Посещений: 
ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ НАРУШЕНИЯ
Редактирование генов
Gene editing for inflammatory disorders David T Ewart, Erik J Peterson,
Clifford J Steer
http://dx.doi.org/10.1136/annrheumdis-2018-213454
| |
|
Targets for gene editing in inflammatory diseases
Chimeric autoantibody receptor T cells
Из-за неспецифической природы современных протоколов иммуносупрессивного лечения обнаруживается существенный интерес к разрушению патологических компонентов иммунной системы, во всем остальном сохраняющей свою природную функцию (figure 3).
 Figure 3 Pathogenetic stages and methods by which inflammatory disease could be treated by gene editing at each stage. iPSC, induced pluripotent stem cell; Treg, T regulatory cell. Ellebrecht et al сообщили о проверке концепции использования модифицированных T клеток для лечения аутоиммунной болезни кожи pemphigus vulgaris (PV). 70 Авт. полагают, что T клетки могут быть генетически модифицированы, чтобы они специфически распознавали и устраняли клоны патогенных B клеток, экспрессирующих рецепторы для аутореактивных антигенов, в то же время сохраняя остатки B клеточного компартмента. Этот подход целенаправленно воздействует на индивидуальные клоны B клеток, отличаясь от обычной анти-CD20 терапии, которая истощает весь компартмент CD20 B клеток. Они исследовали PV поскольку эпитопы целенаправлено подвергались действию патологических антител. Чтобы специфически целенаправленно воздействовать на В-клетки, продуцирующие патологические аутоантитела, они использовали лентивирусный вектор, чтобы генетическим модифицировать Т клетки, чтобы они экспрессировали аутоантиген desmoglein (Dsg) 3 , слитый с CD137-CD3z сигнальными доменами. Возникающие в результате chimeric autoantibody receptor (CAAR) T клетки были затем введены, чтобы воздействовать на животных, моделирующих PV, включая гуманизированных мышей, моделирующих болезни. CAAR T клетки, как было установлено, распространяются, персистируют и обладают цитотоксичностью против клеток, экспрессирующих anti-Dsg3 B клеточные рецепторы у больных реципиентов in vivo. Гистопатологически CAAR T клетками леченные мыши обнаруживали отсутствие отложений IgG в выборках слизистой и не обнаруживали образования гистологически обнаружимых пузырьков. CAAR T клетки были способны проникать в эпидермис на модели ксенотрансплантата человека и таким образом облегчали болезненный процесс. Важно, что цитотоксичность возникала без очевидных токсических эффектов вне мишени.
Treatment of monogenic inflammatory diseases
Генетическая характеристика наследственных синдромов с периодической лихорадкой существенно продвинулась в эру быстрого, недорогого геномного секвенирования. Причинные одиночные мутации были идентифицированы при ряде наследственных синдромов, это открывает возможность корректирующей генотерапии для этих нарушений. Familial Mediterranean fever (FMF) вызывается мутациями в гене MEFV.71 Cryopyrin-associated periodic syndrome (CAPS), который включает в себя familial cold autoinflammatory синщдром, Muckle-Wells синдром и начинающуюся у новорожденных мультисистемную воспалительную болезнь, ассоциирует с мутациями в гене NLRP3, который кодирует cryopyrin, компонент inflammasome, на хромосоме 1q44.72 73 Некоторые др. примеры наследственных аутовоспалительных заболеваний включают: hyperimmunoglobulinaemia D с повторяющимися лихорадками,74 tumour necrosis factor (TNF) receptor-associated periodic syndrome (TRAPS),75 Blau синдром,76 pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum и acne syndrome (PAPA),77 и хронический повторяющийся мультифокальный остеомиелит.78 Имеется также всё увеличивающийся список хорошо описанных примеров моногенных болезней, среди и др. патологий обладают фенотипом тяжелого расстройства иммунитета, приводящие к аутоиммунитету: Aicardi-Goutieres синдром,79 STING-ассоциированная васкулопатия с началом в детском возрасте (SAVI), chronic atypical neutrophilic dermatosis with lipodystrophy and elevated temperature (CANDLE)80 и многие др. состояния иммунодефицита.81
Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) является примером моногенного ассоциированного с аутоиммунитетом нарушения, пригодного для генотерапии. WAS является редким X сцепленным иммунодефицитом, вызываемым вариантами кода гена WAS, белковый продукт которого регулирует актиновый цитоскелет в гематопоэтических клонах. Пациенты имеют тромбоцитопению, повторяющиеся инфекции, экзему, и повышенный показатель аутоиммунитета, высокий риск возникновения лимфопролиферативных нарушений и лимфоидных озлокачествлений, и часто погибают во время третей декады жизни.82 83 Совпадающие по HLA аллогенные haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) лечат; однако, существуют значительные риски связанные с процедурой болезненности и смертности84 При ранних попытках генотерапии WAS с использованием γ-retroviral вектора, 7/9 субъектов, участвующих в испытаниях приобретали вторичную лейкемию из-за вирусным энхансером обусловленного инсерционного мутагенза85 Последующие попытки использования само-инактивирующихся лентивирусных векторов для генетической модификации аутологичных HSCs перед auto-HSCT были успешными и ни один из пациентов не обнаруживал лейкемической трансформации.86 87
WAS является единственной болезнью людей, при которой энтузиазм подходов к генетическим модификациям подкреплен заботой о безопасности. Попытки лечения тяжелых комбинированных иммунодефицитов оказались подпорченными вторичными leukaemogenic трансформациями в ответ на инсерцию ретровирусных энхансеров онкогенных генов.52 Совсем недавно использование AAV для in vivo трансдукции спинальных alpha двигательных нейронов у не человеко-образных обезьян и поросят с человеческим SMN трансгеном привели к тяжелому гепатиту и дегенерации ткани мишени.88 Такие исходы указывают на необходимость тщательного изучения пре-клинической и клинической безопасности при манипуляциях с геномом при терапии болезней человека. Это особенно важно для многих моногенных аутовоспалительных заболеваний, которые обнаруживают меньшую болезненность и смертность по сравнению стяжелыми синдромами, такими как WAS.
При некоторых аутовоспалительных синдромах, таких как FMF, CAPS и TRAPS, патогенные типы клеток, скорее всего, происходят из костного мозга и они чувствительны к радиационной и химиотерапии. Эти состояния поэтому представляют собой идеальные первые мишени или 'низко-висящий плод' для лечения или ослабления с помощью генетических модификаций гематопоэтических клеток. Напротив, тканевые повреждения при interferonopathies, таких как SAVI и CANDLE , скорее всего, вызываются сложными многоклеточными ген-фенотип взаимодействиями и тогда стратегии д. быть нацелены на многие типы клеток и тканей. Высоко эффективной является технология редактирования оснований (see section above), делающая возможным генетическое редактирование для летальных и не летальных моногенных болезней.
Stem cell modification
Существует значительный интерес к генетически модифицированным iPSCs для лечения болезней человека. Преимущества iPSCs включают их потенциальное продолжительное существование in vivo, их способность дифференцироваться в ткани, затронутые хроническим воспалением, и их способность создавать большие количества без использования эмбрионов или других продуктов зачатия.
Controlled delivery of anticytokine therapy
Один из подходов для использования генетически модифицированных iPSCs является известная система closed-loop biologic drug delivery. Антицитокиновая терапия с помощью моноклональных антител и заманивая рецепторов была революционизирована для лечения хронических воспалительных болезней. 89 Однако, целевые ключевые способствующие воспалению молекулы, такие как TNF-α или interleukins (IL) навлекают риск побочных эффектов, включая инфекции и требуют постоянного дозированного воздействия на пациента лекарства, которое может вмешиваться в плейотропные роли цитокинов мишеней. 90 Чтобы решить проблему неспецифической потери функции цитокинов во всех тканях, полученных после такой терапии, Brunger et al осуществили поиск искусственной резистентности к функции цитокинов только среди интересующих клеток. Они модифицировали мышиные iPSCs используя CRISPR/Cas9 , чтобы внедрить противо-воспалительные молекулы (напр., IL-1Ra или химерную human sTNFR1-murine IgG) в локус Ccl2. 91 Продукт гена Ccl2 регулирует перемещения воспалительных моноцитов/макрофгов, базофилов и T лимфоцитов в ответ на воспалительные стимулы, такие как TNF-α и IL-1. 92 Внедрение естественно возникших антагонистов цитокинов в локус Ccl2 смягчает воспалительные эффекты при физиологических концентрациях IL-1 и TNF-α, если iPSCs были культивируемы в виде монослоя, а также после дифференцировки в искусственно сконструированную хрящевую ткань. Сконструированная хрящевая ткань была резистентной к патофизиологическим эффектам IL-1 и TNF-α. Предполагается, что этот подход может быть использован для создания целенаправленной базирующейся на клетках антицитокиновой вакцины.
Подходы, используемые для генетических модификаций, были обнаружены недавно в области регенеративной медицины в попытке восстановить функцию поврежденной и больной ткани.93-96
Osteoarthritis (OA) является чрезвычайно распространенным приводящим к инвалидности заболеванием. Суставы при ОА характеризуются присутствием способствующих воспалению цитокинов, 97 98 которые могут препятствовать терапевтическому эффекту, приживлению трансплантата и/или продолжительности терапии, базирующейся на стволовых клетках в этих условиях. Скорее, чем использование генетически преобразованных iPSCs, чтобы модифицировать передачу воспалительных сигналов на локальном тканевом уровне, Brunger et al использовали CRISPR/Cas9 чтобы преобразовать мышиные iPSCs в устойчивые к воспалению 61 с целью использования преобразованных клеток для регенеративной медицины во враждебном воспалительном микроокружении. Они устраняли ген IL-1 receptor type 1, отбирали клоны с гомозиготной делецией и использовали специфические факторы дифференцировки для генерации хряща из отредактированных клонов iPSC (figure 4). Возникающий в результате генетически модифицированный хрящ был резистентным к цитокинами вызываемой деградации ткани по сравнению в дикого типа и гетерозиготными клонами хряща.
 Figure 4 Figure
Schematic illustration of the strategy for generating iPSCs resistant to IL-1-mediated signalling for tissue engineering applications. (A) Binding of IL-1 ligand to the IL-1RI results in activation of a proinflammatory transcription programme involving the transcription factors NF-?B, JNK and MSK-1. (B) gRNAs target the genome-editing nuclease Cas9 to two sites flanking exon 2 of IL-1RI, which encodes the signal peptide sequence. (C) Cas9 induces DNA DSBs, which may be repaired via NHEJ. (D) NHEJ leads to a subset of alleles with fully intact IL-1RI, while others may have genomic disruptions at the IL-1RI locus, including excision of the signal peptide sequence, resulting in loss of signalling through IL-1RI. DSB, double-stranded break; gRNA, guide RNA; IL-1, interleukin-1; IL-1R1, IL-1 receptor type 1; iPSC, induced pluripotent stem cell; NHEJ, non-homologous end joining. (Reproduced from Brunger et al 61 with permission; © Arthritis and Rheumatology)
Webber et al также использовали iPSCs чтобы исследовать возможность регенерации ткани при рецессивном dystrophic epidermolysis bullosa, тяжелом нарушении, вызываемом мутациями в гене COL7A1, которые вызывают угрожающие жизни нарушения целостности кожи. 99 Происходящие от пациентов первичные фибробласты были изолированы и устранен дефект гена COL7A1 с использованием CRISPR/Cas9. Генетическая модификация была оценена и было установлено, что она является специфической для намеченного локуса, не говоря уже об одиночной, предсказуемой модификации вне мишени в клоне, подвергшемуся действию Cas9 nuclease скорее, чем nickase. iPSCs были получены из модифицированных фибробластов и обнаруживали способность дифференцироваться к кератиноциты, мезенхимные стволовые клетки и HSCs.
T regulatory cells
T regulatory cells (Tregs), определяются классически как CD4+CD25+FOXP3+, являются естественно возникшими субнаборами helper T клеток, которые обладают иммунорегуляторными функциями, включая супрессию специфичных к антигенам T клеток и поддержание периферической толерантности. Наблюдаемая частота супрессивной функции Tregs в ассоциации с аутоиммунными болезнями 100 101 интересует их потенциалом терапевтического использования. Эффективность Treg клеточной терапии зависит от доступности больших количеств Tregs - во много раз больших количеств естественно возникающих доступных Tregs. Протоколы экспансии in vitro поэтому важны для Treg клеточных терапевтических подходов. Однако, имеются барьеры обогащению in vitro антиген-специфических T клеток, 102 такие как потеря регуляторного фенотипа и недостаточная экспансия in vitro. Эти препятствия возможно преодолеть с помощью техники редактирования генов. Существует также интерес к использованию редактирования генов для индукции in vivo продукции антиген-специфических Tregs. 103
Genetically modified Treg cell therapy
Выделение достаточных количеств Tregs с или без редкой антигенной специфичностью из популяции естественных T клеток является основным затруднением для сфокусированной на Treg терапии. Некоторые недавние стратегии продукции больших количеств пригодных для клиники Tregs и для генерации антиген-специфических Tregs in vitro использовали геномные преобразования. CD4+ T клетки были модифицированы ex vivo, чтобы они экспрессировали 'master' фактор транскрипции FOXP3 способом, который позволяет им дифференцироваться в крупную популяцию Tregs. Популяции Treg, увеличивающиеся с помощью FoxP3, были использованы для лечения immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X сцепленного синдрома, вызываемого дисфункцией гена FoxP3 у пациентов, а также у животных моделей аутоиммунитета.104-106
Др. подходом является использование переноса гена TCR непосредственно в поликлональные Tregs для экспрессии специфического TCR гена и перенаправления тем самым специфичности в направлении одного антигенного эпитопа. Эта техника продемонстрировала свою эффективность на нескольких мышиных моделях толерантности трансплантата, воспалительного артрита и на человеческих T клетках для целенаправленного воздейстия на клетки островков.107-110
Наконец, способом, аналогичным для генерации CAR T клеток для терапии озлокачествления, Tregs могут быть преобразованы для экспрессии внеклеточного scFv или антигенного домена, слитого с нижестоящей внутриклеточной сигнальной молекулой. Антиген-специфичные химерные рецепторы были использованы при мышином экспериментальном аутоиммунном энцефалите (EAE) 111 112 и мышиной модели воспалительной болезни кишечника (bowel). 113 114 Проделаны первые попытки проверить пригодность citrullinated-peptide-specific CAR Tregs для лечения ревматоидного артрита. 115 Химерные аутоантигенные рецепторные Tregs были изучены на мышиной модели haemophilia A с формированием аутоантител к фактору VIII. 116 Продуцирующие аутоантитела B клетки оказались способными становиться толерантными ('tolerized') и продукция аутоантител останавливалась.
Induction of antigen-specific Tregs in vivo
Печень является мощным ретикулоэндотелиальным органом и состоит из резидентных клеток, которые поддерживают tolerogenic эффект в отношении собственных и чужеродных антигенов путем экспрессии ингибиторов поверхностных лигандов для активации T клеток и продукции воспалительных медиаторов. 117-119 Как таковая она уникально подходит в качестве мишени для генной терапии путем индукции толерантности к специфическим антигенам. Keeler et al использовали AAV8 вектор с кДНК для нейробелка, myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), под контролем специфичного для печени промотора, чтобы индуцировать экспрессию в печени MOG у мышей, моделирующих множественный склероз, EAE. Экспрессия в печени MOG использует tolerogenic свойства печени для продукции MOG-специфических FOXP3+ Tregs in vivo. Мыши, обработанные профилактически оказались защищенными от возникновения EAE, а у мышей уже имеющих умеренный или средний нейрологический дефицит вектор в отдельности оказывался эффективным в устранении клинических и патологических признаков болезни. При комбинировании с иммуносупрессией, AAV иммунотерапия избавляла мышей от фатальной конечной стадии EAE и тяжелого паралича. 120 Используя сходную стратегию, был использован лентивирусный вектор для индукции insulin B цепи 9-23, иммунодоминантного T клеточного эпитопа у non-obese diabetic (NOD) мышей, в NOD гепатоцитах. Воздействие лентивируса индуцирует insulin B цепь 9-23-специфических эффекторных T клеток, а также FoxP3+ Tregs, которые останавливают инфильтрацию островковых иммунных клеток и защищают от T1D. При комбинировании с anti-CD3 моноклональными антителами, T1D устраняется и обнаруживается зависимость от Tregs. 121
RNA editing and transcriptomic modification
Технологии по использованию редактирования РНК всё ещё в начальной стадии по сравнению технологиями, вызывающими постоянные изменения в геноме. Однако, существуют умозрительные представления о использовании редактирования РНК при воспалительных болезнях. Cox et al оказались способны репарировать мутантные транскрипты 878G>A (AVPR2 W293X), ассоциированные с Х-сцепленным nephrogenic diabetes insipidus и 1517G>A (FANCC W506X) мутацию, ассоциированную с анемией Fanconi. 38 Они также подтвердили возможность использования сходных методов для коррекции тысяч G -> A мутаций, ассоциированных с патологическим состоянием, открывая потенциальную возможность воспроизводить мимикрические защитные аллели для подверженных риску индивидов во время иммуногенных и воспалительных стрессов.
Conclusions
The technology to manipulate genomic material has allowed tremendous discovery in the biology of inflammatory disease. While still in its infancy, genetic editing is now, decades after the discovery of the nature and structure of DNA, entering the realm of therapy (table 2). This is particularly true for severe monogenic disease. There are several apparent niches for gene editing in the treatment of inflammatory diseases, including correction of monogenic autoinflammatory syndromes, CAAR T cell therapy for autoantigen-specific targeting of pathologic B cell clones, modification of iPSCs for controlled cytokine delivery and tissue regeneration and Treg-based therapies. As technology matures, cell therapies based in genome editing will likely strive towards the 'holy grail' of autoimmune disease therapy, that is, targeted inhibition of the pathologic components of the immune system without necessitating generalised immunosuppression. New tools for transient modification of protein structure, function and expression will allow us to fine-tune the delicate balance the immune system maintains between defence and tolerance to self. Harnessing the inherent specificity of our own immune system to target pathologic B or T cell clones, particular cellular subsets necessary for disease or disrupt trafficking to affected tissues will likely become feasible in the near future. Specific therapy will more potently inhibit the inflammatory processes yet spare the remainder of the immune system. But therapies utilising genetic editing will likely expand beyond ex vivo modification of cells of the immune system when we can reliably target certain cell types or tissues in vivo. One can imagine stepwise approaches for targeted genetic honing to redirect from inflammation to homeostasis in chronic inflammatory diseases affecting a particular organ or cell type. Addition to or antagonism of various growth factors targeted to organ parenchymal or interstitial cells could potentially be applied to fibrotic inflammatory diseases, which at present have a paucity of treatment options. Furthermore, more elegant and coordinated control of gene expression could allow the capability to generate replacements for organs or tissues damaged by inflammation, such as a biologic rather than plastic and metallic replacement for a joint with end-stage OA. The increasing capability, ease of use and reliability of modern tools for gene editing will undoubtedly lead to new pathophysiologic insights and therapies for immune and inflammatory diseases.
< a href="https://ard.bmj.com/highwire/markup/249881/expansion?width=1000&height=500&iframe=true&postprocessors=highwire_tables%2Chighwire_reclass%2Chighwire_figures%2Chighwire_math%2Chighwire_inline_linked_media%2Chighwire_embed"> Table 2
Human inflammatory disease states for which gene editing approaches and therapies have been considered, and for which studies in animal models or primary human cells have been reported
|