Одновременная экспрессия многих гетерологичных генов с одного вектора, переносящего гены является важной необходимостью для протокола генотерапии. Существует 4 широко распространенных стратегии, с помощью которых два или более генов могут совместно экспрессироваться с одного вектора. Во-первых, два гена могут быть слиты вместе in frame, чтобы продуцировать химерную последовательность, обеспечивающую одновременную экспрессию обоих генов в виде слитого белка [[1], [2], [3]]. Однако, эта стратегия может не работать для всех слитых белков, т.к. некоторые при этом принимают неправильную конфигурацию или направляются на др. мишени и слитые белки могут стать иммуногенными для хозяина. Во-вторых, могут быть использованы отдельные промоторы для управления экспрессией разных генов в одном и том же векторе. Большим неудобством такой конструкции вектора с двумя промоторами может стать транскрипционная интерференция и/или диссоциация экспрессии генов, при этом фракция трансфицированных или трансдуцированных клеток будет экспрессировать только один ген, который выбран в качестве селективного маркера, а не интересующий ген и vice versa [[4], [5], [6]]. Третья стратегия базируется на использовании естественных сигналов сплайсинга вирусов, с помощью которых многие РНК продуцируются с одиночного транскрипта [7]. Однако, эта стратегия используется не часто из-за субоптимального сплайсинга вирусного вектора. Для преодоления, описанных выше препятствий используется 4-я стратегия, связанная с конструкцией кассеты из двух цистронов, в которой два гетерологичных гена разделены элементом, известным как последовательность internal ribosome entry site (IRES). Транскрипция обоих генов в bicistronic кассете оправляется общим вышестоящим промотором, тем самым устраняется интерференция промоторов. Инициация трансляции с первого Cistron 5' c IRES обычно обеспечивается с помощью cap-зависимой инициации трансляции [8], однако, трансляция Cistron 3' с IRES осуществляется независимо от capping с использованием IRES элемента в качестве внутреннего рибосомы-связывающего сайта, чтобы инициировать трансляцию.

Т.к. первый и второй гены в кассете из двух цистронов находятся под контролем 5' вышестоящего промотора, детекция белка, кодируемого вторым Cistron теоретически обеспечивается в результате успешной экспрессии первого Cistron. Однако, многие исследователи, использующие IRES элементы для конструирования векторов, переносящих bicistronic ген, описывают затруднения в достижении существенной экспрессии со второго Cistron. Проведенные исследования для определения параметров, которые влияют IRES-зависимую инициацию трансляции в bicistronic конструкции, показали, что длина и вторичная структура некодирующей inter-Cistronic sequences (ICS), отделяющей 3' конец IRES элемента от нижестоящего Cistron оказывает строгое влияние на эффективность функционирования IRES [[9], [10], [11]]. Однако, мало известно об идеальной длине некодирующей ICS, отделяющей 5' конец IRES элемента от вышестоящего Cistron и обеспечивающей оптимальную экспрессию 5' и 3' генов.

В данном исследовании мы сконструировали 9 векторов экспрессии, содержащих bicistronic кассеты под контролем CMV промотора. Эти бицистронные кассеты содержали последовательно делетированные некодирующие ICS последовательности, между стоп кодоном human low-density lipoprotein cDNA (hLDLR cDNA) и IRES-eGFP кассетными последовательностями. Заме мы исследовали эффективность этих векторов с целью скрининга и селекции оптимальной 5'-hLDLR-IRES-eGFP-3' кассеты, которая могла бы использоваться для преклинической генотерапии familial hypercholesterolemia.

IRES упаравляет рекрутированием комплекса инициации без необходимости в 5-cap [12]. В целом присутствeт на 5-UTR. IRES-зависимая инициация может возникнуть в результате прямого соединения 40S субъединици с мРНК или может быть обеспечена субнабором канонических факторов инициации, а в некоторых случаях необходимостью в специфических клеточных белках, наз. IRES trans-acting factors (ITAFs) [13]. Более того, анализ in silico предполагаемых структур РНК, сравнительный анализ последовательностей и минимизации структуры равновесия термодинамической свободной энергии были использованы для наших IRES поисковых систем.

Чтобы лучше понять структуры и функции IRES РНК, мы использовали comparative sequence analysis (CSA) , чтобы проанализировать и идентифицировать covering пары оснований. [14]. Наше исследование привело к пересмотру вторичной структуры IRES РНК, которая была подтверждена covering base pairs и доступными биохимическими данными. Модель была использована для изучения IRES РНК в трех измерениях в свободной форме, а также связанных с белками IRES и с 40s рибосомной субъединицей.

Мы исследовали размер межцистронной спейсерной последовательности в 5' регионе internal ribosome entry site sequence, используя последовательные делеции и продемонстрировали, что экспрессия 3' гена может быть значительно улучшена до уровней, сходных с таковыми при cap-зависимой экспрессии 5' гена. Максимум эффективности экспрессии нижестоящего гена был достигунут, когда спейсер состоял из 18-141 пар оснований. В этом случае .slf обнаружена одиночная мРНК транскрипционная единица, содержащая первый и второй Cistron. В то время как конструкции со спейсерными последовательностями в 216 пн или длиннее давали одиночную транскрипционную единицу, содержащую только первый Cistron. Это указывает на то, что длинные спейсеры могут затрагивать терминацию транскрипции. Когда спейсер был в 188 bp, то продуцировались оба транскрипта одновременно в большинстве трансфицированных клеток, тогда как часть из них экспрессировала только первый, но не второй ген. Анализ экспрессии векторов, содержащих оптимизированные кассеты, четко подтвердил, что эффективность переноса генов и биологическая активность экспрессируемых трансгенных белков в трансдуцированных клетках может быть достигнута. Более того, компьютерный анализ, проведенный с помощью molecular dynamics (MD) моделирования, чтобы определить большинство всплывающих в качестве жизнеспособных, содержащих специфические сайты связывания и соединяющие 5' и 3' концы, используя прямы РНК-РНК контакты и РНК-белковые взаимодействия. Эти результаты составляют механическую основу для стимуляции трансляции и RNA resembling for the synergistic stimulation of cap-dependent translation.