Техника CRISPR-Cas9 редактирования генов инкорпорирует каталитически деактивированную Cas9 (dCas9), слитую с белковым доменом, чтобы регулировать транскрипцию (Boettcher and McManus, 2015). Single guiding RNAs (sgRNA) целенаправленно воздействует с помощью dCas9 слитую с белками на специфические сегменты ДНК, такие как промоторы и энхансеры, это может приводить к активации (CRISPRa) или интерференции(CRISPRi) транскрипции в зависимости от свойства слитой ДНК кассеты. Rosa26 knock-in конструкция, сцепленная с системой Cre/loxP рекомбинации приводит к обусловленной избыточной экспрессии экзогенных генов в специфических тканях и также делает возможной сайт-специфическую интеграцию очень больших фрагментов (20-30 kb) (Hohenstein et al., 2008). Однако, эта система в целом нуждается в сложных knock-in операциях и multiple-crossing схемах, чтобы генерировать желаемые линии мышей, это приводит к сильному воздействию на эффективность системы. Базирующийся на Bacterial artificial chromosome (BAC) случайный трансгеноз в качестве альтернативного подхода по избыточной экспрессии специфического гена у животных моделей, могут быть получены быстро и эффективно трансгенные мыши основательницы. Однако, благодаря интеграции кассеты генов в случайном локусе, эта техника может вызывать нежелательные мутации и гены, с расположенными на флангах (flanking) инсерционными сайтами, который могут замалчиваться непредсказуемо (Shinohara et al., 2007). К счастью, система CRISPRa/dCas9 обладает потенциалом переступать эти барьеры. Многочисленные исследования продемонстрировали, что система CRISPRa чрезвычайно эффективна и легка в использовании для увеличение экспрессии генов или коррекции мутаций, вызывающих болезнь (Matharu et al., 2019; Pignani et al., 2019; Savell et al., 2019). Мутагенез вне мишени первоначально мешал терапевтическому использованию системы CRISPRa (Akcakaya et al., 2018). Др. вопрос, насколько эффективна доставка CRISPR-Cas9 в эти ткани или типы клеток, которые устойчивы к инфекции или трансфекции (Ma et al., 2014). К счастью, recombinant adeno-associated virus (rAAV) оказался наиболее пригодным устройством для доставки CRISPR-Cas9 благодаря его высокой эффективности, длительной экспрессии трансгена, меньшим потенциальным иммуногенным эффектом и отсутствием интеграции со случайными геномными инсерциями. (Liu et al., 2017).

Используемый в качестве эффективного геномного редактора, CRISPR-Cas9 широко применяется при биомедицинском преобразовании соматических клеток (Liang et al., 2015; Cohen, 2018),и также является многообещающим инструментом для лечения генетических нарушений в модельных системах от клеток in vitro до животных in vivo. Напр.. восстановления экспрессии белка dystrophin в сердечных и скелетных мышцах для коррекции мутаций, ответственных за Duchenne muscular dystrophy (DMD) (Long et al., 2016; Nelson et al., 2016; Tabebordbar et al., 2016; Amoasii et al., 2018). В этом случае сердечно-сосудистой болезни CRISPR редактирование генов может существенно снизить в сыворотке уровни PCSK9 и общий холестерол путем целенаправленного воздействия на ген PCSK9 в гепатоцитах in vitro (Ding et al., 2014; Wang et al., 2016; Rossidis et al., 2018; Wang et al., 2018). Кроме того, in vitro CRISPR-Cas9 редактирование генов предупреждает наследственную дегенерацию сетчатки путем избирательного устранения мутации S334ter у модельных крыс с аутосомно доминантным retinitis pigmentosa (Bakondi et al., 2016). Более того, система редактирования CRISPR-Cas9 используется для лечения приобретенныъ болезней, таких как рак, HIV и hepatitis B (Seeger and Sohn, 2014; Soriano, 2017; Xiong et al., 2019). Несмотря на это, успешная коррекция мутаций, ассоциированных с ожирением, in vivo посредством CRISPR-Cas9 пока не разработана.

Single minded family basic helix-loop-helix transcriptional factor 1 (SIM1), фактор, важный дифференцировки и функции нейронов в paraventricular nuclei (PVN) в гипоталамусе играет центральную роль в потреблении пищи и энергетическом гомеостазе. Гаплонедостаточность Sim1, когда одна из двух копий гена функционально потеряна, то развивается ожирение с ранним началом, увеличенным линейным ростом, гиперфагией, гиперинсулинемией и гиперлептиемией, при отсутствии изменений энергетических затрат (Michaud et al., 2001). Избыточная экспрессия Sim1 устранеяет вызванное диетой ожирение благодаря снижению потребления пищи (Kublaoui et al., 2006). Melanocortin-4 receptor (MC4R), G protein-coupled receptor (GPCR), экспрессирующихся в гипоталамусе, играет важную роль в контроле аппетита и энергетическом гомеостазе (Huszar et al., 1997; Balthasar et al., 2005). MC4R экспрессируется в глютаматергических нейронах Sim1 в PVN , он необходим и достаточен для регуляции веса тела (Balthasar et al., 2005; Xu et al., 2013; Shah et al., 2014). Гаплонедостаточность MC4R вызывает массивное ожирение у людей, тогда как гапло-инактивация MC4R у мышей приводит к гиперфагическому ожирению (Huszar et al., 1997; Vaisse et al., 2000; Farooqi et al., 2003). Недавно Matharu et al. использовали систему CRISPRa/dCas9 для восстановления экспрессии гаплонедостаточных генов, Sim1 и MC4R, до физиологического уровня на мышиных моделях (Matharu et al., 2019). В отличие от канонического редактирования генома для исправления болезней, вызываемых мутациями ДНК, Matharu сливали VP64, универсальный умеренный активатор транскрипции с дефицитной по нуклеазе Cas9 (dCas9) чтобы целенаправленно воздействовать на промотор или энхансер, некодирующий геномный регион оставшегося функциональным гена Sim1 , чтобы активировать экспрессию эндогенного гена. Чтобы проверить специфичность и эффективность подхода, Matharu использовали трансгенных животных, несущих spdCas9-VP64, также как и rAAV обеспечиваемую доставку pCMV-spdCas9-VP64 непосредственно в PVN гипоталамуса. В обоих случаях экспрессия в гипоталамусе Sim1 восстанавливалась до нормальных уровней и тем самым устранялся синдром ожирения. Более того, анализ транскриптома гипоталамуса и ChIP-seq показали, что ни один из соседних с Sim1 генов внутри промежутка в 500-kb не экспрессировался дифференциально, демонстрируя высокую специфичность подхода. Инъекции, базирующиеся на rAAV CRISPRa в гипоталамус гаплонедостаточных по MC4R мышей сходным образом устранял фенотип избыточности веса, демонстрируя силу этого подхода.

Более того, это исследование также предоставило нам новую стратегию лечения ожирения, вызываемого аномальной экспрессией гена: CRISPRa для гаплонедостаточных генов или CRISPRi для лечения болезней, вызываемых патологической избыточной экспрессией генов. Помимо SIM1 и MC4R, гаплонедостаточность proprotein convertase 1 (PCSK1), melanocortin 2 receptor accessory protein 2 (MRAP2) в головном мозге, iroquois homeobox 3 (IRX3) в жире или uncoupling protein 3 (UCP3) в митохондриях также ответственны за ожирение у людей (Argyropoulos et al., 1998; Creemers et al., 2012; Asai et al., 2013; Zou et al., 2017). Кроме того, избыточная экспрессия FTO, 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-1 (11β-HSD-1), экспрессируемого отцами Mest (Peg1) в жировой ткани могут вызывать ожирение (Kannisto et al., 2004; Rankinen et al., 2006; Church et al., 2010). Эти исследования демонстрируют, что нарушение экспрессии этих генов могут также быть устранены при использовании техники CRISPRi. Эти результаты, представленные Matharu et al. подтверждают, что rAAV-обеспечиваемая доставка CRISPRa или CRISPRi целенаправленно воздействует на цис-регуляторные элементы генов, вызывающих ожирение, могут быть наилучшим способом, поскольку этот подход регулирует лишь экспрессию генов, не модифицируя кодирующий регион, тем самым расширяются опции по выбору мишени и устранению потенциальных мутаций вне мишени. В таком случае идентификация и тщательная характеристика промоторов и энхансеров генов, вызывающих ожирение станут первоочередными.