Заместительная терапия при гемофилии остается лечением на всю жизнь. Только генотерапия может лечить гемофилию на фундаментальном уровне. Система Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR, ассоциированных с nuclease 9 (CRISPR-Cas9) является всесторонним и пригодным для редактирования генома инструментом, который может быть использован для генотерапии гемофилии.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) пациента были получены из моноядерных клеток периферической крови (PBMNCs) с использованием эписомных векторов. Сконструированы AAVS1-Cas9-sgRNA плазмида, целенаправленно воздействующая на локус AAVS1, и AAVS1-EF1α-F9 cDNA-puromycin донорская плазмида и они были электропортированы в iPSCs. Когда инсерция F9 cDNA в локус AAVS1 была подтверждена, то вся геномная последовательность (WGS) выделялась, чтобы определить проблемы с эффектами вне мишени. iPSCs затем были дифференцированы в гепатоциты и был измерен уровень антигена и активность human factor IX (hFIX) в культуральном supernatant. Затем гепатоциты были трансплантированы мышам с non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency disease (NOD/SCID) путем инъекции в селезенку.

Итак, iPSCs пациентов были получены из PBMNCs. Человеческая полной длины F9 cDNA была внесена в локус AAVS1 в iPSCs от пациентов с гемофилией B, используя систему CRISPR-Cas9. Не выявлено мутаций вне мишени в WGS. Гепатоциты, дифференцировавшиеся из внесенных iPSCs смогли стабильно секретировать hFIX и были трансплантированы в NOD/SCID мышей в течение короткого времени. Следовательно, PBMNCs являются хорошим выбором соматических клеток для получения iPSCs от пациентов с гемофилией. Техника iPSC является прекрасным инструментом для генотерапии наследственных болезней человека. CRISPR-Cas9 является многосторонней, подходящей и безопасной системой для использования в iPSCs с низкими эффектами вне мишени.