Calpain - это внутриклеточная Ca²⁺-dependent non-lysosomal cysteine protease. У человека на сегодня известно 15 генов для изоформ calpain, которые определяются по присутствию протеазного домена. Лучше всего охарактеризованы изоформы calpain 1 (или µ-calpain) и calpain 2 (или m-calpain), которые нуждаются в micromolar (1 - 20 µM) и millimolar (0.25 - 0.75 mM) концентрациях внутриклеточного Ca²⁺ для активации, соотв. Calpains участвуют в широком разнообразии физиологических и патологических процессов. Нарушения регуляции экспрессии и активности calpain связаны с огромным количеством болезней, включая нейрологические нарушения, сердечно-сосудистые болезни и раковые опухли [1]. Нокдаун изоформ calpainin vivo и in vitro выявляет важные роли calpains в предупреждении и лечении hyperhomocysteinemia, hyperglycemia [2], диабетом индуцированных повреждений почек [3], воспаления легких [4], атеросклероза [5], и повреждений головного мозга [6, 7].

Молчание генов, обусловленное siRNAs, в 21- 23-nt двунитевой РНК, является механизмом деградации сиквенс-специфических РНК. В противоположность осязаемой и явной эффективности интерференции РНК in vitro, успешность siRNA-обусловленного замалчивания гена in vivo ограничено многочисленными барьерами, включая быструю очистку с кровью молекул менее 10 nm в размере, деградацию siRNA в кровотоке, неспецифическое накопление в ткани, плохое потребление клетками и неэффективное внутриклеточное освобождение [8]. Доставка голых или в комплексе с липосомами siRNA in vivo осуществляется с помощью двух основных подходов: локальное и системное применение. Успешность стратегии локального применения siRNA для доставки in vivo зависит от простоты siRNA упаковки, сайт-специфической доставки для получения локальных эффектов и пониженных доз для снижения риска эффектов вне мишени. Системные доставки с помощью внутривенных инъекций наиболее распространенный способ доставки siRNA в клинической практике [9].

Липосомы сегодня рассматриваются как наиболее успешные и эффективные переносчики лекарств. Эффективность липосом зависит от физико-химических свойств их компонентов и их размера, поверхностного заряда и организации липидов [10]. Катионные липосомы появились как привлекательные переносчики siRNA для системных трансфекций in vivo благодаря их благоприятным характеристикам, таким как способность к разложению, минимальная токсичность, отсутствие иммуногенности, относительная легкость крупномасштабной продукции, простота в использовании и высокая эффективность трансфекции in vitro. Многочисленные лаб. исследования [11-14] и клинические испытания [15-17] продемонстрировали потенциал катионовых липосом для генотерапии. Поскольку холестерол является одним из наиболее многообещающих конъюгатов siRNA, которые демонстрируют эффективную интерференцию РНК in vivo [13, 18, 19], поэтому холестерол был использован как эффективный липид "помощник" в dimethyl dioctadecyl ammonium bromide (DDAB) для изготовления катионовых липосом в нашей лаб. [4, 20, 21]. Катионовые липосомы с помощью важного для них поверхностного положительного заряда, соединяются селективно с эндотелиальными клетками посредством электростатического взаимодействия и обнаруживают значительное потребление эндотелием [18, 22, 23]. Благодаря крупной легочной сосудистой поверхности и доставке всего объема сердца в легочный кровоток, внутривенные введения комплекса siRNA/катионовые липосомы может быть использовано для избирательной доставки siRNA в эндотелиальные клетки легочных микрососудов [24-34].

Здесь мы опишем метод приготовления катионовых липосом путем смешивания холестерола и DDAB и затем доставки комплекса calpain 1 siRNA/катионовые липосомы мышам посредством инъекции в хвостовую вену, чтобы избирательно истощить calpain 1 в сосудистой сети легких. Эффективность обусловленной siRNA деплеции calpain 1 подтверждена с помощью Western blot анализа клеточных лизатов эндотелиальных клеток и не эндотелиальных клеток и конфокальной иммунофлуоресценции для прямого наблюдения экспрессии белка в эндотелиальных клетках легочных сосудов. Мыши, моделирующие вентилятором вызванные легочные повреждения также описаны, чтобы измерять эффекты in vivo нокдаун calpain в воспаленных легких.

Fig. 1 Scheme of a rotary evaporator.

The liposome is placed in the evaporation flask (right) which is rotated (100 rpm) by a motor unit. The flask is lowered into the water bath (40 °C). Chloroform is removed under vacuum and trapped by a condenser

Итак, использованная техника обусловила более чем 80% снижение уровня белка calpain 1 спустя 48 ч после одной инъекции комплекса calpain 1 siRNA (0.5 mg siRNA/kg)/катионовые липосомы. Мы также описали конфокальные изображения, чтобы определять потерю экспрессии calpain 1 в эндотелиальных клетках микрососудов легких.