Посещений: 
буллезный эпидермолиз
Терапевтические подходы
Functional therapies for cutaneous wound repair in epidermolysis bullosa PatriciaPeking, UlrichKoller, Eva M.Murauer  Advanced Drug Delivery Reviews
Volume 129, April 2018, Pages 330-343 https://doi.org/10.1016/j.addr.2017.12.003
| |
|
Наследственный epidermolysis bullosa (EB) представляет группу редких генетических нарушений кожи, вызываемых аутосомно доминантными и рецессивно доминантными мутациями в одном из описанных 19 разных генов, кодирующих белки, критические для слипчивости эпидермиса с подлежащей дермой [1-3]. EB характеризуется структурной и механической ломкостью кожи в basement membrane zone (BMZ), и др. эпителиальных структур, это обусловлено отсутствием или нарушенной функцией затронутых белков и сборки структур высшего порядка, таких как промежуточные филаменты, полудесмосомы или закрепляющие фибриллы [4].
EB обычно подразделяется на simplex (EBS), junctional (JEB) и dystrophic (DEB) формы, а также Kindler Syndrome, в зависимости от уровня нарушений соединения между эпидермисом и дермой, внутри или ниже базальной мембраны [1] (Fig. 1A). Эти признаки и симптомы нарушения занчительно варьируют между разными подтипами, а также между разными индивидами. В целом, в то время как в умеренных случаях возникающие волдыри преимущественно затрагивают ладони и стопы, тяжелые формы EB характеризуются генерализованной ранимостью кожи и опустошительными волдырями кожи, возникающими при малейших травмах, это очень сильно нарушает качество жизни пациентов (Fig. 1B-D). Некоторые типы EB могут затрагивать глаза, язык и пищевод, а некоторые продуцируют калечащие рубцы после ран на коже, а также повреждающие скелетно-мышечные деформации [5]. EB раны имеют тенденцию превращаться в хронические раны и часто колонизируются бактериями. Такие хронические изъязвления, как полагают, являются главной причиной возникновения агрессивной сквамозно-клеточной карциномы, которая приводит к преждевременной гибели [6].
Fig. 1. Typical skin appearance in EB.
(A) Simplified depiction of the skin layers showing representative proteins for the four different EB types as wells as their cleavage level. The BMZ consists of the basal keratinocyte layer, the lamina lucida, the lamina densa and the sublamina densa. ECM components secreted by basal epidermal keratinocytes, which are located in the basal epidermal layer, construct the BMZ. (B-D) Typical phenotypic characteristics of (B) JEB (C) EBS and (D) DEB. Fotos by R. Hametner
Терапевтические подходы
3.1.1. Viral-based ex vivo strategies
С тех пор как ex vivo генотерапия была осуществлена на генетических заболеваниях, таких как дефицит adenosine deaminase, вызывающий тяжелый комбинированный иммунодефицит (ADA-SCID) [45], [46] или X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) [47], то была использована первая генерация ретровирусных векторов для клинического применения. Эти вектора первоначально происходили из murine leukemia virus (MLV), и эффективно экспрессировали трансген под контролем long-terminal repeat (LTR) промотора. Однако, MLV, как известно, обнаруживает склонность к интеграции в активно транскрибируемую ДНК, способствуя энхансерным и активных генов промоторным регионам, это увеличивало риск инсерционного онкогенеза [48-50]. Злокачественная трансформация была описана у леченных пациентов с X-SCID, где случайная интеграция ретровирусного вектора вблизи локуса прото-онкогена приводила к возникновению клонов T клеточной лейкемии [51]. Однако, не наблюдалось подобных побочных эффектов при др. клинических испытаниях, нацеленных на гематопоэтические клетки пациентов с ADA-SCID , или в многочисленных испытаниях- проводимых с ген-модифицировнными Т клетками, когда было использовано первое поколение LTR-управляемых ретровирусных векторов [45]. Клиническая безопасность такого типа векторов была подтверждена также у 7-летнего EB пацента после трансплантации аутологических кератиноцитов, генетически исправленных с помощью MLV ретровирусного вектора [14], [52]. Несколько классических ретровирусами-обеспечиваемых ex vivo стратегий замещения генов для JEB и RDEB на пути в клинику [16], [17], [53-56].
Напротив, ретровирусные вектора, лентивирусы, такие как human immunodeficiency virus 1 (HIV-1), способны трансдуцировать делящиеся и неделящиеся клетки [57], интегрируясь преимущественно в активные гены, расположенные внутри богатых генами плотных хромосомных регионах [58]. Хотя эти внутри-генные регионы, по-видимому, являются более безопасными сайтами по сравнению с точками старта транскрипции, было предпринято множество усилий, чтобы повысить профиль безопасности используемых сегодня вирусных векторов. Использование self-inactivating (SIN) векторов, лишенных энхансерного или промоторного элементов LTR, может стать подходящей ступенью для снижения риска инсерционного мутагенеза, обусловленного активацией генов, при этом недостаток снижения титров векторов, влияет на их использование [59]. Однако, SIN вектора уже продемонстрировали свой потенциал в качестве стабильного транспортного средства для RDEB и JEB-ассоциированных генов COL7A1 и LAMB3 [60-66]. Остаточный риск инрсерционного мутагенеза, приводящий к возникновению опухолей, остается, но кожа является легко доступным органом, облегчающим лечение побочных событий. Потенциальное появление побочных событий, таких как образование опухолей может быть распознано на ранних стадиях и может быть проведено хирургическое удаление.
Альтернативно не интегрирующиеся вирусные системы, включая adenoviral или adeno-associated virus (AAV) вектора, д. снижать риск инсерционного мутагенеза. Установлено, что AAV вектора серотипа 2 могут быть успешно оптимизированы с помощью преобразования капсид для повышения эффективности трансфекции в аутологичных кератиноцитах человека [67]. Chamorro et al. успешно продемонстрировали комбинированное использование adenoviral и AAV систем доставки лоя внесения генетической отредактированной конструкции в кератиноциты пациента с целью коррекции специфических мутаций в DEB ассоциированном гене COL7A1[68]. В частности AAV вектора могут быть использованы для внесения однонитевой ДНК, служащей в качестве донорской матрицы для гомологичной рекомбинации, увеличивая тем самым эффективность таргетинга в кератиноциты [69].
3.1.2. Non-viral-based ex vivo strategies
Главными преимуществами использования не-вирусных переносчиков являются низкая токсичность и иммуногенность и тем самым повышенный профиль надежности по сравнению с вирусными векторами. Кроме того, не-вирусные доставщики дешевле в отношении их продукции, особенно, когда необходимы большие количества для клинического использования [70]. Однако, в целом эффективность трансфекции кератиноцитов человека низкая при использовании не-вирусной доставки. Это можно обойти путем селекции специально нацеленных клеточных клонов после обработки, это кажется интересным благодаря недавней разработке нуклеаз. Для редактирования генов с помощью сконструированных нуклеаз лишь одно вмешательство необходимо для постоянной коррекции мутантного гена в клетках. Следовательно, нет нужды в стабильной экспрессии трансгена, необходимой при системах вирусной доставки, это позволяет избегать риска инсерционного мутагенеза [71].
Самый легкий способ временной доставки ДНК в ядро клетки является использование плазмид, которые несут ткане-специфичные промоторы, энхансерные элементы или др. регуляторные элементы, необходимые для экспрессии трансгена. Использование minicircle плазмид может еще больше увеличивать эффективность трансфекции в кератиноциты, т.к. они имеют редуцированные размеры по сравнению с др. плазмидами в результате отсутствия бактериальных последовательностей остова [72], [73].
Хотя терапевтический подход ex vivo имеет некоторые крупные преимущества, такие как возможность целенаправленно воздействовать на стволовые клетки и осуществлять оценку безопасности перед трансплантацией пациенту, но он также имеет и недостатки и проблемы перед стратегией in vivo.
Трансплантации клеток от природы более инвазивны и нуждаются в анестезии. Более того, хронические раны кожи при EB , по-видимому, вызывают истощение стволовых клеток кожи со временем, приводя к меньшему успеху по выделению достаточных количеств само-обновляющихся стволовых клеток для коррекции in vivo.
3.2. In vivo
Благодаря прогрессу в разработке различных технологий, таких как генерация безопасных оптимизированных вирусных векторов и молекул, модифицирующих геном/РНК, необходимы соотв. методы in vivo для доставки отрепарированных молекул посредством stratum corneum в благоприятные слои кожи (Fig. 2). Критические факторы, подобные эффективной доставке молекул и болевое воздействие на пациентов во время и после лечения следует принимать во внимание.
3.2.1. Intradermal/intravenous injection
Инъекция представляет собой быстрый, дешевый и эффективный способ доставки почти любого типа молекул в тело [74]. Независимо от терапевтических подходов при EB, внутридермальные и внутивенные инъекции в основном используются для клеточной терапии, подобно инъекциям аллогенных фибробластов, мезенхимных стволовых клеток и дикого типа клеток костного мозга, улучшающих заживление ран у EB пациентов[10-13], [75]. Инъекции внутрь кожи требуют использования у пациентов кожных ран или краев ран, которые очень болезненны. Кроме того, они обладают лишь небольшим радиусом диффузии, это делает их непригодными для лечения крупных поврежденных областей[76]. Снижение боли и возможное улучшение общей стабильности кожи достигается внутривенными инъекциями, но прямое введение репараирующих молекул в кровоток может сопровождаться более тяжелыми побочными эффектами. Инъекции репарирующих молекул в кожу и кровоток пациентов для функциональной терапии EB пока не производятся, но пре-клинические данные существуют. Подкожные инъекции анти-смысловых олигонуклеотидов (ASO) для индукции в COL7A1 пропуска экзонов 73, 80 и экзона 105 при DEB xenograft мышиных моделей продемонстрировало их успешность [77], [78]. Внутрикожные инъекции siRNAs для лечения genodermatosis pachyonychia congenital оказались успешными у одного пациента [79], указывая на возможность их адаптации к доминантно наследуемой форме EB.
3.2.2. Microneedles
По сравнению с инъекциями с помощью подкожных игл, использование микроигл для доставки молекул в кожу пациентов хорошо переносится и безопасно. Сначала совершали толстой микроиглой предварительное воздействие на кожу, чтобы сделать её более проницаемой для лекарств. Затем стали использовать микроиглы др. типа, a) микроиглы, покрытые лекарством, которое высвобождалось в коже, b) полимерные микроиглы покрывали лекарством, которое полностью растворялось в коже, c) микроиглы с просветами, которые вливали лекарство в кожу [74]. Микроиглы уже используются для вакцинации [80], локальной анестезии [81], для доставки инсулина субъектам с диабетом 1 типа [82], [83]. Кроме того, производятся успешные доставки с помощью микроигл плазмидной ДНК и siRNAsв кожу мышей [84], [85]. Недавно, Dul et al., продемонстрировали доставку плазмидной ДНК с помощью микроигл с просветом в живую иссеченную кожу человека. Эффективная экспрессия генов наблюдается преимущественно в эпидермисе, но также в папилярной дерме [86]. Этот способ доставки безусловно обладает высоким потенциалом для доставки терапевтических молекул при EB ы кожу.
3.2.3. Gene gun-mediated particle bombardment
Альтернативный способ использования игл представляет бомбардировка biolistic частиц посредством генной пушки (gene gun), когда золотые частицы, покрытые ДНК, внедряют в клетки ткани мишени посредством газа под давлением с высокой скоростью [87]. Первоначально подход с gene gun был использован у растений и для облегчения прямой трансформации тотипотентной ткани, типа пыльцы, зародышей и меристемы [88]. Затем было опубликовано несколько исследований, доставка с помощью gene gun специально была использована для индукции антиген-специфичной иммунной толерантности [89], [90]. Год назад in vivo бомбардировка маркерных генов проводилась в кожу грызунов, а также в мышцы, печень и головной мозг и вызывала временную экспрессию генов, демонстрируя пригодность такой доставки генов в разные ткани млекопитающих [91], [92]. Независимо от разработки терапевтических подходов для EB, бомбардировка частиц оказалась успешной для эффективной доставки Col7a1 отрепарированной молекулы в кожу мышей дикого типа [73] и уже была применена у DEB модельных мышей, что приводило к частичной коррекции DEB фенотипа без индукции волдырей непосредственно в месте бомбардировки (Peking et al., unpublished observations). Критическим фактором для доставки ДНК в кожу является используемое давление, чтобы поразить мишени базальные кератиноциты, а также фибробласты, необходимо давление в 400 psi для мышей [89] и до 800 psi для кожи человека [93]. Лечение DEB модельных мышей с использованием рекомендованного давления не вызывало ни непосредственного, ни отсроченного образования волдырей, что подкреплено гистологическим анализом спустя неделю после бомбардировки (Peking et al. unpublished observation). Следовательно, этот подход принципиально применим для слабой кожи EB пациентов [73].
3.2.4. Nanoparticles
Наночастицы становятся популярными в качестве доставки терапевтических молекул, таких как лекарства и гены, а также для преобразования тканей. Большинство инъецируется в тело, чтобы проникать в кровеносные сосуды прежде чем достигнуть сайта мишени, наночастицы используются для разработки терапии рака, диабета, аллергии, инфекций и воспаления. Наностицы собираются из органических, неорганических или полимерных материалов и обнаруживают быструю абсорбцию и высвобождение [94]. В здоровой коже stratum corneum формирует естественный барьер от проникновения частиц, особенно в болезненной коже, как в случае EB, доставка терапевтических наночастиц представляет собой многообещающих подход [95]. Базирующиеся на полимерах наночастицы, как было установлено, обладают высоким потенциалом для лечения кожных болезней, поскольку у них стабильная структура после местного применения и контролируемого проникновения активных инградиентов. Такие наночастицы были использованы в качестве переносчиков для dexamethasone для лечения псориаза, а также в качестве носителей для инактивации экспрессии генов при pachyonychia congenital [96]. Недавно, Cutlar et al. использовали полимер, слитый с не-вирусным вектором, экспрессирующим COL7A1 кДНК полной длины для терапии in vivo RDEB мышиной модели, базирующейся на ксенотрансплантации. Спустя 5 дней после местного применения обнаруживалась экспрессия типа VII коллагена при BMZ, и продолжала обнаруживаться в течение 10 недель после местного применения [97]. Однако, существует большой диапазон нано-преобразуемых материалов, из которых некоторые обнаруживают очень сложный состав. Поэтому прогнозы относительно побочных эффектов трудно предсказать.
4. Functional therapies in autologous skin cells
Некоторые стратегии функциональной терапии EB активно исследуются (список в Table 1), замещение генов, генное редактирование и некоторые целенаправленные подходы, нацеленные на РНК (summarized in Fig. 3A-C).
Table 1. Functional therapies in epidermolysis bullosa targeting autologous keratinocytes and/or fibroblasts.
4.1. Gene replacement therapy
Логическим путем восстановления экспрессии и функции отсутствующего белка является постоянное обеспечение соотв. кодирующей последовательности (cDNA) в клетках мишенях. Первая аутологическая терапия была применена у EB пациентов в виде терапии по замещению гена, для компенсации дефектного гена с помощью ретровирусной трансдукции его полной длины cDNA в кератиноциты пациента [14], [15], [17], [98].
Первая гено-заместительная терапия произведена в 2006 в Италии у пациента с laminin-332 зависимым JEB. Кожа пациента обнаруживала возникновение волдырей с рождения из-за гетерозиготных мутаций в гене LAMB3. Кератиноциты, выделенные с помощью биопсии из ладоней пациента, подверглись трансдукции ретровирусного вектора, экспрессирующего полной длины LAMB3 cDNA под контролем MLV LTR промотора. Трансдуцированные клетки выращивали на пригодных к трансплантации эпидермальных слоях in vitro, а затем их трансплантировали в ноги пациентов. Наблюдалась полная регенерация эпидермиса и после этого пациент в течение 7 лет демонстрировал устойчивый синтез белка LAMB3 вместе с укреплением адгезии эпидермиса. Не было получено доказательств образования волдырей, воспаления, образования опухолей или иммунной реакции в области трансплантации [14], [52].
В 2014, второй пациент, страдающий от JEB подвергся сходному лечению. В этом исследовании аутологические эпидермальные стволовые клетки корректировали путем замещения гена, используя тот же вектор, и сперва он был трансплантирован в неизлечимую рану, что сопровождалось протоколом good manufacturing practice (GMP). Анализ спустя 1 год после этого продемонстрировал регенерировавший, лишенный волдырей эпидермис, устойчивый к внешним воздействиям, нормальные уровни экспрессии laminin-332 и отсутствие ауто-антител против вновь синтезируемого белка [15].
Эти исследования демонстрируют, что трансплантации генетически исправленных аутологических стволовых клеток кератиноцитов делают возможной генерацию длительно длящегося, функционального и само-обновляющегося трансгенного эпидермиса, способного вылечить тенденцию к образованию волдырей и др. неизлечимых ран кожи у JEB пациентов [14], [15], [52], [98].
Сходное исследование было предпринято в Stanford, CA, у RDEB пациентов, показавшее, что этот подход осуществим и для этого типа EB. В этой phase I клинического испытания аутологические кератиноциты были успешно трансдуцированы полной длины COL7A1 cDNA и затем трансплантированы в раны. Трансплантированные слои ген-откорректированного эпидермиса приживлялись и улучшали заживление ран у леченных пациентов. Однако, продолжительность жизни трансплантата была ограниченной, что подтверждалось постоянным появлением EB кожи, она может быть достигнута только после трансплантации соотв. количеств генетически исправленных стволовых клеток кератиноцитов, а соотв. обработка раневого ложа удаляла присутствующие там неоткорректированные стволовые клетки [14], [17], [99].
Отсутствие иммунной реакции на вновь синтезируемый белок во всех трех исследованиях подтвердило, что ex vivo замещение генов в коже является надежным терапевтическим подходом для восстановления уровней белка дикого типа у пациентов, лишенных предсуществующей иммунной реактивности и экспрессирующих остаточный белок полной длины. Ни у одного из леченных EB пациентов не отмечено образование опухолей из-за использования LTR-происходящих MLV ретровирусных векторов в течение последующих 1 [14], [15], [17], [52] и 7 лет [14], [15], [17], [52].
4.2. Gene editing therapies
Альтернативой к замене полной длины cDNA, генетические модификации могут быть осуществлены на геномном уровне, используя инструменты редактирования гена в аутологических клетках кожи [71]. Моногенные заболевания, такие как EB являются подходящими мишенями для терапевтический стратегий, имеющих целью воздействовать на генетическую причину таких тяжелых нарушений. Используя сконструированные нуклеазы для редактирования в генах может быть осуществлена репарация болезнь вызывающих мутаций без необходимости стабильной геномной интеграции трансгена и может быть избегнут риск, связанный с вирусными векторами. Сегодня созданы нуклеазы, такие как zinc finger nucleases (ZFN), clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) (Fig. 4A), или transcription activator-like effector nuclease (TALEN) (Fig. 4B), используемые как инструменты для точного геномного редактирования, делающего возможным специфический нокаут гена или замещение с восстановлением функции при разных генетических заболеваниях [100].
 Fig. 4. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated DNA repair via NHEJ and HDR.
(A) CRISPR/Cas9-mediated DNA editing depends on the presence of a protospacer adjacent motif (PAM) sequence localized 2-6 nucleotides next to the cleavage site. gRNA binding to the target site leads to the activation of the Cas9 nuclease and subsequently to DNA double strand breaks (DSBs) at the desired locus. (B) The dimerization of two TALEN monomers over a defined spacer region leads to the induction of overhanging DSBs at the selected targeting region. (C) The error-prone NHEJ mechanism results in indels (insertions/deletions) at the target site, whereas (D) HDR enables the introduction or exchange of DNA in the presence of a donor template.
Возможность отбирать целенаправленно стволовые клетки кератиноцитов до их экспансии по слоям кожи и затем трансплантировать их в рану пациенту увеличивает профиль безопасности этого подхода значительно [15], [101], [102].
Редактирование генов в целом происходит посредством целенаправленного внесения двух-нитевых разрывов в избранном генетическом локусе, что приводит к активации несколких механизмов репарации (Fig. 4 C + D). Аппарат репарации клеток рекрутируется вблизи разрывов посредством non-homologous end-joining(NHEJ) или homology-directed repair (HDR), когда предоставляется донорская матрица [71]. NHEJ является склонным к ошибкам способу внесения инсерций и делеций (indels) в локус мишень, это является пригодным механизмом для выключения интересующего гена [103], [104]. Это вносит сдвиг рамки считывания, что может резко нарушать генетический код гена и будет приводить или к инактивации причинного аллеля для доминантно-негативного фенотипа болезни, или будет восстанавливать рамку считывания мутантного гена [68], [104]. Оба механизма могут приводить к коррекции экспрессии белка, хотя аминокислотные последовательности могут быть критически изменены. Однако, случайно генерируемые продукты out-of-frame, как полагают, будут деградироваться с помощью nonsense-обеспечиваемого пути распада мРНК, избегая внесения de novo доминантно-негативных продуктов [103]. Для точного геномного редактирования, HDR более предпочтительна, поскольку гомологичная матрица ДНК используется во время процесса репарации, делая возможной замену специфической последовательности или внося крупные участки ДНК [105].
4.2.1. TALEN-mediated induction of repair pathways
The main advantage of the TALEN technology over the newest gene editing tool CRISPR/Cas9 is the possibility to target any sequence of interest with the exclusive requirement of a thymine at the beginning of the binding site [104], [106]. In first proof of principle studies for COL7A1 editing in DEB cells, the TALEN technology was applied to correct a premature termination codon (PTC) mutation via HDR. Thus corrected primary fibroblasts were then reprogrammed into inducible pluripotent stem cells (iPSC) and expanded to a teratoma-based skin model [105]. The group showed the accurate expression and deposition of type VII collagen in this skin model providing evidence for TALEN-mediated in situ repair of a mutation causing RDEB. Further, Chamorro et al. recently applied both current repair mechanisms, NHEJ and HDR, for TALEN-induced COL7A1repair [68]. The target mutation c.6527insC, resulting in a PTC, is present in 46% of alleles in Spanish patients suffering from RDEB [107]. The group combined AAV and adenoviral delivery approaches to introduce a donor template DNA for HDR and the TALENs into the patient's cells, respectively. As a result, selected single cell clones showed the expression of collagen type VII at physiological levels. The exclusive treatment of RDEB patient cells with the TALENs led to indel generation in the vicinity of the target mutation within COL7A1 viaNHEJ thereby restoring the reading frame of COL7A1 in selected single cell clones. The accurate incorporation of collagen type VII into the dermal-epidermal junction (DEJ) upon both repair mechanisms was finally confirmed via immunofluorescence staining of skin grafts expanded from repaired patient keratinocytes.
4.2.2. CRISPR/Cas9-mediated induction of repair pathways
В сравнении с конструкцией TALEN пар генерация функциональных CRISPR/Cas9 молекул менее сложная и меньше требует времени, хотя целенаправленное действие на имеющийся обязательный protospacer adjacent motif (PAM) нуждается в Cas9 для распознавания [108]. Guide RNAs (gRNAs) для Cas9 доставки к соотв. локусу мишени легко создать и клонировать благодаря тому факту, что Cas9 нуклеаза и gRNA не продолжительно сцеплены с множественными последовательностями мишенями и могут быть одновременно модифицированы gemtv добавления разных gRNAs.
При DEB система CRISPR/Cas9 была впервые использована для инактивации доминантного аллеля COL7A1 посредством NHEJ [109]. Это вызывало нарушения рамки считывания в аллеле мишени, что в общем-то приемлемо, легко используемая возможность для превращения ассоциированного с болезнью фенотипа доминантно-негативных нарушений. Shinkuma et al. использовали CRISPR/Cas9 нуклеазу, чтобы модифицировать COL7A1 в induced pluripotent stem cells (iPSC), происходящих из фибробластов DEB пациентов. В результате кератиноциты и фибробласты, дифференцирующиеся из репарированных iPSC, продуцировали типа VII коллаген, посредством устранения мутаций рамки считывания, приводя к деградации возникающего белка. Хотя ген-отредактированный укороченный типа VII коллаген был неспособен инкорпорироваться в тройную спираль [109]. Сходным образом, Webber et al. генерировали iPSC из первичных фибробластов, которые были отредактированы до дифференцировки. Дифференцированные ген-репарированые кератиноциты обнаруживали нормальную эпителиальную морфологию и экспрессировали специфические для кератиноцитов гены [110]. Кроме того, наша группа успешно продемонстрировала HDR-обеспечиваемую коррекцию мутаций рамки считывания COL7A1 в экзоне 80 [107], это приводило к фенотипической реверсии у пре-клинических модельных мышей [111].
Действительно низкая эффективность HDR и потенциальный риск эффектов вне мишени препятствует возможному клиническому использованию сконструированных нуклеаз. Хотя, Wu et al. показали успешную CRISPR/Cas9-обеспечиваемую эксцизию мутантного Col7a1 экзона in vivo[112], ex vivo , фракционно обходя препятствия низкой эффективности HDR путем селекции откорректированных клонов из одиночной клетки пациента, дающей преимущества. В частности, CRISPR/Cas9 технология ассоциирует с термином действия вне мишени, т.к. множественные несовпадения допустимы между gRNA и мишенью ДНК, поскольку возникают двух-нитевые разрывы(DSB) [113], [114]. Теперь внимание сосредоточено на улучшении специфичности нуклеазы, которая может быть сохранена посредством использования мутантной версии исходно идентифицированного Cas9 белка [115] или на использовании таких мутантов с двойной nicking constellation [116]. Наша группа использовала double nicking CRISPR/Cas9 стратегию для специфической коррекции мутации KRT14 горячей точки [117] внутри экзона 6, что сопровождалось улучшением профиля надежности относительно активности вне мишени по сравнению с нуклеазой дикого типа [118]. Выбор соотв. техники редактирования гена предопределяется специфической генетической констелляцией. Сюда входит целенаправленное воздействие на сайт внутри гена, тип наследования мутации или способность целенаправленно воздействовать на специфическую мутацию [71]. Однако, обе техники редактирования предпочтительны в специфических ситуациях и являются многообещающими инструментами для лечения болезни пузырчатки кожи.
4.3. RNA therapies
Терапевтические подходы, использующие или целенаправленно воздействующие на РНК, представляют элегантные опции для восстановления функции белка при EB. Помехи во время естественно происходящего пост-транскрипционного процесса сплайсинга РНК представляют собой подходящую ступень для манипуляций с последовательностями мРНК до трансляции белка и тем самым корректировать генетические мутации на уровне РНК [119]. Многообещающие базирующиеся на РНК подходы фокусируются на терапии путем модуляции сплайсинга, которая включает antisenseoligonucleotide (AON)-обусловленный пропуск экзона и spliceosome-mediated RNA trans-splicing (SMaRT).
Пропуск экзонов обеспечивается специфическими AONs, которые соединяются с экзоном, содержащим вызывающую болезнь мутацию, по время механизма сплайсинга pre-mRNA, который поэтому пропускается с мРНК, подвергшейся целенаправленному воздействию (Fig. 5A) [120]. Зависящая от пропуска экзонов более короткая мРНК транслируется в полностью функциональный белок, как было продемонстрировано с пропуском экзона 80 в Col7a1 у модельных мышей, лишенных каких-либо фенотипических характеристик, связанных с RDEB [112]. В зависимости от терапевтической опции для DEB, некоторые AONs уже были протестированы in vivo на xenograft моделях, давая в результате повышенную и функциональную экспрессию type VII коллагена в зоне базальной мембраны после пропуска экзона 70 [121], 73, 80 [77] и экзона 105 [78]. Хотя пропуск экзона обнаруживает высокий потенциал в качестве функциональной терапии для рецессивных форм EB, только отобранные in-frame экзоны, могут быть пропущены, это ограничивает число пациентов, которые могут лечиться. Далее каждый AON требует оценки для каждого экзона мишени, это требует затраты времени и затратного процесса продукции относительно разработки лекарства [119].
 Fig. 5. Splice-modulating therapies.
(A) Using AON-mediated exon skipping, selected mutated exons can be removed during the RNA splicing mechanism. Specifically designed AONs bind the splice site of the mutated exons, which leads to skipping of the mutated exon, resulting in a shortened but fully functional mRNA. (B) Using RNA trans-splicing mutated exons can be replaced by their wild-type copy during the RNA splicing mechanism. An RTM consists of a binding domain hybridizing to the pre-mRNA and a wild-type cDNA portion, which is exchanged during RNA trans-splicing, and can be specifically designed in order to replace mutated exons located 3', internal or 5' of the targeted mRNA.
SMaRT использует аппарат сплайсинга в клетке, чтобы заместить мутантные регионы, вызывающие болезнь, внутри подвергшейся воздействию пре-мРНК, на версию дикого типа. В зависимости от организации RNA trans-splicing molecule (RTM), крупные участки, расположенные на 5', внутри или 3' болезненного транскрипта могут быть заменены, это делает возможным лечение широкого круга пациентов только одной изготовленной молекулой (Fig. 5B) [16], [122], [123]. Транс-сплайсинг РНК может быть использован для доминантно и рецессивно наследуемых форм EB, и они были разработаны в пре-клинических исследованиях для PLEC[124], KRT14[22] и COL7A1[16]. Ex vivo xenograft мышиные модели недавно продемонстрировали потенциал такой технологии по восстановлению функции гена на уровне мРНК при DEB [124]. Далее, SMaRT открывает потенциал для прямого in vivo использования, как это продемонстрировано на примере транс-сплайсингом-обеспечиваемой коррекцией in situ Col7a1 у мышей [72]. Хотя недавнее исследование подчеркнуло прогресс SMaRT, потенциальные события вне мишени были оценены точно перед введением SMaRT в клинику [118].
Помимо сплайс-модулирующей терапии, считывание premature termination codon (PTC) представляет собой альтернативную возможность корректировать мутации на уровне РНК, т.к. ~ 30% DEB вызывающих мутаций превращают аминокислоты в PTC [126], [127], [128]. Малые молекулы, подобные aminoglycosides, вызывают считывание PTC, благодаря соединению с рибосомальной РНК, приводя к структурным альтерациям и внося альтернативную аимнокислоту во время трансляции [129]. В DEB кожных эквивалентах, de novo синтез type VII коллагена был выявлен после лечения aminoglycoside [130], подчеркивая тем самым потенциал считывания PTC для EB. Кроме того, одобренное FDA лекарство amlexanox было успешно протестировано в отношении индукции считывания PTC в клеточных линиях RDEB пациентов [131]. Возникающий в результате белок обнаруживался в среде после культивирования клеток и аккуратно экспрессировался внутри соединений между дермой и эпидермисом в органотипической культуре кожи. Недавно, gentamicin, принадлежащий к группе aminoglycosides, был применен локально и внутри-кожно у 5 RDEB пациентов с нонсенас и мутациями, приводя к de novo экспрессии type VII коллагена и закреплению формирующихся фибрилл в месте воздействия [132].
Однако, aminoglycosides сопровождаются токсическими побочными явлениями. Наименее токсичны соединения со способностью считывания PTC, такие как Ataluren [133], были использованы для клинических испытаний мышечной дистрофии Дюшена [134]. Кроме того, инкорпорация др. отличных от натуральных аминокислот могут приводить к потере или избыточной функции белка [135].
Др. терапевтическим подходом, пригодным исключительно для доминантно наследуемых форм EB, стало использование малых интерферирующих РНК (siRNAs), которые могут отличать дикого типа и мутантные аллели и тем самым специфически целенаправленно воздействовать и вызывать нокдаун мутантного аллеля. SiRNA-индуцированный генный нокдаун, как было установлено, для KRT5-зависимого EBS [136] и COL7A1-зависимого DDEB [137], вызывает сильное снижение мутантного белка после in vitro воздействия siRNA [138]. Т.к. обусловленный siRNA нокдаун аллеля является специфичным для мутации, то этот подход нуждается в разработке молекул, специфичных для пациента. Чтобы лечить большое количество пациентов, страдающих от доминантно наследуемых форм EB, одной и той же молекулой, исследуется возможность подходов независимых от мутаций нокдауна доминантных аллелей [138].
4.4. Natural gene therapy
Естественная генотерапия в коже описывает появление участков, в которых клетки кожи превращаются в клетки дикого типа посредством спонтанной коррекции патогенетических мутаций. Этот феномен назван реверсионный мозаицизм, он был описан для разных наследственных болезней, включая epidermolysis bullosa [139]. Ревертантный мозаицизм был идентифицирован при EB в последнюю декаду в качестве довольно распространенного события, особенно у JEB пациентов, хотя точный механизм такой частичной или полной реверсии клеток патогенной кожи пока неясен [140], [141]. Однако, эти находки возрождают надежду на использование этого источника естественно откорректированных аутологичных клеток кожи для разработки безопасной ex vivo клеточной терапии, при этом использование вирусных векторов для коррекции генов будет обойдено. Было предпринято несколько попыток использовать такие участки реверсионной кожи у пациентов с EB для трансплантации их в области дефектной кожи или путем выделения revertant кератиноцитов или путем экспансии эпидермальных слоёв для трансплантации [142], или посредством прямой punch трансплантации revertant кожи [143]. Первое клиническое использование натуральной ex vivo генотерапии было осуществлено у пациентов с COL17A1-зависимым JEB. Аутологичные эпидермальные слои, содержащие около 30% revertant кератиноцитов, были трансплантированы пациентам в места больной кожи. Однако, эта проверка принципа revertant терапии для EB оказалась безрезультата в отношении функциональной репарации обработанной кожи из-за недостаточного количества (~ 3%) стволовых клеток, присутствующих в трансплантатах [142].
Др. исследование с использованием punch биопсий аутологической revertant кожи в кожу язв у JEB пациентов привела к улучшению обработанной области посредством полной ре-эпителизации [143]. Однако, эта процедура оказалась ограниченной лечением только областей небольших ран из-за ограниченного количества revertant участков кожи у EB пациентов. Т.о., чтобы разработать эффективную клеточную терапию с использованием естественно ревертировавших аутологичных клеток, необходима дальнейшая оптимизация выделения и поддержания revertant стволовых клеток кератиноцитов в трансплантатах.
Недавно разработанное перепрограммирование клеток кожи человека в iPSC породило надежду на становление подходов естественной генотерапии EB. Было показано, что генерация iPSC из revertant кератиноцитов пациентов с COL17A1-зависимым JEB с последующий дифференцировкой в естественно генетически откорректированые кератиноциты возможна. Umegaki-Arao et al. продемонстрировали, что дифференцированные revertant кераттиноциты способны восстанавливать нормальную кожу человека у мышей после трансплантации [144]. Несмотря на эти многообещающие результаты перенос в клинику естественным образом откорректированных аутологичных iPSC нуждается в дальнейшем исследовании по улучшению безопасности и эффективности этого подхода.
|