В недавнем исследовании, опубликованном в Science (Matharu et al., 2019) благополучно целенаправленно воздействовали на некодирующий регион генома Sim1 и MC4R с помощью rAAV с упакованным CRISPRa, и успешно устранили синдром ожирения, вызываемый гаплонедостаточностью у модельных мышей, это пролило свет на использование этого подхода для терапии в будущем (Matharu et al., 2019).
Транскрипция эндогенного гена может быть смоделирована посредством базирующегося на CRISPR-Cas9 редактирования генов путем включения каталитически деактивированной Cas9 (dCas9), слитой с белковым доменом, чтобы регулировать транскрипцию (Boettcher and McManus, 2015). Single guiding RNAs (sgRNA) нацеливает dCas9 слитые белки на специфические сегменты ДНК, такие как промоторы и энхансеры, это может приводить к активации (CRISPRa) или интерференции (CRISPRi) транскрипции в зависимости от соотв. слитой ДНК кассеты. Rosa26 knock-in конструкция, связанная с Cre/loxP рекомбинационной системой, обеспечивает зависимую от условий избыточную экспрессию экзогенных генов в специфических тканях и делает возможной также сайт-специфическую интеграцию супер крупного фрагмента (20-30 kb) (Hohenstein et al., 2008). Однако, эта система обычно нуждается в сложных knock-in операциях и multiple-crossing схемах, чтобы генерировать желательную линию мышей, а это вызовет тяжелое влияние на эффективность системы. Бактериальные искусственные хромосомы (BAC), базирующиеся на случайном transgenosis, используются в качестве альтернативного подхода для избыточнаой экспрессии специфического гена у модельных животных, они позволяют быстро и эффективно получать трансгенного основателя у мышей. Однако, благодаря интеграции кассеты генов в случайные локусы, эта техника может вызывать нежелательные мутации, а гены, фланкированные этим сайтом инсерции, будут замалчиваться непредсказуемо (Shinohara et al., 2007). К счастью, CRISPRa/dCas9 система обладает потенциалом преодолевать этот барьер. Многочисленные исследования продемонстрировали, что CRISPRa система высоко эффективна и воспроизводима, чтобы повысить экспрессию генов или откорректировать мутации, вызывающие болезнь (Matharu et al., 2019; Pignani et al., 2019; Savell et al., 2019). Однако, эта система имеет еще многие недостатки. Мутагенез вне мишени был самой первой трудностью, препятствующей терапевтическому использованию системы CRISPRa (Akcakaya et al., 2018). AДр., но не последний, ключевой вопрос, как эффективно доставлять CRISPR-Cas9 в соотв. ткани или типы клеток, чтобы их инфицировать или трансфицировать (Ma et al., 2014). К счастью, рекомбинантные adeno-associated virus (rAAV) оказались наиболее приемлемыми для доставки CRISPR-Cas9, благодаря их высокой эффективности, долговременной экспрессии трансгена, меньшего потенциального иммуногенного эффекта и свойства отсутствия интеграции без случайных геномных инсерций (Liu et al., 2017).
Используемая в качестве эффективного редактора генома CRISPR-Cas9 система широко используется при биомедицинских преобразованиях соматических клеток (Liang et al., 2015; Cohen, 2018), а также в качестве многообещающего инструмента для воздействия на генетические нарушения в модельных системах в пределах от клеток in vitro до животных in vivo. Напр., она может восстанавливать экспрессию белка dystrophin в кардиальной и скелетных мышцах путем коррекции мутаций, ответственных за Duchenne muscular dystrophy (DMD) (Long et al., 2016; Nelson et al., 2016; Tabebordbar et al., 2016; Amoasii et al., 2018). В случае сердечно-сосудистых болезней CRISPR редактирование генов может существенно снизить уровень в сыворотке PCSK9 и общего холестерола путем целенаправленного воздействия на ген PCSK9 в гепатоцитах in vivo (Ding et al., 2014; Wang et al., 2016; Rossidis et al., 2018; Wang et al., 2018). Кроме того, in vivo CRISPR-Cas9 редактирование гена предупреждает врожденную дегенерацию сетчатки путем избирательного устранения S334ter мутации у модельных крыс с аутосомно доминантным пигментным ретинитом (Bakondi et al., 2016). Более того, система редактирования CRISPR-Cas9 была использована для лечения приобретенных болезней, таких как рак, HIV и hepatitis B (Seeger and Sohn, 2014; Soriano, 2017; Xiong et al., 2019).
Single minded family basic helix-loop-helix transcriptional factor 1 (SIM1), фактор важный для дифференцировки нейронов и функционирования paraventricular nuclei (PVN) в гипоталямусе, играет центральную роль в потреблении пищи и гомеостазе энергии. Гаплонедостаточность Sim1, когда один из двух копий генов функционально потерян, развивается ожирение с ранним началом, при этом увеличивается линейный рост, гиперфагия, гиперинсулинемия и hyperleptinemia, но не изменяются энергетические затраты (Michaud et al., 2001). Избыточная экспрессия в гипоталамусе Sim1 устраняет вызванную питанием тучность благодаря снижению потребления пищи (Kublaoui et al., 2006). Melanocortin-4 receptor (MC4R), G protein-coupled receptor (GPCR), экспрессирующийся в гипоталамусе, играет важную роль в контроле аппетита и гомеостазе энергии (Huszar et al., 1997; Balthasar et al., 2005). MC4R, экспрессирующийся в glutamatergic Sim1 нейронах в PVN как необходим, так и достаточен для регуляции веса тела (Balthasar et al., 2005; Xu et al., 2013; Shah et al., 2014). Гаплонедостаточность по MC4R вызывает массивное ожирение у людей, тогда как гапло-инактивация MC4R у мышей приводит к ненасытному ожирению (Huszar et al., 1997; Vaisse et al., 2000; Farooqi et al., 2003). Matharu et al. использовали CRISPRa/dCas9 систему, чтобы восстановить экспрессию гаплонедостаточных генов, Sim1 и MC4R, до физиологического уровня у модельных мышей (Matharu et al., 2019). Отличающееся от обычного геномного редактирования для коррекции вызывающих болезни мутаций ДНК, в данном случае Matharu слили VP64, универсальный умеренный активатор транскрипции, с nuclease-deficient Cas9 (dCas9), чтобы целенаправленно воздействовать на промотор или энхансер, некодирующего геномного региона с оставшимся функциональным Sim1 геном, чтобы активировать экспрессию эндогенного гена. Чтобы проверить специфичность и эффективность этого подхода, Matharu получили трансгенных животных, несущих spdCas9-VP64, также как и rAAV обеспечиваемую доставку pCMV-spdCas9-VP64 непосредственно в PVN гипоталамуса. В обоих случаях восстанавливалась экспрессия гипоталамического Sim1 до нормальных уровней и тем самым устранялся синдром ожирения. Более того, анализ транскриптома гипоталамуса и ChIP-seq показал, что ни один из соседних с Sim1 генов на участке в 500-kb не был дифференциально экспрессирован, что свидетельствует о высокой специфичности этого подхода. Инъекции базирующихся на rAAV CRISPRa в гипоталамус гаплонедостаточных по MC4R мышей сходным образом устраняли фенотип избыточного веса, демонстрируя силу этого подхода. Это сообщение предоставляет нам первое in vivo использование системы CRISPR-Cas9 для устранения ожирения, обусловленного гаплонедостаточностью гена, возникающей в ЦНС.
Более того, исследование также предоставило нам новую стратегию лечения ожирения: CRISPRa для индукции гаплонедостаточности гена или CRISPRi для лечения болезни, вызываемой патогенетической избыточной экспрессией гена. Помимо SIM1 и MC4R, гаплонедостаточность proprotein convertase 1 (PCSK1), melanocortin 2 receptor accessory protein 2 (MRAP2) в головном мозге , iroquois homeobox 3 (IRX3) в жировой ткани или uncoupling protein 3 (UCP3) в митохондриях, также отвечают за ожирение у людей (Argyropoulos et al., 1998; Creemers et al., 2012; Asai et al., 2013; Zou et al., 2017). В то же время избыточная экспрессия FTO, 11 β-hydroxysteroid dehydrogenase-1 (11 β-HSD-1), отцовски экспрессируемого Mest (Peg1) в жировой ткани также может вызывать ожирение (Kannisto et al., 2004; Rankinen et al., 2006; Church et al., 2010). Эти исследования демонстрируют, что нарушения экспрессии этих генов также может устранять ожирение с использованием техники CRISPRi . Эти результаты представленные Matharu et al. подтверждают, что rAAV-обеспечиваемая доставка CRISPRa или CRISPRi, нацеленных на цис-регуляторные элементы генов, вызывающих ожирение, могут оказаться наилучшим подходом, поскольку он регулирует только экспрессию генов, не влияя на кодирующий регион, тем самым расширяется возможность для выбора мишени и избегания потенциальных мутаций вне мишени. В то время как идентификация и тщательная характеристика промоторов и энхансеров этих генов, вызывающих ожирение, должны быть главной проблемой, которую мы должны решить. Тем не менее, строгая этическая аргументация и мониторинг контроля имеют важное значение при проведении этой терапевтической стратегии у пациентов в ближайшем будущем.
