Спонтанная коррекция генов с помощью рекомбинации между гомлогами (IHR) происходит случайно и ослабляет генетические болезни крови и кожи^1-3. Используя преобразованные эндогенные гены в качестве репортеров, мы продемонстрировали, что коррекция генов с помощью IHR обычно редкое явление (~0.02%), но оно может быть простимулировано с помощью DSBs целенаправленно полученных с помощью CRISPR/Cas9 воздействия на обе гомологичные хромосомы; достигая частоты 0.5%. Далее мы установили, что истощение POLQ усиливает частоту IHR в 4 раза, доводя до 2%, и способствуя возникновению IHR в G2 фазе, когда рекомбинация между реплицируемыми гомологами может корректировать не только компаундные гетерозиготы, но и также аутосомно доминантные "gain-of-function" мутации, которые предоставляют специальный интерес для генотерапии. Стратегии, описанные здесь делают возможной оптимизацию IHR для генотерапии в разных типах клеток. Преимуществом является способность корректировать мутации с избыточной функцией, без необходимости в экзогенном доноре, и потенциал ограничивать повреждения кодирующей последовательности путем целенаправленного воздействия IHR на интроны. Чтобы систематически количественно предопределять и оптимизировать IHR, мы преобразовали эндогенный ген CD44 в клетках человека HT1080, чтобы описывать IHR события с помощью проточной цитометрии. HT1080 представляют собой подходящую модель, т.к. они экспрессируют функциональный P53, сохраняя диплоидный кариотип в культуре^{4, 5} , а их высоко эффективная клонируемость упрощает молекулярный анализ рекомбинантов. Ген CD44, содержащий 18 экзонов и длиной в 94 kb на хромосоме 11p, был модифицирован, чтобы получить мощные и готовые к обобщению репортеры с помощью целенаправленной мутации экзона 1 на одном аллеле и экзона 17 на др. (Fig. 1a, top).

CD44 кодирует гликопротеин клеточной поверхности, экспрессируемый большинством клеток. Клетки, которые экспрессируют функциональный белок (sCD44+) могут быть отловлены (scored) с помощью проточной цитометрии после окрашивания коммерческими антителами. Кроссоверная рекомбинация между мутациями в экзоне 1 и 17 в преобразованной HT1080 - K1 CD44^{- /-} линии генерирует sCD44+ клетки двух отличающихся фенотипов (Fig. 1a, below ). IHR, приводящий к взаимному обмену генетической информацией, будет генерировать одного гомолога без мутаций, а другой с двумя мутациями (слева). IHR, приводящая к потере гетерозиготности (LOH), нейтральной для копирования, заменит правильную последовательность для теломер проксимальнее мутации в экзоне 1 в одной дочерней клетке (справа). Подобный исход IHR, который может корректировать аутосомно доминантные ("избыточность функции") мутации как показано в Supplementary Fig. 1, был оценен количественно с помощью RFLP анализа sCD44⁺ рекомбинантов. Частота клеток sCD44⁺ определялась с помощью проточной цитометрии в обычных пролиферирующих культурах преобразованных CD44^-/- HT1080-K1 клеток определялась как 0.1; Fig. 1f). Напротив, DSBs, происходящие в разных местах двух гомологов ("offset" скорее, чем "aligned" сайты), стимулируются IHR, чтобы достичь частот порядка 0.23-0.60%, что достоверно выше частот DSBs , вызываемых в одном гомологе.

Частоты оказались сравнимыми для offset DSBs, разделенных 3 bp (gRNAs W+Y, W+Z, X+Y and X+Z) и 0.6 kb (by gRNA pairs M+Y or M+Z) или 3.5 kb (by gRNA pair V+Y or V+Z). IHR, инициированная с помощью DSBs, предсказуемо генерирует клоны, в которых регион, фланкированный с помощью DSBs, делетируется в одном гомологе и подвергается удвоению в другом (Supplementary Fig. 2). PCR амплификация рекомбинационных соединений в индивидуальных sCD44⁺ рекомбинантах, возникающими в результате IHR, инициированной с помощью gRNAs M и Y, которая расщепляет по сайтам offset by 0.6 kb, выявляет клоны, несущие эти предсказываемые делеции/тандемные дупликации, а также клоны, в которых амплифицированный регион был размером с родительсую ДНК, как это предсказывается продуктами гомологичной рекомбинации, в соотношении приблизительно 5:1. RFLP анализ показал, что частоты LOH в экзоне 1 были сходны среди рекомбинантов, инициированных с помощью aligned и offset DSBs [5.8% (6 из 104) и 4.6% (4/88), соотв. RFLP анализ SNPs rs85074 и rs7950932, который картирует 3.1 и 33.2 Mb теломерной части CD44, показал, что имеется полная корреляция между гомозиготностью экзона 1 и гомозиготностью этих SNPs (rs85074, 5 из 5; rs7950932, 4 из 4), и гетрозиготностью по экзону 1 и гетерозиготностью по этим SNPs (rs85074, 67 из 67; rs7950932, 24 из 24). Экзон 17, который находится проксимальнее к центромере, был гетерозиготным во всех 72 протестированных клонах, включая 5, которые были гомозиготными по экзону 1. Эти результаты демонстрируют, что небольшая фракция IHR приводит к LOH, которая распространяется от места рекомбинации к теломере. Вклад гомологичной рекомбинации в IHR далее был исследован с помощью истощения факторов гомологичной рекомбинации BRCA2, который способствуует канонической HDR при загрузке RAD51 на отрезанные концы ДНК⁶ ; или RAD52, который поддерживает отжиг (annealing) нитей на путях, которые не зависят от BRCA2/RAD51. Воздействие с помощью или siBRCA2 или siRAD52 перед трансфекцией Cas9 RNPs не достоверно влияет на частоты IHR как aligned, так и offset DSBs (Fig. 2a). Эти результате подобно молекулярному анализу, представленному выше, показывает что только минорая фракция IHR событий осуществляется с помощью гомологичной рекомбинации. Вклад канонического nonhomologous end-joining (c-NHEJ) был протестирован с помощью истощения DNA-Protein Kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) и DNA ligase 4 (LIG4)^{7, 8} (Fig. 2b). Истощение DNA-PKcs вызывало умеренное, но достоверное увеличение частоты IHR для offset и aligned DSBs (1.2- и 1.3-fold, соотв.; p = 0.008 и 0.003). Истощение LIG4 также вызывало умеренное, но достоверное увеличение частоты IHR для offset (1.5- раз; p = 0.001), но не для aligned (1.1-раз; p = 0.11) DSBs. Т.о., факторы c-NHEJ умеренно ингибируют IHR при целенаправленной индукции DSBs, вообще-то способствуя воссоединению разрезанных концов в цис-положении. Вклад alternative end joining (altEJ) был проверен с помощью истощения POLQ, который кодируется с помощью ДНК Polq, helicase и translesion polymerase, которая играет критическую роль в репарации DSBs, индуцируемых с помощью разных механизмов, включая остановку репликационной вилки, CRISPR/Cas9 расщепление и ионизирующая радиация^8-15. Истощение Polq, как известно, подавляет altEJ, но стимулирует гомологичную рекомбинацию^{16, 17}. Поразительно, истощение POLQ стимулирует IHR в 4 раза или более, увеличивая частоту IHR до 2% при offset и aligned DSBs (Fig. 2c; p = 2.0 x 10-5 and 2.9 x 10-8 ). RFLP анализ определил LOH по экзону 1 в 6.7% (5/75) из sCD44⁺ рекомбинантов по сравнению с siNT2-обработанными контрольными клетками и в 44.4% (24/54) из sCD44+ рекомбинантов из клеток, обработанных siPOLQ .

Т.о., истощение POLQ повышает частоты IHR, особенно IHR, приводящую к LOH. IHR в G2 фазе, но не в G1 фазе может приводить к LOH (Fig. 2d). Фракция рекомбинантов, которые происходят из G1 и G2 фазы событий IHR, оценивали на основе частоты LOH среди рекомбинантов sCD44⁺. Исходя из предположения, что рекомбинантные хромосомы сегрегируют с равной вероятностью в одну и ту же или в разные дочерние клетки в ходе G2 фазы IHR, поэтому должны быть равные количества sCD44⁺ рекомбинантов, продуцируемых в G2 фазе, которые обладают или не обладают LOH (Fig. 2d). Исходя из этого, мы подсчитали, что в клетках, обработанных контрольными siNT2, 13.4% (2 x 6.7%) из рекомбинантов были генерированы в G2 фазе а оставшиеся 86.6% в G1 фазе; а в клетках, истощенных по POLQ, 88.8% (2 x 44.4%) рекомбинантов были сгенерированы в G2 фазе и 11.2% в G1 фазе (Fig. 2e). Относительные частоты фаз G1 и G2 событий IHR были подсчитаны после деления фракции G1 фазы рекомбинантов на два, т.к. каждая G1 фаза события рекомбинации дает две дочерние клетки, которые являются sCD44⁺, тогда как каждое событие G2 фазы продуцирует только одну (Fig. 2d). Соотношение IHR событий в G2:G1 фазе составляло приблизительно 1:3 (13.4% по сравнению с 86.6%/2=43.3%) в обработанных siNT2 контрольных клетках и 16:1 (88.8% по сравнению с 11.2%/2 = 5.6%) в клетках, обработанных siPOLQ. Т.о., истощение POLQ вызываемое в G2 фазе, увеличивает эффект в 48 раз (Fig. 2e). Эти результаты указывают на то, что Polq обычно играет критическую роль в обеспечении того, что нерепарируемые DSBs не будут сохраняться в G2 фазе, ограничивая тем самым IHR, сопровождаемую LOH , а также, вообще-то, ограничивая транслокацию. Идентификация подавления Polq в качестве новой стратегии, чтобы стимулировать IHR между реплицируемыми гомологами в G2 фазе, повышает способность коррекции аутосомных доминантных мутаций, которые объясняет существенную фракцию генетических болезней человека, и представляет особую проблематичность, т.к. эти болезни не являются кандидатами для ген-замещающей терапии. Сопровождающие copy-neutral LOH могут ограничивать пригодность этой стратегии в некоторых контекстах, тем не менее существуют доказательства, что спонтанная коррекция генов ослабляет некоторые болезни^1-3 четко указывая, что некоторые гены и типы клеток д. быть послушными. Подавление Polq, достигаемое здесь с помощью воздействия siRNA может альтернативно облегчено с помощью малых лекарственных молекул, разрабатываемых сегодня для подавления репарации с помощью Polq, что позволяет раковым клеткам противодействовать терапии, вызывающей повреждения ДНК. Реципрокный end-joining путь, идентифицированный здесь, поддерживает IHR до частот приблизительно в 0.5% в контрольных клетках и до 2% в клетках, истощенных по POLQ. Частоты в этих пределах ожидаются в качестве пригодных для генотерапии, особенно, если корректируемые клетки обнаруживают преимущества в приживлении трансплантатов или пролиферации. IHR была документирована в эмбриональных стволовых клетках мышей и линиях B-lymphoblastoid клеток человека^18-21, но со значительно более низкими частотами, которые, скорее всего, отражают целенаправленное возникновение DSBs только на одном из гомологов. Соединение концов было недавно постулировано для поддержания IHR, которая репарирует компаундные гетерозиготные мутации, ассоциированные мышиными моделями наследственной tyrosinemia type 1 и mucopolysaccharidosis type I²². Может оказаться возможным стимулирование соединения концов, для коррекции мутаций, обнаруживаемых в разнообразных типах клеток млекопитающих с помощью IHR.