подходом к подавлению экспрессии TCR, но он нуждается в длительном времени культивирования T клеток, а также включает множественные ступени сортировки, которые неудобны для клинического использования¹⁹. Мегануклеазы имеют только один домен, это затрудняет их преобразование. Более того, энзим очень дорогой для клинического использования²⁵. Для не вирусного целенаправленного воздействия на геном T клеток, огромным препятствием является токсичность высоких концентрация ДНК²⁰. Технология TALEN обладает высокой точностью и эффективностью в отношении воздействия на длинную последовательность гена, но плазмидная конструкция сложная и присутствуют также эффекты вне мишени²³. CRISPR технология проще, в низкую цену, легко конструируется и очень эффективна. Однако, присутствуют цитотоксичность и эффекты вне мишени²⁶. Др. исследовательским подходом для предупреждения GVHD, вызываемой allogen-реактивными Т клетками, такой как применение TIM пептида является привлекательной стратегией, которая разработана для CAR-T лечения и уже идут клинические испытания²⁷. Использование RNAi-обеспечиваемого редактирования гена, также быстрое, легкое с небольшим количеством экспериментальных ступеней и экономит временные затраты. Но этот метод не может полностью устранять функцию гена. Мы и наши соучастники выбрали RNAi-обеспечиваемое редактирование TCR с помощью ретровирусной трансдукции, которая использует протокол одноступенчатой трансдукции и вызывает эффективно снижение эндогенного TCR. Этот подход удовлетворяет нашу потребность избегать несоответствия между экзогенным и эндогенным TCR и демонстрирует лучшее T клеточное распознавание и уничтожение активности²⁸.

В данном исследовании мы оценивали использование этого метода RNAi-обеспечиваемого редактирование гена TCR у мышей и людей. Мы создали модифицированные по гену MAGE-A4-si-TCR T клетки, используя человеческие peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) и проверяли in vitro активность Т клеток. Затем мы вносили ген-модифицированные T клетки мышам NOD-SCID, несущими опухоли с или без HLA-A2402, чтобы оценить in vivo противо-опухолевую способность. Более того, мы предоставили клинические доказательства в случае маточной leiomyosarcoma, в которую вводили модифицированные по гену MAGE-A4 si-TCR модифицированные Т клетки.

Итак, мы разработали иммунотерапию с использованием человеческих лимфоцитов, трансдуцированных кодон-оптимизированным melanoma-associated antigen (MAGE)-A4 и HLA-A*2402-restricted TCR, которые специфически подавляли эндогенные TCR с помощью small interfering RNA (si-TCR). Мы оценивали эффективность этой иммунотерапиина NOD-SCID мышах и пациентках с маточной leiomyosarcoma. Установлено, что трансдуцированные человеческие лимфоциты обнаруживают высокую поверхностную экспрессию внесенных опухоль-специфичных TCR, повышенную цитотоксическую активность против антиген-экспрессирующих опухолевых клеток и повышенную продукцию interferon-γ за счет специфической стимуляции пептида MAGE-A4. Наблюдалась задержка роста опухоли у NOD-SCID мышей, которым инокулировали линию человеческих опухолевых клеток, экспрессирующую MAGE-A4 и HLA-A*2402. Более того, достигнут успех в применении в случае маточной leiomyosarcoma, леченной с помощью модифицированных по гену MAGE-A4 si-TCR/HLA-A*2402 T клеток. Полученные результаты показывают, что терапия с помощью TCR-модифицированных T клеток является многообещающей новой стратегией лечения рака.