Посещений:
БОЛЕЗНИ КРОВИ



Генотерапия

Gene therapy for blood diseases
Donald B Kohn
Current Opinion in Biotechnology Volume 60, December 2019, Pages 39-45



Genetic blood diseases


Генетические болезни крови включают те, что затрагивают белковые компоненты плазмы и те, что затрагивают клетки крови. Дефицит белков плазмы преобладает в клинике за счет гемофилии и дефицита др. факторов каогуляции, а также включает дефекты alpha-1-antitrypsin, компонентов комплемента (такие как Hereditary Angioedema-HAE), лизосомных энзимов и др. Генетические болезни клеток крови включают нарушения клеток специфических клонов (эритроцитов при hemoglobinopathies, популяции лейкоцитов при иммунных дефицитах и нарушениях хранения, тромбоцитов при некоторых болезнях кровоточивости) и те, что затрагивают гематопоэз в целом, такие как дефекты репарации ДНК (болезнь Fanconi's, врожденный дискератоз) (Table 1). Дефицит антител (X-Agammaglobulinemia, X-Hyper IgM, Common Variable Immune Deficiency) проявляются как дефекты плазматических белков, но базируются на дефектах клеток крови, прежде всего B лимфоцитов. 

Table 1. Genetic diseases of blood cells 
 

Hemoglobinopathies:
 Sickle cell disease
 Thalassemia (β- or α-)

Immune deficiencies:
 Severe combined immune deficiency (?20 genetic types)
 Chronic granulomatous disease (5 genetic types)
 Wiskott-Aldrich syndrome
 Leukocyte adhesion deficiency
 X-linked agammaglobulinemia
 X-linked Hyper IgM
 Hereditary lymphohistiocytosis (several genetic types)
 Immune deficiency, Polyendocrinopathy, Enteropathy, X-linked

Lysosomal storage/metabolic:
 X-Adrenoleukodystrophy
 Metachromatic Leukodystrophy
 Mucopolysaccharidoses
 Sphingolipidoses
 Pulmonary alveolar proteinosis

Stem cell defects:
 Fanconi's disease.
 Dyskeratosis congenital


Techniques for gene manipulation


Gene addition


первоначальные подходы к генотерапии использовали добавление новых генов у клетки с помощью разных вирусов и не вирусных доставщиков (Figure 1). В целом, нарушения белков пытались лечить с помощью in vivo генотерапии, тогда как дефекты клеток крови с помощью ex vivo генотерапии. In vivo подходы преимущественно использовали adeno-associated virus (AAV) векторы, которые могли сохраняться во многих тканях (напр. сетчатке, нейронах, печени, мышцах) годами. Ex vivo подходы в основном использовали ретровирусные и лентивирусные векторы, которые интегрировались в геном клеток и персистировали длительное время после ре-трансплантации клеток. Некоторые подходы оказывались эффективными на ранних стадиях развития [1].

Figure 1. Gene addition.

A transgene may be transferred to cells using viruses as vectors. Integrating viruses, such as lentiviruses or retroviruses, are often used for permanent gene transfer to dividing cells, such as hematopoietic stem cells and T lymphocytes. Persisting but minimally integrating viruses, such as adeno-associated virus (AAV) are often used for in vivo delivery of genes to tissues such as hepatocytes, neurons, muscle cells and retinal cells.

Gene editing


Совсем недавно разработаны методы редактирования генов, предоставившие новые возможности получения устойчивых модификаций генома, но сайт-специфическим способом(Figure 2). Редактирование генов применяется к генетическим болезням крови, с использованием in vivo подходов для модификаций клеток и ex vivo подходов для замещения белков. Предпочтительные методы для редактирования генов сегодня используют сайт-специфические нуклеазы для внесения разрывов двойной нити (DSB) ДНК с точной локализацией в геноме и затем используя пути клеточной репарации ДНК, чтобы вызвать соотв. редактирование генома [2]. Несколько классов 'искусственно созданных нуклеаз', которые могут направленно воздействовать на очень специфические сайты генома, включают Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription activator-like effector nuclease (TALENs) или Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats и CRISPR-associated protein 9 - CRISPR/Cas9). Эти нуклеазы могут быть внесены в клетки в качестве рекомбинантных белков, in vitro транскрибированных мРНК или expression плазмид путем трансфекции, электропортации, нано-частиц с помощью вирусных векторов.

Figure 2. Gene editing.

Gene editing may be initiated using a site-specific endonuclease, such as the CRISPR/Cas9 system, to produce a DNA double-strand break (DSB) at a target site in the genome. The DSB may be repaired by different DNA repair pathways. If no donor sequence is provided, non-homologous end joining (NHEJ) may repair the break, but introduce insertions or deletions (indels) at the repair site, which may be applied to cause gene disruption. If the cell is provided with a homologous donor sequence complementary to the DSB site, the cell may use homology-directed repair (HDR) to repair the DSB and introduce part of the donor sequence into the site, leading to sequence replacement with the intended change, such as correction of a mutation. A larger donor, consisting of a gene (cDNA, expression cassette) flanked by 5' and 3' homology arms (HA) complementary to the DSB, may undergo targeted insertion, either by HDR or by other repair mechanisms described as homology-independent targeted integration (HITI) or Precise Integration into Target Chromosome (PITCH).

Подходы с разрушением гена используют пути репарации ДНК non-homologous end-joining (NHEJ) , чтобы внести ряд инсерций или делеций (indels) вокруг того сайта генома, где нуклеаза вызывает DSB ДНК. Эти indels м. нарушать рамку трансляционного считывания нарушенного гена, предупреждая или снижая экспрессию. Исправление гена не только использует нуклеазу для внесения сайт-специфических DSB, но и также предоставляет последовательность из нуклеиновых кислот, комплементарную сайту мишени, но с желательной новой последовательностью, чтобы использовать путь репарации с помощью гомологичной рекомбинации ДНК. Инсерция гена использует гомологичный донор, в который внесена новая последовательность, такая как кДНК или expression кассета, отмеченная с флангов последовательностями, гомологичными тем, что на обеих сторонах разрезанного нуклеазой сайта (homology arms), чтобы обеспечить сайт-специфическую интеграцию с помощью гомологичной рекомбинации. Разработаны и методы целенаправленного воздействия на на геномные мишени без DSB.

In vivo gene therapy for hemophilia and other plasma protein deficiencies


В последние годы гено-терапевтические подходы к гемофилии предоставили клинике благоприятное для большинства пациентов частичные или полные исправления [3-7oo,8]. AAV векторы были разработаны, чтобы доставлять cDNA expression кассеты для Factor VIII или IX, при гемофилии A или B, соотв. Введенные внутривенно, AAV векторы избирательно трансдуцируют гепатоциты, где их геномы могут сохраняться как эписомы и непрерывно высвобождать фактор свертывания в кровь, в идеале декадами. Этот метод генотерапии постоянно прогрессирует за счет более эффективной продукции AAV векторов и высокого качества вновь разрабатываемых серотипов векторов с улучшенным тропизмом, оптимизацией контролирующих элементов генной экспрессии, включая использование варианта Factor IX (Padua), со значительно более высокой специфической активностью и лучшим клиническим использованием иммунных реакций, которые могут возникать против AAV белков в трансдуцируемых клетках [9-11oo,12]. Скорее всего, что один или более из этих продуктов генотерапии для гемофилии будет одобрен, как лицензированное лекарство в ближайшие годы. Первоначальные испытания сообщали, что при alpha-1-antitrpsin дефиците используются довольно низкие количества AAV-1 вектора, вносимого внутримышечно и достигающего в плазме уровня белка, недостаточного для терапии [13,14]. Генотерапия для др. дефицитов белков, включая дефициты др. факторов, HAE, и т.д. находятся на ранних пре-клинических ст. исследований.

In vivo gene editing


Генотерапия in vivo, использующая редактирование генов для генетических болезней крови, была изучена в немногих инициальных клинических испытаниях [15]. Эти испытания использовали AAV для доставки нуклеаз (ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9) в гепатоциты, чтобы внести гены, кодирующие факторы свёртывания или лизосомные энзимы для консервации нарушений (напр. Hunter's and Hurler's Syndrome) [16]. Нуклеазы делали возможной интеграцию гена в специфические геномные 'safe harbor' сайты, которые могут быть благоприятны для осуществления экспрессии трансгена (напр. локус гена albumin). Устойчивая in vivo экспрессия нуклеазного белка из сохраняемого AAV вектора может создавать проблемы или из-за нуклеазной активности per se или из-за иммуногенности белка.

Ex vivo gene therapy for blood cell diseases


Ex vivo генотерапия в основном осуществляется с использованием T клеток (эффекторных и регуляторных) и hematopoietic stem cells (HSC), при этом лишь немногие испытания использовали ген-модифицированные дендритные клетки или мезенхимные стволовые клетки. Для ex vivo генетических модификаций, которые делают клетки способными персистировать неразбавленными проходя через клеточные деления, необходимы устойчивые изменения генома. Такое постоянство достигается с использованием или интегрирующихся векторов (ретровирусных или лентивирусных или мобильных элементов) или геномного редактирования. Редактирование генов может быть достигнуто посредством кратковременной экспрессии редактирующих реагенов, ограничивающих потенциал генотоксичности или иммуногенности. Кратковременная экспрессия может быть достигнута с использованием не вирусных методов доставки (напр. электропортация мРНК или предварительно сформированных ribonucleoprotein (RNP) комплексов из Cas9 нуклеазы и целенаправленно действующей короткой гид (guide) РНК), или с помощью лентивирусных векторов с дефектами интеграции. Кратковременная экспрессия генов в HSC или T клетках может иметь и др. применение, такое как временная экспрессия продукта гена для временной модификации клеточной активности (напр. chemokine рецепторы, чтобы модифицировать homing, химерный антигеновый рецептор для ограничения продолжительности действия эффектора) [17].

Ex vivo T cell gene therapies


Модифицированные по Chimeric antigen receptor (CAR) T клетки, использованные на базе генотерапии для иммунотерапии рака, привели к заметному успеху с двумя лекарствами ныне разрешенными в США для лечения B lymphoid lineage malignancies [18]. Достигнут существенный академический и индустриальный успех, позволивший расширить эти подходы и к др. злокачественным новообрзованиям и использовать всё увеличивающийся набор методов, включая успешную разработку CARS, T клетончх рецепторов и др. новых веществ целенаправленого воздействия. Попытки преодолеть иммунное истощение, которое является основным ограничением эффективности, разрабатываются путем добавления дополнительных агентов к Т клеточной терапии, таких как цитокины и checkpoint ингибиторы [19].
Помимо использования для рака иммунотерапии, искусственно преобразованные т клетки могут быть использованы для лечения генетических болезней клеток крови, таких как первичный иммуннодефицит, Immune Dysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, X-linked syndrome (IPEX), или Hemophagocytic Lymphohistiocytosis (HLH), где восстановление Т клеточной активности может приводить к быстрой регрессии симптомов воспалительных заболеваний [20]. Генотерапия, базирующаяся на регуляторных Т клетках, также используется для лечения аутоиммунных болезней и для индукции толерантности к трансплантируемым органам и супрессии трансплантатов в противовес болезни хозяина. Анти-вирусная терапия, использующая antigen-selected T клетки, как было установлено, обладает высокой активностью против разных вирусных инфекций в условиях трансплантации и иммунодефицита [21].

Ex vivo hematopoietic stem cell (HSC) gene therapy


Имеется несколько десятков генетических болезней, затрагивающих продукцию или функцию одного или нескольких клонов кровяных клеток (Table 1). Каждая индивидуальная генетическая этиология (напр. ADA-SCID, X-linked SCID, Artemis-SCID, Rag1-SCID) нуждается в разработке своего собственного вектора с соотв. нормальным геном и известным процессом трансплантации с помощью клинических испытаний, приводящих в конце концов к регулируемому разрешению для проведения коммерческих и терапевтических испытаний. (Table 2). 

Table 2. Clinical trials of gene therapy with HSC for blood cell diseases  
 

Gamma retroviral vectors:
1
Adenosine deaminase-deficient SCID
2
Gaucher disease
3
Chronic granulomatous disease
4
Leukocyte adhesion deficiency
5
X-linked SCID
6
Wiskott-Aldrich syndrome

Lentiviral vectors:
1
X-Adrenoleukodystrophy
2
Metachromatic leukodystrophy
3
Adenosine deaminase-deficient SCID
4
X-linked SCID
5
Artemis-SCID
6
Wiskott-Aldrich syndrome
7
Chronic granulomatous disease
8
Leukocyte adhesion deficiency
9
Beta-Thalassemia
10
Sickle cell disease
11
HIV infection
Испытания по генотерапии с использованием HSC для болезней клеток крови начали обнаруживать эффективность с 2000, при этом используются улучшенные векторы и методы преобразования клеток и используется некоторая пред-трансплантационная химиотерапия, подготавливающая условия для 'создания пространства' позволяющего обрабатывать HSC ex vivo, чтобы эффективно трансплантировать их [22]. Первоначальные исследования использовали векторы, происходящие из gamma-ретровирусов, в основном вируса лейкемии мышей. Достигалась продукция высоких титров без заражения способными к репликации ретровирусами, которые гипотетически могли бы возникать в результате рекомбинации между ретровирусным элементом вектора и упаковочными плазмидами, продуцирующими MLV белки в транс-положении. Восстановление иммунитета достигалось у пациентов с тяжелыми первичными иммунодефицитами (X-SCID, ADA SCID, CGD и WAS) [23]. Однако, у некоторых людей возникали тяжелые побочные явления лейкемических трансформаций. Интегрированный ретровирусный вектор, индуцированный лейкемической трансформацией в одной из стволовых клеток благодаря активности энхансерных элементов вектора, вызывал транс-активацию клеточного прото-онкогена, соседствующего с интеграционным сайтом вектора. Исключение составляло то, что это осложнение не возникло у 40 пациентов с ADA SCID, леченных в этом исследовании. Фактически продукт клеточной терапии после первого успешного использования генотерапии для ADA SCID был лицензирован European Union (Strimvelis) [24]. Одно из более поздних исследований использовало gamma-ретровирусный вектор, который обладал делецией энхансерных элементов (так наз SIN вектор) для лечения пациентов с XSCID с хорошим восстановлением иммунитета и с отсутствием лейкемических осложнений, в дальнейшем были использованы векторные энхансеры в качестве основного драйвера для инсерционного онкогенеза [25].
Лентивирусные векторы, происходящие из элементов HIV-1 были разработаны в конце 1990s, используя принципы безопасной разработки, которые постепенно привели к gamma-ретровирусных векторам [26]. Ранняя фаза клинических испытаний с использованием SIN лентивирусных векторов продемонстрировала безусловную надежность в терминах связанных с вектором побочных явлений [27,28oo-32oo-37]. Не сущестует компетентных к репликации лентивирусов, которые могли бы гипотетически возникать в результате рекомбинации вектора и упакованных генов. Анализ сайтов интеграции с использованием высоко-производительного секвенирования не выявил предпочтительной интеграции вблизи онкогенов, ни существенной управляемой вектором клональной экспансии.
Важно, что доказательства клинического успеха были получены в большинстве исследований. X-ALD стала первой среди этих нарушений, где использовалась лентивирусная генотерапия с HSC и был выявлен благоприятный нейро-защитный эффект, подобный тем, что были достигнуты с аллогенными HSCT[27]. Очень впечатляющие клинические результаты были достигнуты у детей с Metachromatic Leukodystrophy, выявлено значительное улучшение конитивной способности по сравнению с естественным ходом болезни [31]. Для иммунодефицитов, испытания в отношении ADA-SCID, XSCID, Wiskott-Aldrich Syndrome и Chronic Granulomatous Disease оказались безопасными и эффективными, согласно первоначальным сообщениям, со значительным восстановлением иммунной функции у огромного большинства пациентов [29,30,35, 36, 37].
Гемоглобинопатии встречают больше всего препятствий, т.к. необходимы кассеты генов, чтобы экспрессировать beta-globin на очень высоких уровнях, они крупные и снижают тито векторов и трансдукционную активность. Несмотря на это достаточные уровни трансплантированных HSC с исправленными генами и последующими уровнями RBC с откорректированными генами были достигнуты снизить клинические симптомы у большинства пациентов с beta-thalassemia, а также у немногих пациентов с серповидно-клеточной анемией [34].
Сравнительно стандартные методы были использованы в таких испытаниях с GMP клеточным преобразованием HSC для модификации генов с помощью лентивирусных векторов. Были использованы обычные протоколы для обогащения CD34+ популяции стволовых клеток и клеток предшественников с помощью иммунно-магнитной сортировки после культивирования ex vivo в бессывороточной среде со множественными рано действующими рекомбинантными цитокинами (напр. ckit ligand, flt-3 ligand, thrombopoietin) в течение 2-3 дней, при этом лентивирусный вектор добавляли в культуру на 1-2 дня. При завершении трансдукции клетки были готовы для внутривенных вливаний или непосредственно свежими или после криоконсервации и оттаивания. Используя эти методы, перенос генов в стволовые клетки и клетки предшественников в целом довольно эффективен, при этом 50-90% происходящих из предшественников колонии формирующих единиц содержали вектор и давали хорошие уровни вектора в клетках крови, продуцируемых in vivo после трансплантации клеток (напр. количество копий вектора (VCN) в 0.5-2.0, у более 10-20% трансплантированных стволовых клеток с исправленным геном, что достаточно для исправления болезни при этих отобранных нарушениях. Нет сообщений о потере эффективности у этих пациентов (вплоть до 10 лет), это указывает на то, что ex vivo перенос генов не нарушает способности к долговременному пополнению популяции стволовых клеток, важное условие для реального на всю жизнь успеха.

Ex vivo gene editing


Один и тот же подход к редактированию генов был изучен при in vivo подходах для редактирования в кровяных клетках. ZFN, TALEN и CRISPR/Cas9 все оним используются в T клетках и HSC или для разрушения гена или коррекции гена или целенаправленной инсерции гена.
Испытания, которые были предприняты, чтобы целенаправленно воздействовать на T клетка, а затем и на HSC, использовали нуклеазы, чтобы разрушить ген, кодирующий HIV-1 ко-рецептор CCR5, чтобы получить HIV-резистентные T клетки и др. клетки крови [38-40]. Несколько испытаний было проведено с использованием нуклеаз, чтобы разрушить BCLA11A ген вызвать экспрессию плодного (gamma)-globin в качестве терапии как серповидно-клеточной болезни, так и beta-thalassemia. Поскольку большинство из этих нарушений характеризуется множеством разных мутаций у разных пациентов, 'one-size-fits-all' подход был использован, чтобы внедрить нормальный ген, который бы превзошел мутацию в дефектном гене хозяина.
Редактирование генов нуклеазами было использовано для внедрения генов, кодирующих chimeric antigen receptors (CAR) в локус T cell receptor-alpha в T клетках, как альтернативы для лентивирусной и ретровирусной трансдукции CAR гена [41oo,42]. Инсерция CAR гена в этот локус, который активен в Т клетках, привело к постоянной его экспрессии. Кроме того, разрушение TCRalpha гена с помощью инсерций CAR гена д. инактивировать экспрессию эндогенного TCR с помощью T клеток, потенциально тем самым ограничивая риск реакций вне мишени или аутоиммунно или аллореактивно.

Future directions


Для лечения дефицита плазменных белков были продолжены улучшения в разработке AAV вектора и продукции, оптимизации генных кассет и большинства клинических испытаний и терапевтических продуктов. Не-вирусные методы доставки in vivo, такие как наночастицы многих типов, были активно изучены, Кстати, ни один из них не превосходил эффективности AAV векторов, но подходы синтетической биологии могут привести к доставке устройств, которые будут более эффективны, специфичны и не токсичны. Для T клеток и иммунотерапии наиболее критическим вопросом является идентификация пригодных для целенаправленного воздействия специфичных для опухолей антигенов для большого числа раков, не пригодных к использованию CAR против поверхностных белков. Трансдукция HSC остается довольно сложным процессом и большие количества векторов необходимы для продукции клинически значимых количеств модифицированных CD34+ клеток. Это может существенно увеличить затраты на пациентов и ограничить доступность. Один из подходов, чтобы снизить потребность в векторе - это осуществление дальнейшего обогащения HSC, которые являются гетерогенной популяцией CD34+ клеток [43-45]. Некоторые малые молекулы были описаны как увеличивающие трансдукцию лентивирусных векторов в CD34+ клетки, это позволило бы использовать пониженные количества векторов не клетку и эти т. наз. 'transduction enhancers' были оценены в клинических испытаниях [46-49]. Стабильная упаковка клеточных линий способна снизить затраты и повысить продуктивность [50].

Summary


Gene therapy for blood diseases has greatly progressed and now is routinely providing clinical benefit to patients with a variety of conditions. This trend is expected to continue as the clinical scope expands and the technical capabilities advance.