Альтернативой GGT по предупреждению передачи второму поколению мутаций зародышевой линии, является пренатальная диагностика ранних плодных тканей посредством взятия амниотической жидкости или ворсинок хориона¹¹ в первом триместре беременности. Если патогенетическая генетическая мутация обнаруживается в ткани биоптата, то родители сталкиваются с трудным выбором прервать беременность или дать родиться больному ребенку.

Table 1 Examples of monogenic heritable diseases amenable to GGT

Др. подход - это преимплантационная генетическая диагностика (PGD), сопровождаемая отбором тех, что не несут мутаций. PGD становится возможной, если доступ к гаметам и эмбрионам на предимплантационной стадии возможен после разработки in vitro fertilization (IVF), сопровождаемого переносом эмбриона и впервые описанном как способ выбора пола ребенка в 1990 (ref. 12). Технология теперь базируется на биопсии нескольких клеток трофэктодермы от эмбриона на стадии бластоциста. Эмбрион после биопсии может быть заморожен для хранения, это делает возможным PGD анализ и решение относительно судьбы эмбриона перед переносом эмбриона (Fig. 1).

Fig. 1: Embryo selection following PGD for families in which one parent carries an autosomal dominant mutation.

On the basis of a Mendelian distribution, half of the resulting embryos would inherit a single copy of the mutation and would be discarded. The remaining non-mutant embryos would be available for transfer, given that there are no other chromosomal abnormalities.

Обычно целенаправленное секвенирование мутантного локуса используется для определения эмбрионов, несущих генетичекое нарушение и часто приобретающих хромосомные аномалии, были идентифицированы с помощью array comparative genomic hybridization (aCGH) или fluorescence in situ hybridization (FISH) подходов. С получением доступа к секвенированию целого генома и целого экзома, возможности PGD расширились, включая редкие генетические болезни, а American Society of Reproductive Medicine (ASRM) недавно расширила этические оправдывающие обстоятельства по использованию PGD у пациентов, несущих мутации, ассоциированные с возрастными заболеваниями¹³.

Когда один из родителей в паре несет гетерозиготную мутацию, то 50% эмбрионов в среднем д. быть свободным от мутации и доступно для переноса, тогда как оставшиеся эмбрионы носители не годятся (Fig. 1). Однако, в соответствии с данными, собранными Society for Assisted Reproductive Technology (SART), в 2016 доля живорожденных вследствие одного цикла IVF, когда все эмбрионы не были мутантными, находится в пределах от 3.3% до 47.6%, в зависимости от возраста женщины, проходящей через эту процедуру¹⁴. Это объясняется плохим развитием эмбрионов, спонтанной анеуплоидией и низкой величиной имплантации эмбрионов человека, получаемых при IVF.

Если один из родителей гетерозиготен по мутации, то успешность IVF будет, скорее всего, значительно ниже, т.к. значительное количество эмбрионов во всем остальном хорошего качества будут нести мутации и тем самым не будут выбраны для имплантации. Согласно недавнему исследованию 358 семей с риском передачи нарушения, связанного с одним геном, подвергшихся IVF и PGD, обнаруживали величину живорожденных в 18% по сравнению с 38% пар, подвергшихся IVF при бесплодии (в отсутствие генетических болезней) за тот же самый период¹⁵. Такая низкая успешность IVF преимущественно связана с тем фактом, что 959 эмбрионов, несущих генные мутации, но в остальном способные к переносу и поэтому не были имплантированы. Т.о., пары с генетическими мутациями, подвергшиеся PGD селекции, обнаруживают достоверно более низкую долю рождений, это связано с тем, что приходится проходить через дополнительные IVF циклы, чтобы получить здорового ребенка, что связано с затратным и инвазивным процессом.

Если, как полагают многие, жизнь начинается с зачатия, то преднамеренное уничтожение или оставление эмбриона-мутанта, связанно с этическими проблемами и часто неприемлемое решение для многих родителей. В США не существует федеральных ограничений на использование PGD, и хотя такие решения оставлены на усмотрение штатов, ни один из них не внедрил закон в отношении PGD. American Society for Reproductive Medicine опубликовал лишь ограниченные рекомендации относительно использования PGD.

В отличие от этих подходов, основанных на селекции, генная репарация в гаметах или предимплантационных эмбрионах спасла бы большинство или все мутантные эмбрионы, и тем самым увеличила бы количество эмбрионов, пригодных для переноса, и избавила бы от необходимости избавляться от потенциальной жизни. Следовательно, GGT является этически более приемлемым для некоторых семей. Более того, GGT может предоставить возможность тем семьям, когда PGD невозможно, напр., когда один родитель носитель гомозиготной аутосомно доминантной мутации или оба партнера гомозготны по одной и той же аутосомно рецессивной мутации, поскольку будут затронуты все эмбрионы.

Матерински наследуемые мутации mtDNA вызывают большое количество неизлечимых заболеваний у детей и взрослых. Затронутые индивиды часто погибают в раннем возрасте в ходе агонизирующей болезни. Более того, предупреждение передачи с помощью PGD затруднено из-за неопределенности процентного содержания мутированной мтДНК в ооцитах носителях¹⁶. Митохондриальный геном устойчив к прямым альтерациям ДНК, вызываемым инструментами редактирования гена, таких как CRISPR, из-за отсутствия механизмов репарации и рекомбинации нативной mtDNA. Однако, была разработана альтернативная форма GGT, наз. mitochondrial replacement therapy (MRT), которая базируется замещении мутантной mtDNA в ооцитах, несущих мутацию, при этом приносится в жертву лишенный мутации аналог mtDNA, тем самым позволяя женщинам, несущим мутации mtDNA, избегать передачи болезни своим детям¹⁷. MRT обычно осуществляется посредством переноса веретена, который осуществляется на стадии зрелого ооцита, когда ядерный материал ДНК собирается в метафазные хромосомы, формирующие мейотическое веретено. Веретено с помощью микрохирургии изолируется в karyoplast, а затем трансплантируется в 'пустую' цитоплазму донорского неоплодотворенного ооцита, который был лишен ядра. Реконструированный ооцит теперь свободен от мутантной mtDNA, может быть оплодотворен и затем перенесен в пациента¹⁸. Сходные стратегии используют для переноса полярных телец или пронуклеусов^19,20.

MRT технология также важна для лечения бесплодия, когда это состояние является вторичным по отношению связанного с возрастом снижения качества цитоплазмы ооцита¹⁷. Старение репродуктивной системы у женщин пожилого возраста приводит к резкому снижению качества ооцитов, это впоследствии приводит к снижению вероятности забеременеть и к высокому проценту прерывания беременности или дефектам родов. Недавние результаты подтвердили, что многие факторы, отвечающие за старение ооцитов, ограничены цитоплазмой и поэтому MRT, которое по существу является замещением всей цитоплазмы, может оказаться полезным для преодоления этой формы репродуктивного старения.

Использованная первоначально на не человекообразных приматах процедура MRT привела к продукции нескольких живых детенышей, которые обнаруживали исключительно донорскую mtDNA^18,21. Мы также продемонстрировали, что постнатальный рост, развитие и репродуктивная способность таких животных являются нормальными и сравнимы с таковыми у контрольных животных после обычной IVF процедуры²². Этот подход, по-видимому, имеет важное клиническое значение, поскольку преимплантационное развитие человеческих MRT эмбрионов было сравнимым с контролем^22-24.

В то время как клинические испытания, с использованием переноса MRT эмбрионов на сегодня не разрешены в США, тогда как MRT было впервые разработано В Соединенном Королевстве и в настоящее время проводятся санкционированные правительством первые в истории исследования на людях MRT²⁵. MRT уже были проведены в Mexico, давшие в результате рождение здорового мальчика с донорской mtDNA в семье, несущей смертельную болезнь, ассоциированную с мутацией в mtDNA²⁶. Это первый успешный случай GGT на человеке, который подарил надежу на будущее этой терапии для семей с наследственными генными мутациями в mtDNA.

К сожалению, в этом случае пострадавшие семьи были вынуждены обратиться в клинику, расположенную, возможно, в менее регулируемой юрисдикции, что ставит под сомнение нормативную применимость моратория на GGT в Соединенных Штатах.²⁷. Вместо полного запрета, возможно, следует рассмотреть промежуточный подход, предусматривающий проведение клинических испытаний в отдельных академических центрах, обладающих специальными знаниями для удовлетворения законных требований безопасности и эффективности²⁷.

Замещение мутантной mtDNA во время MRT процедуры не является полным, поскольку небольшая фракция (1-4%) материнской mtDNA остается в ооците или эмбрионе. Такие низкие уровни мутантной mtDNA оказываются недостаточными, чтобы вызвать болезнь. Однако, её избирательная экспансия во время постимплантационного эмбрионального и плодного развития и быстрое обращение обратно к гомоплазматической мтДНК матери создает потенциальные проблемы безопасности²⁸.

Недавние исследования показали, что zinc-finger nucleases (ZFNs) и transcription-activator-like effector nucleases (TALENs) могут быть использованы для целенаправленного и избирательного разрушения мутантной mtDNA у мышей^29-31. Эти находки при проверке принципа подтвердили, что способные к репрограммированию нуклеазы могут обладать терапевтическими возможностями уменьшать груз мутаций mtDNA при heteroplasmic mtDNA болезнях.

В противоположность mtDNA, ядерный геном ассоциирует с мощными механизмами репарации и рекомбинации ДНК, которые исторически были использованы, чтобы экспериментально индуцировать разнообразные модификации генов. Недавние успехи ву технологиях редактирования генома сделали возможной индукцию разрывов двойной нити ДНК (DSBs) в специфических локусах клеток животных и человека с высокой эффективностью⁵. Современный прогресс был существенно облегчен разработкой ДНК-разрезающих нуклеаз с программируемыми, сайт-специфическими ДНК-связывающими доменами, включая RNA-guided CRISPR-Cas9 векторы^5,32-34.

DSBs, вместе с др. типами повреждений ДНК, возникают спонтанно как результат внешнесредовых стрессов или ошибок репликации ДНК³⁵. DSBs обычно репарируются посредством механизмов non-homologous-end-joining (NHEJ) или homology-directed repair (HDR) (Fig. 2). Возникающие картины от недавних исследований по геномному редактированию подтвердили, что NHEJ является преобладающим способом репарации в соматических клетках. Однако, этот механизм склонен к ошибкам и часто вызывает возникновение малых indel мутаций в месте DSB³⁶. В редких случаях разрезание обоих аллелей одновременно может вызывать крупные делеции или сложные перестройки генов или регуляторных последовательностей, при этом возникает возможность, что соседние гены или регуляторные последовательности могут быть затронуты³⁷. Как указывалось выше, NHEJ является главным ожидаемым результатом редактирования генов и в качестве такового является чрезвычайно неподходящим для GGT использования, т.к. вызывает дополнительные мутации внутри или в соседнем с уже существующей мутацией локусе зародышевой линии.

Fig. 2: Possible repair outcomes in embryos homozygous for a germline mutation in the MYBPC3 gene.

Both parental alleles carry the mutation and thus will be targeted by CRISPR-Cas9, resulting in DSBs on one or both alleles. Repair by NHEJ would dominate, producing additional indel mutations on one or both parental chromosomes. HDR via an endogenous ssODN template occurs less frequently, resulting in repair of the DSB and the preexisting germline mutation on one or both parental chromosomes.

Альтернативно , клетки могут устранять DSBs посредством HDR, механизм репарации, управляемый матрицей, которая использует преимущества существующих гомологичных последовательностей в матрицах синтетических одноцепочечных олигодезоксинуклеотидов (ssODN). В противовес NHEJ, HDR гарантирует относительно аккуратное восстановление DSBs по отношению к оригинальной последовательности без добавок и потерь последовательностей ДНК³⁶. Более важно то, что HDR расширяется ниже и выше локуса DSB и не только репарирует место разрыва, но и также стирает и перестраивает соседние варианты последовательностей, которые отличаются от матрицы. Т.о., HDR может репарировать ближайший предсуществующий мутантный сайт, предоставляя возможность использовать этот феномен для корреции мутаций. Однако, частота HDR, когда оба аллеля подвергаются целенаправленному воздействию (гомозиготные локусы, Fig. 2) существенно ниже и в пределах 1-5%, тогда как большинство DSBs, устраняется с помощью NHEJ (95-99%)^38,39. Эти результаты, которые приемлемы для, соматической генотерапии, недостаточны для более строгой безопасности и эффективности, предъявляемых к GGT.

Многочисленные усилия по повышению HDR и снижению возникновения NHEJ сфокусированы на склонении результатов репарации путем супрессии компонентов NHEJ в то же время усиления пути HDR и на манипуляциях с клеточным циклом³⁸. Такие вмешательства, часто базируются на химических и генетических инструментах, хотя они очень полезны в исследованиях in vitro, они могут быть нежелательными для терапевтического применения на эмбрионах человека, потому что они могут менять способность реагировать на повреждения в других участках генома. Синтетическими матрицами обусловленные частоты HDR могут быть также увеличены путем оптимизации дизайна, ориентации, полярности и длины ssODN³⁸.

Усилия в направлении GGT на эмбрионах человека сегодня сконцентрированы на использовании альтернативных эндогенных последовательностей, расположенных на гомологичных хромосомах в качестве матрицы для репарации с использованием механизма, известного как конверсия генов. Конверсия генов является однонаправленным переносом генетического материала с донорской последовательности на высоко гомологичный акцептор и это не нуждается в экзогенной матрице⁴⁰. Конверсия генов происходит во время мейотической не сопровождаемой кроссинговером рекомбинации, она запускается с помощью репарации DSB и приводит к копированию интактной гомологичной последовательности в регион, который содержит DSB. Конверсия генов происходит при митозе также и может предлагать стратегию по коррекции гетерозиготных мутаций, подобно известным случаям спонтанной репарации генов⁴⁰. Современное понимание механизмов, связанных с конверсией генов рассмотрено в обзоре (ref. 40).

В недавнем исследовании по коррекции доминантной мутации зародышевой линии, делеции в 4-bp в гене MYBPC3, которая ассоциирована с гипертрофической кардиомиотрофией (HCM)⁴¹. Мы сгенерировали гетерозиготные мутантные эмбрионы человека путем оплодотворения ооцитов дикого типа спермиями, несущими мутантную копию MYBPC3 (MYBPC3^ΔGAGT). Чтобы вызвать событие генной конверсии, была разработана конструкция single guide RNA (sgRNA)-Cas9 (refs. 42-44), чтобы соединяться и индуцировать DSB вблизи делеции MYBPC3^ΔGAGT, но не в аллеле дикого типа. Мы также синтезировали экзогенную ssODN матрицу, кодирующую короткого гомологичное плечо региона мишени (общей длиной в 190 bp).

Используя секвенирование, мы установили, что CRISPR-Cas9 индуцирует DSBs в мутантном локусе в гетерозиготных эмбрионов человека, преимущественно (64%) репарируя их за счет генной конверсии (Fig. 3). Это приводило к репарации DSB и локуса MYBPC3^ΔGAGT у большинства эмбрионов человека, давая высокий процент гомозиготных MYBPC3WT/WT эмбрионов. Напротив, показатель NHEJ был значительно снижен (36%) по сравнению с тем, что наблюдается в гомозиготных локусах. Хотя в идеале показатель NHEJ должен быть ещё ниже этого, но даже такая эффективность показывает, что происходит коррекция мутаций у большинства мутантных эмбрионов, и значительно меньше эмбрионов отвергается по сравнению с обычной PGD. Интересно, что экзогенный ssODN, включаемый во время лечения не был использован эмбрионами.

Fig. 3: Repair outcomes in embryos heterozygous for a germline mutation in the MYBPC3 gene⁴¹.

CRISPR-Cas9 recognizes and induces DSBs on the mutant chromosome only, leaving the wild-type allele intact. DSBs are resolved via NHEJ but less frequently than seen for homozygous mutations. Gene conversion using the intact homologous chromosome occurs more frequently, resulting in repair of the DSBs and the germline mutation. HDR via an exogenous ssODN template is inhibited, possibly due to the failure to compete with the endogenous chromosome template. The percentages in the figure represent frequency at which each of the DNA repair mechanisms occurs in human embryos.

Точный механизм и время конверсии митотического гена у эмбрионов человека предстоит ещё изучить. Однако, наши результаты бросают вызов превалирующему мнению, что взаимодействия между гомологичными хромосомами и генная конверсия ограничены мейозом и отсутствуют или очень редки во время митотических клеточных делений. Альтернативные интерпретации этих результатов у людей были рассмотрены и исключены^45-47.