Посещений:
НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ БОЛЕЗНИ



Использование микроглии, получаемой из iPSCs

Concise Review: Modeling Neurodegenerative Diseases with Human Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia
Walther Haenseler, Lawrence Rajendran
STEM CELLS 2019;37:724–730

Микроглия - это располагающиеся в головном мозге макрофаги. Большинство моделей болезней нейродегнерации использует пре-клинические исследования на мышиных моделях или непосредственно в головном мозге, в органо-типических культивируемых ломтиках или как микроглию после выделения из свежей такни головного мозга или из ex vivo совместных культур с астроцитами. Однако, перенос результатов сышей на патологию человека ограничен из-за различий в ключевых модуляторах их соотв. нейровоспалительных путей1 и дифференциальной экспрессии генов риска2.
Всесторонний анализ только что изолированной микроглии от здоровых или пациентов чрезвычайно затруднен, поскольку материал сильно ограничен, а ткани получаемые post-mortem или во время хирургии на головном мозге, часто имеют артефакты или сочетаемые заболевания. Поэтому исследования проводятся на культивируемой плодной или взрослой первичной микроглие. Эти культуры не являются очень аутентичными моделями для микроглии, находящейся в окружении головного мозга и теряют микроглиальные транскриптомные сигнатуры в течение первых часов культивирования ex vivo3.
Выборки головного мозга от пациентов с нейродегенеративными болезнями чрезвычайно редки и обычно доступны только после смерти. Однако, чтобы понять зарождение патологии или искать потенциальные лекарства, уменьшающие патологию, выборки д быть взяты от пациентов ещё до появления симптомов или на ранних ст. болезни. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) могут происходить из многих легко доступных тканевых источников пациентов, таких как фибробласты кожи или кровь. Разработаны многие протоколы по дифференцировке iPSCs в ключевых игроков нейродегенерации4 (т.e., нейроны, микроглию, астроциты и олигодендроциты) и для нейродегенеративных болезней, начинающихся у взрослых, поэтому можно ожидать, что во многих случаях такие происходящ0ие из iPSC типы клеток будут представлять собой пресимптоматические ст. болезни, обладающие физиологическим дефицитом, приводящим к гибели нейронов. Кроме того, известно, что созревающие iPSC во взрослые нейроны требуют более 100 на дифференцировку5.
Моноциты крови легко доступны и существуют протоколы, как заставить их приобретать качественные особенности микроглии6-8. Позднее анализ транскриптов, однако, выявил, что происходящая из моноцитов крови микроглия отличается существенно от микроглии головного мозга9. Моноциты крови взрослых происходят из myeloblastosias (MYB) прото-онкоген, зависимых от транскрипционного фактора гематопоэтических стволовых клеток (HSCs) в костном мозге, где микроглия происходит из MYB-независимых происходящих из желточного мешка плодных макрофагов, которые проникают в головной мозг человека приблизительно на 31 день пред закрытием гематоэнцефалического барьера (BBB), пролиферируют локально и не замещают др. макрофаги у здоровых индивидов10. Поэтому из моноциты крови происходящая микроглия, скорее всего, напоминает происходящие из моноцитов крови клетки, обнаруживаемые в головном мозге после инсульта. Эти клетки принимают морфологию микроглии, но отличаются функционально и на транскрипционном уровне от настоящей микроглии11. Поэтому мы полагаем, что для получения модельной почти аутентичной микроглии необходимо в точности воспроизвести онтогенез микроглии и предоставить нейрональное окружение. Клетки д. дифференцироваться MYB-независимым способом в происходящие из желточного мешка плодные макрофагиa и быть способны проникать в нейральное окружение, где они будут созревать и принимать разветвленную микроглиальную морфологию и где они смогут приобрести полный набор функций микроглии только после взаимодействия с нейронами.

Table 1. Comparison of different iPSC microglia models



Genetic Engineering of iPSC


Вообще-то самым крупным преимуществом iPSCs является то, что они могут быть культиврованы в течение длительного времени без потери целостности и плюрипотентности генома. iPSCs пациентов поэтому являются теоретически неограниченным источником материала для моделирования болезней или заместительной терапии. iPSCs также доступны для генетических манипуляций, тогда как клональные линии после манипуляций могут быть отобраны и качественно контролироваться перед дифференцировкой. Ретровирусы и adeno-associated viruses (AAV) являются прекрасным инструментом для коррекции мутаций потери функции путем избыточной экспрессии белка с нарушенной функцией, если коррекция за счет дозы гена неуместна52, 53.
CRISPR/Cas9, Zinc finger и TALEN технологии могут быть использованы для редактирования генов, путем внесения трансгена в определенное место генома. Внесение трансгенов в спасительные сайты убежища, такие как AAVS1 приводит к фенотипической коррекции49. Но любая из этих технологий может также использоваться для создания линий с нокаутным геном или откорректированным геном путем целенаправленного воздействия на интересующий ген. Система CRISPR/Cas9 была использована для не оставляющей следов коррекции генов35 и мечения эндогенно экспрессирующихся генов54. Она также была применена к iPSCs пациентов, чтобы удалить дополнительную копию гена, такого как при очень редкой трипликации SNCA гена55, вызывающие с ранним началом болезнь PD, и чтобы удалять surplus GGGGCC повторы в C9orf72, вызывающие amyotrophic lateral sclerosis (ALS)56.
Надежное фенотипирование болезни может осуществляться у нескольких пациентов, несущих одну и ту же мутацию, но которые не являются детями одних родителей, и поэтому имеют разные генетические фоны. Альтернативно, изогенные пары могут быть созданы и за счет коррекции линии iPSC пациента для получения изогенной контрольной линии или путем внесения мутации пациента в здоровую контрольную линию, чтобы воспроизвести редкий фенотип пациента (Fig. 1A). Использование изогенных пар дает большие преимущества, т.к. две линии предъявляют минимальные требования к эксперименту. big advantage that two lines are the minimal requirement for an experiment. Работая со спорадическими болезнями у пациентов, iPSCs оказываются наиболее заманчивыми по сравнению с гетерогенными фенотипами большого числа отличающихся пациентов (sex, age, biomarker, severity of the disease, look for compound heterozygous SNPs, etc.).

Figure 1 Induced pluripotent stem cell (iPSC) tools and their suggested use in the microglia/neuron coculture model. (A): iPSCs derivation from healthy controls or patients. On iPSC level, mutations can be introduced to healthy control cells or removed from patient cells without otherwise changing the genetic background of the iPSC line, thus obtaining ideal isogenic control lines. (B): Examples for the use of fluorescent reporters in iPSC microglia/neuron cocultures. (B1): Neurons (red) and microglia (green), which express cytosolic fluorescent proteins allow the identification of corresponding cells in life imaging experiments. (B2): Tissue-specific expression of fluorescent proteins can be used to identify subtypes of cells in the culture (e.g., TH for dopaminergic neurons). (B3): Tissue-specific expression of fluorescent proteins can show activation status of microglia (e.g., NF??B). (B4): Tagged proteins can show the position of a protein (e.g., PSD95 to mark the synapses). (C): Strategy to identify the disease-causing cell type by combining matched and mismatched control and patient neurons/microglia and comparison to monocultures to test if cells produce the respective phenotype on their own.

Репортерные iPSC линии обладают многими возможностями применения в монокультурах и системах совместных культур (Fig. 1B). Ретровирусы могут быть использованы для создания репортерных линий, экспрессирующих флуоресцентные белки под контролем специфических промоторов, чтобы идентифировать интересующие клетки, напр., thyroxine hydroxylase в качестве маркера допаминергических нейронов57, или ядерный фактор "kappa-light-chain-enhancer" активированных B-клеток (NFκB), чтобы идентифицировать активированную микроглию58. Экспрессия меченных белков позволяет легко визуализировать и отслеживать интересующий белок в живых клетках. Однако, ретровирусами внесенные гены часто молчат в iPSCs или во время дифференцировки интересующих клеток. Это может препятствовать использованию молчащих устойчивых промоторов для управления экспрессией трансгенов, для этого промотор комбинируется с последовательностью, которая препятствует молчанию, такой как последовательность UCOE52, 59 или путем внесения селекционной кассеты и использования постоянного селекционного давления (такого как puromycin, neomycin, zeocin) как это у же осуществлялось для RFP iPSC-происходящей микроглии перед добавлением её в совместную с нейронаим культуру17. Др. возможность связана с редактированием локуса эндогенного гена, чтобы совместно экспрессировать флуоресцентный репортер или с непосредственным внесением метки, такой как короткая FLAG метка, чтобы видеть эндогенный белок60. Более того, инструментами моделирования являются индуцибельные промоторы, позволяющие переключать гены в дифференцированных клетках61.

Using Microglia/Neuron Cocultures for Disease Phenotyping and Drug Screening


недавно было продемонстрировано на мышиной модели, что нейродегенерация посредством потери синапсов может возникать даже, если нейроны оказываются не изменены, но удален ген (в данном случае, TARDP/TDP-43) специфически в микроглии, указывая тем самым на ключевую роль микроглии в нейродегенрации и тем самым подкрепляя необходимость совместного культивирования человеческих iPSC микроглии и нейронов для изучения, как эти синапсы теряются62.
Поиск лекарств, которые предупредят потерю синапсов в системе совместного культивирования iPSC, может базироваться га репортерных линиях. Нейроны с флуоресцентно меченными синапсами могут быть использованы для метода synaptotoxicity в комбинации с микроглией, содержащей репортер активации. В качестве первой ступени необходимо идентифицировать synaptotoxic состояния, чтобы воспроизвести вызываемую микроглией потерю синапсов в совместной культуре. Второй ступенью может быть скрининг на реагенты, которые прерывают взаимодействия между микроглией и нейронами, приводящей к индукции synaptotoxicity, и останавливают потерю синапсов. Такие системы совместного культивирования с полностью автоматизированным high-content-imaging и автоматизированным анализом изображений могут сделать возможным высокопроизводительный поиск лекарств.
Возможно наиболее подходящими для поиска лекарств являются patient/gene-engineered iPSC microglia/neuron совместные культуры, где первой ступенью является идентификация хорошо воспроизводимого фенотипа болезни. В идеале можно будет подтвердить, что такой фенотип подтверждается (resolved) в изогенных контролях или путем использования др. подходов генотерапии. Как только фенотип идентифицирован система позволяет различать, чтобы понять какие клетки являются источником фенотипических отклонений и , следовательно, обладают потенциалом быть мишенью для лекарств. Такое вычленение может быть осуществлено в монокультурах нейронов и микроглии, а также с помощью match/mismatch экспериментов со здоровым контролем и болезнью микроглии и нейронов в система совместного культивирования (Fig. 1C). Как только фенотипы идентифицированы, система становится идеальной для поиска лекарств. Более того, пациенты могут быть стратифицированы в соответствии с фенотипами и реакции на лекарства могут быть тестированы в подгруппах или с помощью подходов реальной персонализованной медицины. Match/mismatch эксперименты смогут также ответить, какие клетки д. подвергнуться целенаправленному воздействию клеточной заместительной терапии или генотерапии.

Potential Clinical Use of Gene-Edited iPSC


Генотерапевтические подходы для лечения нейродегенеративных болезней обычно используют AAV векторы, которые инъецируются непосредственно в головной мозг53, 63, 64. Напр., вектор AAV9 для генотерапии успешно корректирует фенотип болезни Gaucher's у плодов и новорожденных GBA KO мышей и, как было установлено, способен трансдуцировать нейроны головного мозга макак после доставки in utero вектора для генотерапии53.
Имплантации аутологичных ген-отредактированных происходящих из iPSC клеток пациентам открывают новые терапевтические возможности. Человеческие происходящие из iPSC dopaminergic нейроны, как было установлено, обладают высоким терапевтическим потенциалом дли клеточной терапии у приматов, моделирующих PD65. Инструментами для редактирования iPSC являются, как известно, происходящая из iPSC микроглия, успешно интегрирующаяся в головной мозг мышей21, 26 и GMP grade из iPSC происходящие HSCs при необходимом контроле качества, находятся в разработке66.
Очевидным подходом к генотерапии по коррекции линий iPSC от пациентов является замена на здоровый ген. Но можно продвинуться на ступень дальше и создать улучшенные происходящие из iPSC клетки, напр., с улучшенной очисткой специфических токсических пептидов или с уменьшенным нейротоксическим репертуаром. Результаты нашей лаб. показали, что доводка генов микроглии может менять исходы, приводящие к нейродегенерации50 и поэтому они безусловно меняют происходящую из iPSC микроглию, которая обладает свойствами, которые могут быть использованы для терапевтической нейропротекции.

Conclusion


Недавно опубликовано несколько убедительных протоколов по генерации человеческой происходящей из iPSC микроглии17, 21-24. MYB-независимое происхождение такой микроглии было убедительно продемонстрировано с помощью протокола, разработанного в James лаб., который использует MYB KO iPSCs16. Наиболее аутентичная морфология микроглии наблюдается в совместных культурах с нейронами, соотв., после инъекции в головной мозг мыши, это также коррелирует с наиболее похожим транскриптомом на таковой микроглии17, 24. Однако, большинство болезней, для которых проводили фенотипирование, использовали монокультуру микроглии. Для многих методов фенотипирования монокультуры приемлемы и экономически объяснимый выбор, но изучение роли взаимодействий микроглии с нейронами при нейродегенеративных болезнях, нуждаются в совместном культивировании микроглии с нейронами. Существует несколько моделей 2D и 3D совместных культур, которые могут выявлять нейротоксичность на разных уровнях сложности. Главным преимуществом происходящей из iPSC микроглии по сравнению с первичными клетками человека являются теоретически неограниченная пригодность материала от пациентов, а также возможность создания изогенного контроля и искусственно созданных репортерных клеток, разработанных специально в качестве методических индикаторов. Match/mismatch эксперименты могут идентифицировать происхождение нейротоксичности и тем самым показать, какой тип клеток д. служить мишенью для поиска лекарств и генотерапии или заместительной клеточной терапии. AD, PD и FTD/ALS являются сложными гетерогенными болезнями, при которых пациенты частично перекрываются (substratify) в реакциях на лекарство. Лекарства кандидаты, тестируемые в совместных культурах iPSC, используют клетки от крупных кагорт пациентов, чтобы с уверенностью substratify пациентов в соответствии с их реакцией на лекарства. НО в будущем будут использоваться сложные системы совместных культур, используя реальные подходы персонализованной медицины для тестирования реакции на лекарство каждого пациента перед началом лечения.