Митохондриальные болезни являются большой группой наследственных, многосистемных нарушений, существенная часть которых передается посредством мутаций митохондриальной ДНК (mtDNA) с минимальной распространенностью 1 на 5000 взрослых¹. mtDNA человека небольшая, двухнитевая с мультикопированным геномом представленным ~100-10000 копиями на клетку². В болезненном состоянии мутантная mtDNA часто сосуществует с гетероплазмией mtDNA дикого типа, и тяжесть болезни при состояниях, связанных с гетероплазмией мутантной mtDNA, коррелирует с грузом мутаций³. Пороговый эффект, когда груз мутантной mtDNA более 60%, должен быть превзойден прежде, чем проявятся симптомы, это характерное свойство болезней с гетероплазмией mtDNA, предпринимаются попытки сдвинуть соотношение гетероплазмии ниже этого порога. Одним из таких подходов является управляемый nucleolysis mtDNA с использованием среди прочих программируемых инструментов преобразования генома, нацеленных на митохондрии zinc-finger nucleases (mtZFNs)^4-7. Поскольку митохондрии млекопитающих лишены эффективного пути репарации двойных разрывов ДНК⁸, поэтому избирательное введение разрывов двойной нити в мутантную mtDNA приводит к быстрой деградации таких молекул с помощью компонентов mtDNA реплисом⁹. Т.к. количество копий mtDNA поддерживается на специфичном для клеток постоянном уровне, то избирательная элиминация мутантной mtDNA будет стимулировать репликацию оставшегося пула mtDNA, вызывая сдвиг соотношения гетероплазмии.

В предыдущей работе мы описали методы доставки zinc-finger proteins (ZFPs) в митохондрии культивируемых клеток^10,11 и сборку, и функцию эффективной архитектуры mtZFN, способной вызывать значительный гетроплазмический сдвиг, приводящий к фенотипическому восстановлению клеток культуры, происходящих от пациентов^5,12-14. Используя сначала доступную мышиную модель гетероплазмической митохондриальной болезни, несущих точковую мутацию m.5024C>T в митохондриальной tRNAAla (mt-tRNAAla), которая в точности воспроизводит ключевые молекулярные нарушения в кардиальной ткани¹⁵, мы продемонстрировали эффективность манипуляций с гетероплазмией mtDNA , сопровождаемую одновременно восстановлением молекулярного и биохимического фенотипов в сердце после доставки mtZFNs путем системного введения adeno-associated virus (AAV).

В этом контексте вторичная генерация архитектуры tail-tail mtZFN, продемонстрировавшая эффективность в предыдущих работах^5,16, мы использовали, чтобы создать пары ZFPs со специфичностью связывания одиночного нуклеотида для m.5024C>T. Т.к. этот сайт в мышиной mtDNA подходит для ZFPs, использовали селекцию стратегии таргетинга с варьирующими количествами zinc-finger мотивов, длин спейсерных регионов и дополнительных линкеров. Сборка производилась из кандидатов ZFPs, присутствующих в библиотеке (Supplementary Fig. 1a and Supplementary Table 1), содержащей 24 уникальных ZFPs, нацеленных на m.5024C>T сайт, обозначенных как mutant-specific monomer (MTM), и одиночный партнер ZFP, нацеленный на соседнюю последовательность противоположной нити, обозначенную как wild-type-specific monomer 1 (WTM1). Эти конструкции были подвергнуты ряду испытаний на эмбриональных фибробластах мышей (MEFs) обладающих гетероплазмией ~65% m.5024C>T , чтобы оценить специфичность активности по сдвигу гетероплазмии (Supplementary Fig. 1b). Эти испытания выявили устойчивую, специфическую активность спаривания MTM25/WTM1 (Fig. 1a and Supplementary Fig. 1c), которые вызывали сдвиг ~20%, с 65% до 45% m.5024C>T гетероплазмии в линии клеток MEF, что было подтверждено pyrosequencing (Fig. 1b). Мы также подтвердили исключительную митохондриальную локализацию MTM25 и WTM1 в MEF клетках(Supplementary Fig. 2) и затем отобрали эту пару для экспериментов in vivo.

Fig. 1: Strategy to eliminate m.5024C>T and in vivo mtDNA heteroplasmy modification.

a, Illustration of the mtZFN strategy. WTM1 binds upstream of m.5024 in wild-type and mutant genomes; MTM25 binds preferentially to the mutated site. Dimerization of obligatory heterodimeric FokI domains produces DNA double-stand breaks, resulting in the specific depletion of mutant mtDNA. b, Pyrosequencing of m.5024C>T heteroplasmy from MEFs transfected with controls or MTM25 or WTM1 at differing concentrations, facilitated by tetracycline-sensitive HHR13. The change in m.5024C>T heteroplasmy is plotted. utZFN is a mtZFN that does not have a target site in mouse mtDNA13. Concentration '-' and '+' refer to zero and maximum concentration, respectively. n?=?5 (mtZFN, low expression), n = 8 (mtZFN, high expression) and n?=?4 (all other conditions) biologically independent cell cultures. The error bars indicate the s.d. Statistical analysis was performed using the two-tailed Student's t-test. Vehicle/mtZFN low expression: P?=?0.000021; vehicle/mtZFN high expression: P?=?0.000083. Gray bars indicae the mean. c, Scheme of in vivo experiments. MTM25 and WTM1 are encoded in separate AAV genomes, encapsidated in AAV9.45 then simultaneously administered by tail-vein (TV) injection. Animals are euthanized at 65?days post-injection. d, Western blot of total heart protein from animals injected with 5x10¹² viral genomes of MTM25 and/or WTM1. Both proteins include the HA tag and are differentiated by molecular weight. This blot was performed twice with similar results. The raw data are available for this panel (Supplementary Fig. 9). CBB, Coomassie Brilliant Blue. e, Pyrosequencing of m.5024C>T heteroplasmy from ear (E) and heart (H) total DNA. The change in m.5024C>T is plotted. n = 20 (vehicle), n = 3 (WTM1 only) and n = 4 (all other conditions) animals (Supplementary Table 2). The error bars indicate the s.e.m. Statistical analysis was performed using the two-tailed Student's t-test. Vehicle/intermediate dose: P < 0.00001; vehicle/high dose: P < 0.00001. Gray bars indicate the mean. AAV '-' and '+' refer to zero and maximum dose, respectively. f, Assessment of mtDNA copy number by quantitative PCR. n?=?8 (vehicle) and n = 4 (all other conditions) animals (Supplementary Table 2). The center line is the mean and the error bars indicate the s.e.m. Statistical analysis was performed using the two-tailed Student's t-test; P = 0.007931. Central black line indicates the mean. ** indicates P < 0.01, *** indicates P < 0.001.

Итак, мы использовали недавно полученную мышиную модель гетероплазмической mtDNA болезни в сердечной ткани: мыши m.5024C>T tRNAAla. Используя системно вводимые, нацеленные на митохондрии zinc-finger nucleases доставляемые с помощью adeno-associated virus, мы индуцировали специфическое удаление мутантной mtDNA в сердце, это сопровождалось реверсией молекулярного и биохимического фенотипов. Эти находки подтвердили пригодность принципа, что гетероплазмия mtDNA может быть скорректирована с использованием программируемых нуклеаз, предоставляющих терапевтический подход к лечению митохондриальных гетероплазмических болезней разного генетического происхождения.