Теломеры человека состоят из многих повторяющихся нуклеотидных последовательностей (5'-TTAGGG-3'), защищающих, позиционирующих и реплицирующих хромосомы [1, 2]. Человеческая теломера имеет длину в несколько пар тысяч оснований [3]. Эукариотические теломеры оканчиваются 3'-одноцепочечным выступом (overhang), который связан с комплексом из многих белков, известным как shelterin [4], который важен для поддержания теломер и capping [5], и защищает концы линейных хромосом от того, чтобы они не распознавались как разрывы двойной нити [6]. Неспособность аппарата репликации эукариотической ДНК реплицировать крайние концы хромосом позволяет клеткам постепенно укорачивать теломеры [7]. Вместе с началом клеточных делений почти все нормальные клетки человека подвергаются прогрессивному укорочению теломер. Как только теломеры достигают критической укороченной длины, они будут индуцировать сигнал повреждения ДНК, который часто обозначается как репликативное старение или клеточное старение [8]. Этот механизм, по-видимому, предупреждает геномную нестабильность и возникновение рака в старых клетках человека путем ограничения количества клеточных делений. Слишком короткие теломеры обладают потенциалом разворачиваться из их предполагаемой закрытой структуры, приводя к геномной нестабильности, потере хромосом и это может увеличивать чувствительность к раку [9].

Чтобы репарировать поврежденные теломеры в некоторых специальных клетках, для этого существует специализированный белок, наз. telomerase. Теломераза является естественным РНК-содержащим энзимом, который может синтезировать повторяющиеся теломерные последовательности [10], которые помогают поддерживать целостность генома в некоторых клетках, таких как эмбриональные стволовые клетки [11]. Теломераза является ответственной за элонгацию теломер посредством добавления теломерных повторов к концам хромосом [10]. Лишь около 5%-10% раковых опухолей человека используют путь альтернативного удлинения теломер (ALT) [12]. Редко клетки выходят из кризиса иммортализации посредством удлинения теломер с помощью или активированной теломеразы или ALT [13, 14]. Во время развития человека активность теломеразы заканчивается за счет замалчивания теломеразы обратной транскриптазы [15]. За исключением небольшого числа нормальных типов клеток, таких как делящиеся мужские сперматоциты зародышевой линии, некоторых типов стволовых клеток и определенных лейкоцитов, активность теломеразы в большинстве нормальных тканевых клеток подавляется. Однако активность теломеразы реактивируется в большинстве раковых клеток человека [16, 17], которые представляют собой потенциальную мишень для терапии рака [18, 19]. Многие ингибиторы теломераз были поэтому разработаны для лечения раков; однако, ни один из них не предлагается в качестве лекарства из-за побочных эффектов [19,20,21].

С обнаружением Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), был разработан CRISPR терапевтический потенциал лечения рака и др. генетических болезней [22]. CRISPR является RNA-guided системой иммунной защиты бактерий и archaea, чтобы защищать самих себя от экзогенных вирусов или плазмид [23]. В присутствии protospacer-adjacent motif (PAM) на оппозитной нити single guide RNA (sgRNA) может наводить CRISPR-associated protein 9 (Cas9) на сайт мишень для разрезания [24], приводя к возникновению разрывов двойной нити ДНК [25, 26]. Благодаря своим преимуществам CRISPR/Cas9 система широко используется для редактирования генома и оказывается многообещающей для биомед. исследований [27,28,29].

В данной работе путем комбинирования биологических функций теломеразы и CRISPR/Cas9, мы разработали новую противораковую генотерапию, наз. telomerase-activating gene expression (Tage). Используя теломеразную активность, эффекторный ген д. специфически экспрессироваться в раковых клетках с помощью Tage. С помощью использования Cas9 в качестве эффекторного гена, раковые клетки д. будут принуждены к гибели посредством Tage с использованием adeno-associated virus (AAV) в качестве.

Fig. 1 Schematic show of principle of killing cancer cells by Tage system. In this Tage system, an effector carrying a telomerase-recognizable 3' single-stranded sequence is transfected into cancer cells so that it can be elongated by telomerase, and produce a synthesized double-stranded telomeric repeat sequence. Simultaneously, artificial transcription factor expression vectors dCas9-VP64 and an sgRNA targeting telomeric DNA (TsgRNA) are cotransfected into cancer cells, which can produce the dCas9-VP64-TsgRNA complex that can recognize and bind with the telomerase-synthesized double-stranded telomeric repeat sequences. The expression of effector gene Cas9 thus can be activated. The expressed Cas9 protein can associate with TsgRNA to produce Cas9-TsgRNA complex, which can cut telomeres to produce DNA damage and thus induce the death of cancer cells. U6P U6 promoter, TsgRNA telomeric DNA-targeting sgRNA, CMV human CMV promoter, TRSE telomerase-recognizable stick end, MP minimal promoter, tDNA telomeric DNA, TF transcription factor

Итак, разные ингибиторы теломеразной активности были разработаны для лечения рака, но у всех были недостатки, обусловленные побочными эффектами. Здесь мы разработали систему telomerase-activating gene expression (Tage) путем использования теломеразной активности в раковых клетках. Система Tage состоит из вектора экспрессии эффекторного гена, который переносит 3' telomerase-recognizable stick end, и вектора экспрессии искусственного транскрипционного фактора, который может экспрессировать dCas9-VP64, и sgRNA, нацеленной на теломерные повторяющиеся последовательности. Путем использования Cas9 в качестве эффекторного гена, система Tage эффективно убивает различные раковые клетки, включая HepG2, HeLa, PANC-1, MDA-MB-453, A549, HT-29, SKOV-3, Hepa1-6 и RAW264.7, не затрагивая при этом нормальные клетки MRC-5, HL7702 и мезенхимные стволовые клетки костного мозга (BMSC). Более важно, что в 4 основания 3' stick конец, образуемый с помощью homothallic переключения эндонуклеазы в клетках, будет распознаваться с помощью теломеразы, позволяя системе Tage эффективно убивать раковые клетки in vivo. Система Tage д. эффективно и надежно реализовать свое применение in vivo путем использования adeno-associated virus (AAV) в качестве вектора для гена. Вирус с загруженной Tage системой д. значительно и специфически убивать раковые клетки мышей с помощью внутривенного применения лекарства без побочных эффектов или токсичности.