Высокая гомология между геномами человека и мыши делает мышей наилучшими кандидатами для функциональных геномных исследований человека. Трансгенные мыши используются для изучения функции генов, патологии и терапевтических исследований. [1]. Глобальное сотрудничество для системной продукции нокаутных мышей для всех 25000 мышиных генов обеспечивается international knockout mouse consortium (IKMP). Разные методы, включая отслеживание генов и целенаправленное воздействие на гены или их комбинация были использованы для продукции нокаутных мышей [1,2]. Генный trapping индуцирует высокий выход, но случайность мутаций в неспецифических локусах мишенях, продуцируя большие количества модифицированных мышей. Напротив, генный targeting базируется на сайт-специфических модификациях эмбриональных стволовых клеток (ESCs) посредством гомологичной рекомбинации [1,3]. Традиционное получение генетически модифицированных мышей базируется на на целенаправленном воздействии на ген в ESCs, продукции химерных мышей и скрещивании, делающем возможной трансмиссию зародышевой линии, всё это сложно, трудоемко, дорого и требует много времени [4,5].

Методы продукции генетически модифицированных модельных животных улучшены с приходом новых геномных манипуляций [6,7]. Передовые методы целенаправленного воздействия на гены, включая способные к программированию энзимы, наводящие на ДНК домены, такие как Zinc finger proteins (ZFNs) или transcription factor-like activators (TALENs) подготовили почву для геномного инженеринга; однако, они трудны для приготовления и преобразования [8]. Напротив, РНК-направляемые clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) облегчают изготовление на заказ, они обеспечивают более высокую целенаправленную эффективность и облегчают мультиплексное редактирование генома для широкого круга типов клеток и организмов. В целом этот инструмент позволяет продуцировать генетически модифицированных мышей путем прямых in vivo манипуляций с генами (без культивирования эмбриональных стволовых клеток) с высокой эффективностью [9,10].

Естественно разрывы двойной нити ДНК (DSBs) репарируются за счет homology directed repair (HDR) или error-prone nonhomologous end joining (NHEJ) пути [3]. DSB, индуцируемые с помощью CRISPR/Cas9 также могут быть репарированы с помощью этих двух путей. HDR обычно активен только в делящихся клетках и эффективность репарации зависит от типа клеток и клеточного состояния, геномного локуса и матрицы для репарации [11], тогда как нокаутные гены продуцируются с помощью пути NHEJ путем индукции инсерций/делеций внутри кодируемого экзона, приводя к мутациям сдвига рамки считывания и преждевременным стоп-кодонам [12]. Двойные разрезы (nicking) также могут быть получены при использовании Cas9n (nicking mutant of Cas9), чтобы избегать активности вне мишени [10]. В целом редактирование, достигаемое с помощью CRISPR/Cas9 инструмента, может быть идентифицировано посредством SURVEYOR nuclease assay ил секвенирования ДНК (или Sanger или глубокого секвенирования). Чтобы оценить эффективность HDR, модифицированный регион амплифицируется и используется для секвенирования или анализа restriction-fragment length polymorphism (RFLP). Для обнаружения крупных делеций, вызванных NHEJ, используется метод двухступенчатого PCR слияния, чтобы присоединить bar-coded sequencing адапторы для мультиплексного глубокого секвенирования [10].

Первая ступень генерации трансгенных мышей с желательной модификацией посредством CRISPR/Cas9 - это внесение подготовленной sgRNAs в клетки (ESC или зиготу). sgRNA может быть доставлена в форме ДНК (плазмида или PCR amplicon), содержащей sgRNA-экспрессирующую кассету или in vitro транскрибированную РНК [10]. Cas9 также вносится в клетку в качестве плазмидной ДНК, in vitro транскриптов и рекомбинантного белка. Разные методы доставки, такие как электропортация, nucleofection, Lipofectamine-обеспечиваемая трансфекция, вирусные векторы, микроинъекци in situ описаны для переноса CRISPR компонентов в клетки [13]. Мыши с целенаправленно измененным геном в одном или множественных аллелях в основном генерируются с помощью прямых микроинъекций CRISPR в эмбрионы [14]. Более того, получение желательных мутантных мышей с использованием CRISPR возможно посредством продукции химерных мышей вследствие целенаправленного воздействия на ESC и/или лентивирусными манипуляциями с эмбрионами [15].

Миллионы людей во всем мире страдают от β-thalassemia, вызываемой точечной мутацией или маленькой делецией гена β-globin (HBB). Полное отсутствие или любое уменьшение синтеза цепи глобина в конечном итоге переходит в умеренную или тяжелую анемию [16,17]. Трансплантации аллогенного костного мозга и гематопоэтических стволовых клеток (HSC) являются лечебными при β-thalassemia, но они ограничиваются HLA-совместимостью здоровых доноров у большинства пациентов [18,19]. Недавно, ex vivo генотерапия и редактирование генов аутологичных стволовых клеток, трансдуцированных с исправленным геном β-globin были использованы для лечения β-haemoglobinopathies, таких как серповидно-клеточная болезнь и β-thalassemia [[20], [21], [22], [23], [24]].

Животные модели, мутантные по гену β-globin, помогают учёным продвинуться в разработке пре-клинических исследований для создания лечения гемоглобинопатий. Первая мышиная модель β-thalassemia была получена, базируясь на снижении экспрессии гена β^maj. Гомозиготные мутнные мыши были жизнеспособны, но лишены обнаружимых количеств белка β^maj и предоставили доказательства компенсаторного увеличения экспрессии гена β^maj. Гематологически они страдали от промежуточной формы талассемии, тогда как гетерозиготы обладали нормальными параметрами крови [25]. Было получено насколько knock out мышей для целенаправленного разрушения гена β^maj (гомозиготы летальны) [26], а также для целенаправленного разрушения β^maj и β^min генов (тяжелая форма талассемии у гетерозигот) [27,28]. Были получены также гуманизироанные модели путем замещения мышиных β^maj и β^min генов человеческим βIVS-2-654 (модель тяжелой талассемии у гетерозигот и летальности у гомозигот) [29]. Используя bacterial artificial chromosome (BAC), получили трансгенных мышей с локусом человеческого β-globin, несущего делецию в 4-bp в кодонах 41-42, обнаруживающих промежуточную симптоматику талассемии [30].

Здесь предоставляется точный протокол генерации модельных нокаутных мышей β-thalassemia с помощью целенаправленной делеции экзонов 2 и 3 в гене мыши Hbb-bs с использованием CRISPR/Cas9. Сначала готовили все пререквизиты CRISPR, включая преобразование и клонирование sgRNAs, и затем детальную продукцию нокаутных мышей, включая инъекции в пронуклеусы конструкции CRISPR в донорскую зиготу, имплантацию такой зиготы псевдо-беременным приемным мышам, отслеживание потомства и генотипирование для создания нокаутной линии мышей (Fig. 1).



Fig. 1. General overview and timing. (a) sgRNA design. Finding the desired exon(s) on ensemble.org, enter DNA sequence in the CHOPCHOP CRISPR search engine(http://chopchop.cbu.uib.no/), and select target sequence with the highest efficiency. Phosphorylate and anneal the partially complementary top and bottom oligos possessing suitable overhangs that is compatible for cloning into the vector. (b) Vector construction. Digest the Circular pX333 vector by BbsI and BsaI, sequentially for ligation of the guide sequences into the vector. Check the successful cloning by the designed primers. Note that you can alternatively purchase synthetic sgRNA and Cas9protein. (c) Microinjection and genotyping. The transgene DNA is injected to the mature male pronucleous of zygotes, then reimplanted to the surrogates (recipient CD1females). Finally, the three-week-old pups are screened for the desired microdeletion by PCR. PCR products are also sequenced directly using primers listed in

Table 1.

Это исследование показало, что микроинъекции плазмидной ДНК, кодирующей белок Cas9, вместе с dual sgRNAs, специфичными к гену Hbb-bs (hemoglobin, beta adults chain) способны разрывать последовательность мишени в экзонах 2 и 3. Инъекции приводят к нокауту аллеля с эффективностью около 10% в отношении делеции экзонов 2 и 3 и к 20% для indel мутаций.