Посещений:
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ



и Изменение экспрессии генов

Using CRISPR and other tools, scientists are modifying DNA methylation, histone marks, and other modifiers of gene expression to understand how they affect health and disease.
ASHLEY YEAGER
The Scientist 2019

Juan Carlos Izpisua Belmonte's из Лаборатории в Институте Солка в Ла-Холье, штат Калифорния, улучшали здоровье мышей-мутантов, страдающих от заболеваний почек, мышечной дистрофией или диабетом, после того, как ученые настроили гены, связанные с недугами. Бельмонте и его коллеги, однако, не редактировали сами гены. Вместо этого они нацелились на эпигеном, чтобы модифицировать химические и белковые метки, которые находятся на хроматине, и влияют на экспрессию генов.
Ученые разработали молекулярные инструменты для редактирования этих эпигенетических меток, ученые установили, как влияют на некодирующие регионы генома и контролируют экспрессию генов. Лучшее понимание того, как функционирует эпигеном д. привести к новой, безопасной терапии болезней от рака для повышенного уровня холестерола. "Есть много действительно классных вещей, которые вы можете сделать с редактированием эпигенома, которое действительно отличается от редактирования генома," говорит Charles Gersbach.
Несмотря на революционные успехи редактирования генома, у него есть некоторые недостатки. С одной стороны, это изменяет основную последовательность ДНК клетки, потенциально создавая неожиданные эффекты, которые могут вызвать рак или другие заболевания. Эпигенетическое редактирование не изменяет последовательность ДНК, что может сделать его более безопасным в качестве терапии, говорит Gersbach. Кроме того, редактирование генома опирается на пути репарации ДНК, которые вводят новые основания в генетический код непредсказуемым образом. Редактирование эпигенома не разрезает ДНК и не требует сшивания оснований для восстановления ДНК, что делает использование инструментов для разных типов клеток более подходящим, говорит Gersbach.
Искусственные эпигеномные редакторы, однако, имеют свои проблемы. С одной стороны, биохимическое разнообразие эпигенетических меток - гистоновых белков - приводит к добавлению метильных, ацетильных и других функциональных групп к их хвостам, метильные группы на самой ДНК принимают по меньшей мере шесть различных форм, и каждый год обнаруживается больше типов меток. Сложнее становится спроектировать правильный редактор, нацеленный на каждую из меток по отдельности, не вызывая нежелательных эффектов. Точный таргетинг эпигенетических меток в определенных точках генома все еще затруднен, потому что молекулярные механизмы, лежащие в основе эпигенетической регуляции, не совсем понятны.

Epigenetic Off Switch


Исследователь: Angelo Lombardo, geneticist, San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy
Проект: Замалчивание экспрессии генов в поколениях
Проблема: В течение 20 лет исследователи использовали интерферирующие РНК (RNA interference), что лишает мРНК дееспособности после транскрипции, или ZFNs и TALENs, искусственные нуклеазы, нарушающие последовательность ДНК за счет целенаправленных двойных разрывов, чтобы подавить или выключить экспрессию определенного гена. Но эти методы обеспечивают лишь частичное подавление гена мишени или не находят цель вообще. Иногда они воздействуют не на тот ген вообще.
Решение: Клетки эукариот естественным образом используют эпигенетику, чтобы репрессировать экспрессию генов. Одним из хорошо изученных механизмов такого процесса является выключение т. наз. эндогенных ретровирусов (кусочки генома, произошедшие от родоначальных ретровирусных инфекций) в стволовых клетках эмбриона до его имплантации в матку. Чтобы избавиться от остатков вирусных элементов клетки используют два специализированных семейства белков, Krüppel-associated box containing zinc-finger proteins (KRAB-ZFP) и de novo DNA methyltransferases (DNMT). Первый соединяется с вирусной последовательностью и удаляет метильные и ацетильные группы с гистоновых меток. Последний добавляет метильные группы, закрывающие на замок репрессию гена для будущих клеточных поколений.
Lombardo и его коллеги исследовали этот механизм, переориентируя по одному из белков каждого из двух семейств (они использовали KRAB-ZFP/KAP1 и DNMT3A), чтобы выключать гены в дифференцированных клетках человека, таких как Т клетки скорее, чем в стволовых клетках. Исследователи сдваивали два белка с последовательностями, которые наводили их на чудесным образом на эпигенетические метки в трех специфических генах, эффективно выключая гены (Cell, 167:219-32.E14, 2016). Поскольку каждый из белков целенаправленно воздействует на слегка отличающиеся эпигенетические метки, то два белка редактировали эпигеном разными способами. Один быстро, мощно и обратимо репрессировал экспрессию гена и эффект мог быть стерт после нескольких раундов клеточных делений. Др. белок также выключал три гена и подавление длилось значительно дольше и устранялось спустя несколько сот клеточных поколений. Тот факт, что эти репрессивные метки были стабильны спустя год после многочисленных клеточных делений, действительно впечатляет.

IDENTITY SWITCH: Using CRISPR-Cas9-modified epigenetic marks, researchers upregulated specific genes to convert fibroblasts into neurons.



Disease Discovery


Исследователь: Charles Gersbach, biomedical engineer, Duke University
Проект: Картирование раковой не-кодирующей ДНК с помощью модифицированного инструмента редактирования гена.
Проблема: Миллионы регионов генома человека не кодируют белки. Некоторые из этих не-кодирующих регионов несут варианты последовательностей, ассоциированные с лейкемией, раком груди и др. сложными заболеваниями, но остается неясным, как эти сегменты генома регулируют экспрессию генов. Исследователи использовали редактирование генома CRISPR-Cas9 чтобы натолкнуть его на определенные гены и регуляторные элементы, чтобы исследовать их эффекты на здоровье, но эта техника не пригодна для всех вариантов генов и неправильно модифицирует регуляторные элементы, которые их контролируют. Более того, отмечает Gersbach, техника может только выключать гены, вставляя или делетируя ДНК генетического кода.
Решение: Gersbach с колл. разработали редактор эпигенома, базирующийся на CRISPR-Cas9, в котором Cas9, изменена мутациями так, что не может разрезать ДНК, она сливается с сегментами белка, которые модифицируют эпигеном. Такие белковые сегменты оказываются на регионах не-кодирующей ДНК, которые действуют как промоторы или энхансеры и доставляют эпигенетические элементы, которые или индуцируют или репрессируют транскрипцию ДНК.
Исследователи использовали редактор человеческих клеток, чтобы блокировать некодирующие регионы, которые способствуют транскрипции генов в локусе β-globin, который участвует в возникновении лейкемии, и в локусе HER2, который играет роль в возникновении рака груди. Результаты экспериментов показали, что раковые клетки и клетки эмбриональных почек обнаруживают уже известные регуляторные регионы, контролирующие экспрессию генов в этих локусах. Целенаправленное же воздействие на регуляторные элементы генов регуляторов с помощью guide RNAs и затем сравнение их концентрации в разных местах генома клеток, экспрессирующих высокие и низкие количества HER2, также выявили ранее неизвестные некодирующие регионы, которые регулируют экспрессию HER2. Используя редактор, чтобы включать некодируемые регионы, привело к очень неожиданному результату: активность в некодирующих регионах специфична для определенного типа клеток, таких как раковые клетки или клетки от специфических органов - и, следовательно, для специфических болезней (Nat Biotechnol, 35:561-68, 2017). "Мы по существу используем эпигеномное редактирование для обнаружения и картирования не-кодирующего генома," заявляет Gersbach.

Edits for Treatment


Исследователь: Juan Carlos Izpisua Belmonte, cell biologist, Salk Institute for Biological Studies
Проект: Целенаправленная экспрессия генов для лечения болезней
Проблема: Попытки модифицировать систему CRISPR-Cas9, чтобы целенаправлено воздействовать на специфические метки метилирования и гистоновые модификации, не разрезая ДНК оказались довольно успешными в клеточных культурах, но перенос этих исследований на живые организмы оказался проблематичным. Это частично происходит из-за того, что CRISPR-Cas9 система может оказываться лишком крупной, чтобы проникать внутрь ядра и редактировать там эпигенетические метки.
Решение: Belmonte и его команда стараются создать более мелки эпигенетический редактор. Они привержены радикальной идее: Почему бы не разделить редактор надвое? Одна часть, переносимая adeno-associated вирусом, д. содержать энзим Cas9, а др. переносить с помощью второго adeno-associated вируса guide RNAs и переключатель гена (gene switches). Две части д. работать вместе, чтобы обеспечить активацию или подавление экспрессии.
Исследователи использовали инструмент, чтобы активировать три гена - Klotho, чтобы лечить болезни почек, Utrophin для мышечной дистрофии, и Pdx1, который продуцирует insulin, для диабета - у живых мышей (Cell, 171:1495-1507.E15, 2017). Активация этих генов компенсирует генетические мутации, ассоциированные с болезнями, улучшая симптомы у мышей, моделирующих эти болезни. Исследователи также использовали инструмент для избыточной экспрессии определенных длинных не-кодирующих РНК и генов, богатых гуанином и цитозином, которые обладают манящей последовательностью, указывающей на их биологическую функцию. "Наша работа представляет собой проверку принципа, что возможно лечить болезни, используя эпигенетический подход," сказал Belmonte.

Controlling Cholesterol


Исследователь: Charles Gersbach, biomedical engineer, Duke University
Проект: Блокирование экспрессии гена, чтобы понизить холестерол
Мыши, получающие терапию, блокирующую экспрессию гена имеют низкий уровень LDL холестерола по сравнению с мышами, получающими плацебо.
Проблема: Ген PCSK9 , кодирующий белок, регулирующий и который иногда может мешать удалению, LDL (плохого) холестерина крови. Лекарственные антитела, подавляющие этот белок, чтобы поддержать удаление LDL уже были разрешены для лечения семейной hypercholesterolemia, генетического заболевания, при котором PCSK9 белок неспособен удалять LDL из крови. Др. терапевтические подходы разрабатываются с целью ингибировать ген с использованием синтетических олигонуклеотидов или редактирования генов. Очень большое количество работ было проделано с PCSK9 и его связью с холестролом, но ученые знают очень мало о его экспрессии. Эта основа помогает созданию эпигеномного редактора, который модулирует ген, говорит Gersbach. Используя стандартный инструмент, базирующийся на CRISPR-Cas9 система, Gersbach с колл. оказались способными выключать Pcsk9 путем целенаправленного воздействия на специфические эпигенетические метки в культивируемых клетках. Но как и в случае с командой Belmonte's создание инструмента, работающего на животных моделях оказалось трудным.
Решение: Используя CRISPR-Cas9 систему, исследователи обычно используют бактериальную иммунную систему от Streptococcus pyogenes. Но инструмент эпигенетического редактирования не всегда согласуется со стандартной системой adeno-associated вируса. Поэтому исследователи использовали Cas9 систему от Staphylococcus aureus; программу генного редактирования, кодируемую коллекцией генов на kilobase меньше, чем у S. pyogenes, и это соответствует более пригодной системе доставки вместе с guide RNAs и др. молекулами для модификации экспрессии гена.
как и команда Belmonte's, Gersbach со своими колл. создали две системы доставки для транспорта эпигеномного редактора в правильный регион генома в клетках живых мышей. Одна система доставляет не разрезающую ДНК версию Cas9 от S. aureus и сегменты белка, редактирующие эпигенетические метки, а др. содержит guide RNAs, которая нацелена на ген Pcsk9. Когда исследователи инъецировали двойную систему взрослым мышам и тестировали их клетки печени, то мыши обнаруживали более низкие уровни LDL холестерина, чем животные, получавшие плацебо (Nat Commun, 9:1674, 2018). Потенциальное преимущество этого метода по сравнению с олигонуклеотидами или редактированием генов, сказал Gersbach says, заключается в том. что он не использует такую ступень - как разрезание ДНК или внесение чужеродных пептидов - что может минимизировать эффективность или приводить к нежелательным иммунным реакциям.