Стволовые клетки по их способности регенерировать многие дифференцированные типы клеток, тем самым поддерживаетсяя способность к само-репликации и само-обновлению. Они обнаруживают in vivo разные источники и могут быть подразделены на три большие категории в соотв.: эмбриональные (ESCs), плодные (FSCs) и стволовые клетки взрослых (ASCs). Среди последних hematopoietic stem cells (HSCs) и mesenchymal stem cells (MSCs), которые представляют наиболее используемые типы стволовых клеток.

ESCs происходят из внутренней клеточной массы бластоцистов человека, обладают потенциалом к само-обновлению и рассматриваюся как плюрипотентные: они сохраняют способность дифференцироваться в клетки и ткани трех основных зародышевых листков [2] и производят все ткани, обнаруживаемые в организме. Человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) считаются предпочтительным источником клеток для регенеративной медицины, чтобы репарировать аномалии тканей и органов, которые возникают в результате врожденных дефектов, болезней, возрастных и связанных со средой эффектов. Сходные характеристики ассоциированы с induced pluripotent stem cells (iPSCs), хотя они генерируются in vitro за счет эктопической экспрессии эндогенных факторов плюрипотентности, которые эпигенетически трансформируют окончательно дифференцированные клетки в ESC-подобные клетки [3, 4].

FSCs, вторая категория стволовых клеток локализована в плодных тканях и эмбриональных хранилищах (annexes) и являются мультипотентными: они могут дифференцироваться в некоторые типы клеток, но не во все из трех основных зародышевых листков [5]. FSCs подразделяются на гематопоэтические (кровь, печень, костный мозг), мезенхимные (кровь, печень, костный мозг, легкие, почки и поджелудочная железа), эндотелиальные (костный мозг, плацента), эпителиальные (печень, поджелудочная железа pancreas) и нейральные стволовые клетки (нейроны, глия и олигодендроциты [6].

Третья категория, наз. ASCs или клетки предшественники представлена мультипотентными, располагающимися в ткани стволовыми клетками, обнаруживаемые в полностью развитой ткани. Они располагаются в нишах, в которых создаются специальные микроусловия для их репликации и само-обновления. Располагающиеся во многих тканях тела человека, дискретныце популяции ASCs генерируют клетки для замещения тех, что теряются в ходе нормальной репарации, болезни или повреждения. ASCs обнаруживаются в течение всей жизни организма и ,.skb идентифицированы в тканях, таких как пупочный канатик, плацента, костный мозг, мышцы головногй мозг, жировая ткань, кожа, кишечник и т.д. ASCs , как полагают, участвуют в репарации и регенерации ткани, в которой они находятся, помогая поддеривать гомеостаз ткани.

Стволовые клетки, такие как HSCs, MSCs и неральные стволовые клетки (NSCs) используются наиболее часто при кли нических испытаниях (www.clinicaltrials.gov) (Fig. 1a). HSCs существенны для генерации и гомеостаза кровеносной системы и дают все типы кровяных клеток, включая лимфоциты, эритроциты, моноциты, гранулоциты и тромбоциты [7]. В самом деле трансплантации HSC являются разрешенной терапией при различных злокачественных и не злокачественных болезнях крови у детей и взрослых. Первоначально разработанная как восстанавливающая терапия у пациентов с раком после высоких доз химиотерапии и радиации, а также для коррекции тяжелых дефицитов в гематопоэтической системе, она стала использоваться в качестве адаптисной иммунотерапии для злокачественных и аутоиммунных нарушений [8]. Человеческие MSCs являются мультипотентными стволовыми клетками со способностью дифференцироваться в мезодермальные клоны, такие как остеоциты, адипоциты и хондроциты, а также в некоторые эктодермальные (нейроциты) и энтодермальные клоны (гепатоциты) [9]. MSCs были выделены из разных тканей, включая костный мозг, жировую ткань, амниотическую жидкость, эндометрий, зубные ткани, пупочный канатик и Wharton's jelly [9]. MSCs обладают иммуномодуляторными свойствами и секретируют цитокины и иммунные рецепторы, которые регулируют микроусловия в ткани хозяине [10]. Мультиклональный потенциал, иммуномодуляция и секреция молекул делает MSCs эффективным инструментом при лечении хроничесаких болезней. Известно несколько клинических испытаний (for a review see [11]). NSCs являются эктодермальными клетками предшественниками, которые могут дифференцироваться в подтипы нервных клеток, такие как нейроны, астроциты или олигодендроциты. Производные нервных стволовых клеток используются в ряде клинических испытаний, включая болезни ALS и Parkinson's [12, 13, 14] о текущих клинических испытаниях см (Fig. 1a).

Fig. 1 Human stem cell-based clinical studies conducted worldwide (Status: October 2018; www.clinicaltrials.gov). a Interventional clinical trials (Phase I or phase I/II) applying adult stem cell types (mesenchymal stem cells, MSCs; hematopoietic stem cells, HSCs; neuronal stem cells, NSCs) or their differentiated derivatives, or embryonic stem cell (ESC)-or induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived differentiated cells. Numbers in brackets indicate the number of individual trials based on the respective stem cell type. b Interventional clinical trials and observational studies that are currently ongoing or in preparation use therapeutic derivatives of ESCs (blue lettering) or iPSCs (green lettering) to treat ophthalmic, urological, blood, cardiac and genital diseases, neurological disorders and cancers/neoplasms. Numbers in brackets represent the number of clinical trials and/or observational studies initiated to treat the respective disease or disorder

В противовес MSCs и др.типам ткане-специфических стволовых клеток, плюрипотентные стволовые клетки (PSCs) происходят или из преимплантационных эмбрионов человека , лдавая hESCs [2, 15], или из соматических клеток, которые репрограммированы в примитивное плюрипотентное состояние (hiPSCs). PSCs являются бессмертными сильно размножающимися в культуре in vitro и могут быть дифференцированы в почти любой тип клеток тела. Клеточные продукты, происходящие из hESCs используютс в клинических испытаниях при сердечных и нейрологических нарушениях, при этом некоторые из подходов разрешены для клинических испытаний (Fig. 1b) [12, 13, 14]. Первоначально hiPSCs были использованы для лечение клеток сетчатки, происходящих из окруженных бордюром hiPSCs при аллогенных подходах [18]. Кстати, 11 международных клинических испытаний и 25 экспериметальных исследований базируются на использовании iPSCs (Fig. 1). Однако, и несмотря на эти испытания, относительно мало известно о желательных долговременных эффектах таких подходов.

Многообещающим в лечении болезней человека является использование дифференцированных клеток, происходящих из мультипотентных ASCs и плюрипотентных стволовых клеток, таких как hESCs и hiPSCs, а также носители для лечения геномной нестабильности. Во-первых, культивирование мультипотентных и плюрипотентных стволовых клеток подвергает клетки селективному давлению, которое часто приводит к приобретению и проявлению геномных альтераций, варьированию в размерах в результате точковых мутаций, изменению числа копий небольших геномных элементов (напр., умножение повторяющихся последовательностей и подвижности ретроэлементов), к крупным хромосомным альтерациям, трисомии и моносомии [19, 20, 21]. Ранее было отмечено несколько факторов, вносящих различия в геномнуюи эпигеномную стабильность стволовых клеток, включая происхождение источника (эмбриональные или соматические клетки), используемые методы (прямое выделение или репрограммирование), и условия культивирования [22]. Большое внимание уделено геномным альтерациям, приобретаемым hESCs и hiPSCs, в пределах от точечных мутаций до трисомий целых хромосомs [23-30]. Сходным образом, человеческие ASCs, которые размножаются в культуре, также обнаруживают склонность к приобретению хромосомных аберраций [24]. Во-вторых, воздействие на многие болезни человека часто используют генетические манипуляции со стволовыми клетками перед их трансплантацией, что может позднее подвергать риску их геномную стабильность. В целом альтерации генома могут затрагивать качественные особенности, способность к дифференцировке и туморогенность стволовых клеток и это необходимо учитывать при базовых исследованиях и клинических испытаниях.

Здесь мы сконцентрируемся на одном специфическом источнике геномной нестабильности соотв. терапевтических стволовых клеток, который обычно игнорируется, а именно, на активности эндогенных non-Long Terminal Repeat (non-LTR)-ретротранспозонах и их значении для геномной целостности и для экспрессии хозяйских генов. Non-LTR ретротранспозоны выделяются по сравнению с большинством TEs в нашем геноме, небольшая фракция из этой группы TEs сегодня активна и мобилизуется в популяции человека [31, 32]. Мы рассмотрим влияние эндогенных TEs в плюрипотентных и взрослых стволовых клетках, обсудим новые роли TEs в регуляции плюрипотентности и опишем защитные системы, противодействующие активности TE в стволовых клетках. Более того, мы рассмотрим использование ДНК-транспозонов для генетического инженеринга стволовых клеток человека. Мы полагаем, что степень активности потенциально мутагенных TEs в плюрипотентных клетках необходимо выявлять и вообще использовать в качестве дополнительного контроля качества в будущем.

Более 45% генома человека состоит из происхотдящих из TE последовательностей, но только специфический субнабор таких TEs, которые принадлежат к группе ретротранспозонов, сегодня распространяется в геноме человека. Ретротранспозоны распространяются с помощью механизма 'copy-and-paste', который использует обратную транскрипцию и инсерцию промежуточных РНК в новое место в геноме. Они распределяются на две разные группы: LTR-ретротранспозоны, которые включают human endogenous retroviruses (HERVs) и фланкируются длинными терминальными повторами, обладающими транскрипционными регуляторными доменами , и non-LTR ретротранспозоны, которые лишены LTRs (Fig. 2). Среди 31 подсемейства человеческих эндогенных ретровирусов покрывающих 8% генома человека, способные к репликации HERVs не были описаны, хотя из существование не может быть исключено [33, 34]. Единственные TEs, которые на сегодня безусловно мобилизуются в геноме человека, являются группой non-LTR ретротранспозонов (Fig. 2). Они представлены двумя основными типами элементов: i) автономные Long interspersed class 1 elements (LINE-1s or L1s), и ii) не автономные short interspersed elements (SINEs), такие как Alu и SVA (SINE-VNTR [variable number of tandem repeats]-Alu элементы) элементы. У человека > 500000 L1 копий занимают ~ 17% гаплоидного генома [35]. Функцинальные, полной длины L1 длиной в 6 kbи инициирующие транскрипцию используют внутренний чувствительный промотор, расположенный внутри его 5' untranslated region (UTR) [36, 37, 38] (Fig. 2). У функциональных L1s смысловой промотор управляет экспрессией двух белков, наз. ORF1p и ORF2p, которые катализируют L1 ретротранспозицию в цис-положении [39]. ORF1p является 40 kDa РНК-связывающим белком с активностью nucleic acid шапероном, тогда как ORF2p является белком в 150 kDa, который содержит reverse transcriptase (RT) и обладает эндонуклеазной активностью endonuclease activities (rev. [32]). Оба белка обязательны для ретротранспозиции [40] с помощью процесса, наз. Target-Primed Reverse Transcription (TPRT; [41, 42]). Консервативный антисмысловой промотор в L1 5'UTR [36, 37] управляет экспрессией транс-действующего полипептида ORF0, который может стимулировать мобилизацию L1 [43]. Хотя активность RT человеческого L1, как было установлено, чрезвычайно processive [44], большинство de novo L1 инсерций оказываются неподвижными из-за 5' укорочения. Эти укорочения вместе с внутренними мутациями накапливаются со временем, давая в результате лишь 80-100 компетентных к ретротранспозиции или функциональных L1s на индивидуальный геном человека [45-47]. Из них менее 10 мобилизуются эффективно тестировании in vitro: они называются 'hot' L1s и ответственны за оснровную часть ретротранспозиций в популяциях людей [45-50]. Огромное большинство горячих L1s относится к самому молодому подсемейству, наз. L1Hs (for Homo sapiens-specific, известны также как L1-Ta, for transcribed-active) [45, 47, 51]. Подсемейства L1 могут различаться по нуклеотидным заменам, которые являются общими для всех членов специфического подсемейства. 5 подсемейств, как полагают, умножены в гоминоидных приматов в течение последних 25 лет (myrs), названы с L1PA1 по L1PA5. Функциональные L1s также ответственны за мобилизацию Alu и SVA элементов, которые лишены способности кодирования белка [52-55]. В самом деле, активность, L1 в транс-положении может действоввать с низкой частотой на любой клеточной полиаденилированной мРНК, приводя к генерации преобразованных псевдогенов [56, 57]. Члены специфического для приматов семейства Alu длиной приблизительно в 300-bp, обладают димерной структурой и транскрибируются с помощью РНК полимеразы III (rev.[58, 59]) (Fig. 2). Семейство Alu элементов с более 1 миллиона копий, является наиболее многочисленным TE в нашем геноме [35], и представляет на сегодня наиболее активную группу ретротранспозонов у человека с ~ 1 тысячей компетентных к мобилизации копий на геном. SVAs являются специфичными для гоминоидов составнрыми не кодирующими ретроэлементами со средней длиной ~2 kb, и представляющих самое молодое семействло активных человеческих TEs (Fig. 2). Имеется приблизительно 2700 SVA копий на геном человека, большинство из которых имеют полную длину и приблизительно 20-50 из них могут быть активными [60- 67].

Fig. 2 Retrotransposons in the human genome. Currently, only LINE-1 (L1), Alu and SVA elements are verifiably still mobilized in humans. A full length HERV-K provirus is ~?9.5?kb long, codes for group-specific antigen (Gag), protease (Pro), polymerase (Pol) and envelope (Env) proteins and is flanked by ~?1-kb long terminal repeats (LTRs) with the 5'LTR including the HERV-K promoter. A functional full length L1 element is ~?6?kb in length, harbours three open reading frames (ORF0, ORF1 and ORF2) at which ORF1 and ORF2 are separated by a 63-bp noncoding spacer region. The 5? untranslated region (5'UTR) harbours both sense and antisense promoter. Alu elements comprise ~?280-300?bp, are composed of two 7SL-RNA derived monomers separated by an A-rich connector (A5TACA6), contain an internal A and B box promoter, and end in a poly A tail (An). SVA elements are ~?0.7-4?kb long, consist of a 5? hexamer repeat that can be variable in length ((CCCTCT)n), two Alu fragments in antisense orientation, a GC-rich variable number of tandem repeats (VNTR) region, a SINE-R sequence derived from an HERV-K10 element and a poly A tail following a polyadenylation signal. The length of an intact SVA can vary depending on the number of repeats present in the hexamer and VNTR domains. L1, Alu and SVA insertions are characterized by the hallmarks of L1-mediated retrotransposition such as flanking variable target site duplications (TSDs), polyA tails at their 3' ends (An) and insertion at the consensus target sequence 5?-TTTT/AA-3?. 3'UTR, 3' untranslated region /

Итак, перечисленные выше компетенитные к мобилизации non-LTR ретротранспозоны могут в целом объяснить тысячи соматический инсерций [68]. Было подсчитано, что свыше 5% новорожденных обладают новыми событиями ретротранспозии и более 120 известных, вызывающих болезни человека инсерций L1s, Alus и SVAs было идентифицировано [69-73]. L1-обусловленные инсерции спорадически вызывают большое коли чество генетических нарушений у человека, включая гемофилию A (L1), кистозный фиброз (Alu) [74] и X-linked dystonia-parkinsonism (SVA) [71]. Альтерации экспрессии TEs и оживление геномных L1 последовательностей также, по-видимому, являются признаками рака и могут быть ответственны за управление мутациями при туморогенезе [75, 76]. В самом деле, случайная мобилизация L1 в нашем геноме подрозумевает, что в действуительности любое нарушение может быть сгенерировано с помощью мутагенной активности non-LTR ретротранспозонов, а L1-обусловленные события ретротранспозиции могут возникать приблизительно 1 на каждые 250 патогенных мутаций у человека [77].

При экспрессии TEs могут влиять на онтогенетические процессы или путем кодируемых ими генных продуктов, которые могут влиять на фенотип и/или функцию клеток хозяина или посредством их геномных de novo инсерций, которые могут приводить к генетическим изменениям в геноме хозяина. L1-обьусловленные события ретротранспозиции могут быть ассоциированы с индукцией локальной геномной нестабильности, включая делеции ДНК в месте инсерции, 3'- или 5'-трансдукций и не аллельной гомологичной рекомбинации (rev. [32, 78]). Кроме того, новые инсерции ретротранспозонов в гены могут дейстововать как инсерционные мутагены, изменяя экспрессию гена и мешая функции генов хозяина [79].

Хотя меньше, чем 1 из 10,000 TEs всё ещё способны к мобилизации [71], намного более значительная пропорция может влиять на экспрессию генов в цис-положении и транс-положении (rev. [80]). Это из-за того, что TEs, такие как ERVs, L1 и SVA элементы, содержат сайты, связывающие транскрипционные факторы, которые способствуют транскрипции с помощью RNA polymerase II или в случае Alu элементов с помощью RNA polymerase III. Следовательно, присутсьтвующие промоторы и из новых TE(s), которые интегрируются в или вблизи генов хозяина, могут изменять экспрессию генов и даже приводить к возникновению новых транскриптов, которые включают в себя часть кодирующего региона. Напр., из-за того, что транскрипты некоторых генов хозяина в iPSCs происходят с соседнего L1 антисмыслового промотора, наиболее многочисленной экспрессирующейся изоформы, содержащей последовательности L1 ORF0, тогда как для др. генов эти изоформы вносят лишь незначительный вклад в массы транскриптов. Интерсно, что уровни транскриптов ORF0 драматически снижаются в источнике фибробластов по сравнению с происходящими из них iPSCs [43]. De novo генетические инсерции могут также индуцировать преждевременное окончание транскрипции путем внесения происходящих из TE сигналов полиаденилирования [81], и спорадически приводят к exonization TEs. Exonized TEs могут распространяться в транскриптоме протеоме млекопитающих, но могут быть также использованы для тонкой регуляции генов [82]. В самом деле, нуклеотидные последовательности некоторых классов TEs, как было установлено, вставляются в РНК млекопитающих RNAs [82, 83, 84], в результате возникает возможность, что они затрагивают регуляцию и функцию генов, обеспечивая или сталкиваясь с регуляторными элементами в этих RNAs. В результате снижается в генах хозяина экспрессия РНК, обусловленная неадекватной элонгацией транскриптов после вставки L1 в интрон транскрибируемого гена, это первоначально было приписано изобилию A/T в последовательностях L1 [85], а недавно было подтверждено, что ослабление транскрипции генов хозяина может быть следствием эпигенетического замалчивания, обеспечиваемого human silencing hub (HUSH) комплексом [86]. TE инсерции также могут вносить происходящие из TE сплайс-акцепторы ил донорские сайты, которые меняют сплайсинг и тем самым генерируют нефункциональные или nonsense транскрипты [87] или могут быть включены в мРНК и тем самым вызывать сдвиг рамки считывания ил кодоны преждевременного окончания. Было также показано, что после сплайсинга L1 мРНК также используются в качестве матриц, генерирующих spliced integrated retrotransposed elements (SpIREs), которые лишены части 5'UTR и поэтому лишены некоторых регуляторных последовательностей [88]. L1-кодируемые белки могут спорадически генерировать преобразованные псевдогены [39, 56], и тем самым влиять на транскриптом и протеом стволовых клеток. Наконец, происходящая ретротранспозиция L1 сама по себе может копировать регуляторные последовательности, такие как регионы промоторов и энхансеров и/или белок-кодирующие регионы и вносить их в новые места генома хозяина с помощью механизма, наз. "exon shuffling" [89]. Перетасовывание экзонов происходит, когда L1 вставляет присутствующие внутри гена остатки, L1 транскрипция обходит прирожденный слабый L1 сигнал полиаденилирования и транскрибирует нижестоящие экзоны, генерируя химерные РНК, которые могут затем ретротранспозироваться в новые места генома. Подсчитано, что ~ 15-20% членов подсемейства L1Ta в геноме человека сводержат 3'-трансдуцированные последовательности. Такие обеспечиваемые L1 3' переносы касаются более 1% генома человека [90, 91], и этот процесс, по-видимому, увеличивает репертуар генома человека. Итак, имеются множество способов, с помощью которых TE инсерции могут влиять на функционирование и регуляцию генома человека.

Первичной средой для эволюционной борьбы между TEs и геномом хозяина являются плюрипотентные клетки ранних эмбрионогв млекопитающих и зародышевые клетки.

Чтобы гарантировать успешность эволюции, TEs бдолжны мобилизоваться в зародышевых клетках и/или во время раннго развития, до выделения зародышевой линии, чтобы гарантировать передачу новых ретротранспозонов следующему поколению. Геномное эпигенетическое подключение у ранних эмбрионов млекопитающих характеризуетсяы глабальными деметилированием ДНК, необходимым, чтобы активировать программу эмбрионрального развития. Такой 'epigenomic reset' , как полагают, предоставляет временной промежуток для возможности мобилизации ретротранспозонов и создания наследуемых инсерций [92], поскольку экспрессия L1 также контролируется с помощью метилирования ДНК [93]. Соотв., предыдущие исследования показали, что i) L1 мРНК присутствуют у людей в незрелых диплоидных ооцитах от доноров, передаваемых во время оплодтворения in vitro [94], ii) как L1-кодируемые белки, так и ORF1p и ORF2p, экспрессируются в пре-сперматогониях семенников плодов и в зародышевых клетках семенников взрослых [95], и iii) hESCs избыточно экспрессируют комбинацию потенциально функциональных полной длины L1 и стержневые Alu элементы, также как и не функциональные L1 и Alu РНК (Fig. 3) [79, 96-100]. Наблюдаемые уровни экспрессии L1 в таких плюрипотентных стволовых клетках обратным образом коррелируют с их низкими уровнями глобального метилирования ДНК и с их уровнями метилирования L1 промоторов [97, 101, 102]. Известно, что только специфический субнабор L1 ретротранспозонов, скорее всего, под комбинированным влиянием активаторов или репрессоров и локальных ограничений хроматина, активируется в каждый из данных периодов раннего эмбриогенеза [67, 96, 103, 104]. Поскольку экспрессия членов самых молодых клонов L1, L1Hs и L1PA2, является наивысшей в hESCs, то экспрессия субнабора из L1 клонов, преимущественно L1PA3, L1PA4, L1PA5 и L1PA6, которые, как полагают, проникли в родоначальный геном между 26.8 и 7.6 миллионами лет тому назад и теперь редуцированы [98]. Т. о., эти данные демонстрируют, что РНК из активных и "hot" L1 s экспрессируются в hESCs и hiPSCs. Используя метод преобразованных L1 ретротранспозиций, в качестве репортеров в культивируемых клетках [40], быцло продемонстрировано, что клеточное окружение и мышиные ESCs поддерживают L1 ретротранспозиции (Fig. 3), и что L1 de novo инсерции в культивируемые hESCs могут происходить в гены и приводить к небольшим делециям геномной ДНК в сайтах мишенях [97, 105, 106]. В соответствии с этими данными было продемонстрировано, что факторы хозяина, существенные для ретротранспозиции функциональных L1 мРНК, присутствуют в hESCs, было доказано, что эндогенные AluYa5 элементы мобилизуются в транс-положении в культивируемых hiPSCs [79].

Fig. 3 Schematic of relative endogenous L1 expression levels and engineered retrotransposition frequencies in human ESCs and adult stem cells derived from mesoderm and ectoderm. Relative L1 mRNA and L1 ORF1p expression levels, and relative engineered L1 retrotransposition frequencies supported by the respective cell type are illustrated: ++++, very high; +++, high; ++, moderate; +/?, barely detectable and therefore very low. HSC, Hematopoietic Stem Cells; MSC, Mesenchymal Stem Cells; ESC, Embryonic Stem Cells; NPC, Neural Progenitor Cells; KER, Human Foreskin Keratinocytes

Изучение трансгенных мышиных моделей позволило исследовать ретротранспозиции преобразованных L1 in vivo и недавно секвенировать мышиную родословную, подтвердив, что большинство наследуемых de novo событий ретротранспозиции у мышей происходит у преимплантационных эмбрионров и указывает, что эмбриональные клетки, скорее всего, естественной средой обитания для L1-обеспечиваемх ретиротранспозиций [107-113]). Очевидно, что такие мобилизации L1 в плюрипотентных клетках преимплантационных эмбрионов могут приводить к новым инсерциям, делая их мозаичными по соматическим и зародышевым клеткам взрослых мышей. Хотя известно, что уровни транскриптов L1 достигают пика после оплодотворения на ст. 2 клеток и снижаются с 2- по 8-клеточную стадии у мышей [114], остается неясным, в какую временную точку после оплодотворения инициируются ретротранспозиции L1. Эндогенные L1 элементы, как было установлено, активны у мышейв ранних примордиальных зародышевых клетках, перед началом действия пути PIWI/piRNA защиты от ретротранспозонов, активируемого эмбриональных гонадах самцов [113, 115].

Напротив, сегодня известно довольно мало об экспрессии TE и времени ретротранспозиций у человека. Напр., однозначно показано, что мобилизация эндогенных L1 mobilization может происходить рано в эмбриогенезе человек van den Hurk с колл. : они охарактеризовали инсерции мутагенных L1 при choroideremia, редком рецессивном X-сцепленным заболеванием глаз, у затронутых пациентов мужчин, чьи матери были мозаиками по соматическим или зародышевым патогенным L1 инсерциям [116]. Благодаря 3' трансдукции мутагенной L1 инсерции, авт. оказались способны идентифицировать специфический донорский L1 элемент и верифицировать, что он является способным к ретротранспозиции [116, 117]. Итак, данные строго подтверждают, что у людей новые наследуемые L1 и Alu инсерции могут, скорее всего, накапливаться во время раннего эмбриогенеза и до некоторой степени в зародышевых клетках [97, 107, 110]. События ретротранспозиций, обусловленные L1, как было установлено, возникают минимум в 1 из 20 мейозов для Alu, 1 из 20 -200 мейозов для L1 и 1 из 900 мейозов для SVA [118].

Совсем недавно исследования на мышах предоставили доказательства, что наблюдаемая активация транскрипции L1 может играть роль в мышиных ESCs и у пре-имплантационных эмбрионов. Активация транскрипции L1 после оплодотворения регулирует глобальную доступность хроматина в начале развития и поэтому может быть важной для нормального эмбрионального развития [119]. Также L1 РНК, по-видимому, действует как ядерный каркас, чтобы репрессировать программу транскрипции, специфическую для 2-клеточных эмбрионов и , следовательно, L1 транскрипт может быть необходим для выхода из 2-клеточной стадии [120]. Эти данные подтверждают, что L1-кодируемые РНК и белки выполняют дополнительные роли в эмбриональном развитии. Эти находки кажутся парадоксальными, т.к. несмотря на мутагенный потенциал L1 во время эмбриогенеза, они демонстрируют, что активность L1 может быть необходима для собственно эмбрионального развития и даже для пощддержания качественных особенностей ESC.

Мышиные ESCs и iPSCs , как полагают, представляют собой naïve состояние плюрипотентности, соответ. внутренней клеточной массе, тогда как hESCs/iPSCs соответствует более продвинутому или 'primed', состояни плюрипотентности, обнаруживаемому в эпибласте после имплантации [121]. В самом деле, было заманчивым определить naïve состояние плюрипотентности в hESCs, особенно в свете увеличения количества протоколов для получения предполагаемых naïve клеток человека [122, 123]. Предполагаемые naïve культивируемые клетки человека были изучены в связи с их похожестью на плюрипотентные клетки человека in vivo. Педложены три сравнительных параметра для оценки naïve состояния плюрипотентных стволовых клеток человека: (1) профиль экспрессии TEs базируясь на данных RNA-seq одиночных клеток [124], (2) ландшафт метилирования ДНК в ходе преимплантационного развития [125], и (3) статус инактивации хромосомы X женских ESCs [126, 127]. Всестороннее рассмотрение "transposcriptome" позволило разработать более чувствительное измерение соответствия между плюрипотентными стволовыми клетками и ранними эмбрионами человека, по сравнению с получением профиля экспрессии генов [128]. Создание уникальной модельной системы для выявления механизмов раннего развития человека, naïve hESCs предоставляют выдающуюся клеточную модель для выявления функции мобильных элементов, которые оказываются активированными во время раннего развития человека [128].

Человеческие iPSCs сегодня успешно используются для моделирования болезней, изучения клеточного развития и функциии, для in vitro скрининга лекарств кандидатов для здоровых и больных клеток; т.о., клеточные продукты, происходящие из hiPSCs, обнадеживают в отношении заместительной, регенеративной, аутологичной и аллогенной клеточной терапии. В отличие от hESCs, hiPSCs являются потенциальным источником аутологичных клеток, совместимых с иммунной системой, для трансплантаций [129]. hiPSCs также обходят этические вопросы, связанные с использованием эмбрионов человека, как источника hESCs [129]. Однако, генетические и эпигенетические аберрации, возникающие во время репрограммирования и экспансии in vitro [25-28, 79, 130] могут препятствовать использованию hiPSCs в регенеративной медицине, поскольку они могут затрагивать их качественные особенности и способность к дифференцировке, и могут увеличивать риск туморогенеза после имплантации [131]. Т.о., выявление полного спектрта аберрантных мутационных процессов, накапливающихся в hiPSCs, и их последствий, имеет первостепенное значение. Прямое следствие репрограммирования, обусловленое эпигеномными изменениями генома [130], это активация экспрессии полной длины L1 мРНК; в самом деле, уровни транскриптов L1-ORF1p и L1 RNA повышаются на 4 порядка величин по сравнению с соотв. родительскими клетками [79, 100, 132, 133]. Чтобы исследовать, действительно ли hiPSCs предоставляют микроокружение для L1 ретротранспозиции, Wissing и колл. использовали метод ретротранспозиции L1 in vitro, и выяви ли сходные уровни ретротранспозиции преобразованных L1, как и для hESCs [97, 100]. Эти данные демонстрируют, чтоклеточная среда как hESCs, так и hiPSCs содержит факторы хозяина, необходимые для ретротранспозиции L1. С целью прояснения, действительно ли активация транскрипции эндогенных L1 элементов в hiPSCs приводит к L1-обусловленной мобилизации, было осуществлено целенаправленное секвенирование культивируемых hESC и hiPSC линий, сопровождаемое PCR оценкой кандидатов de novo L1, Alu и SVA инсерций во многих лаб. [79]. В частности, секвенирование небольшого числа линий выявило происходящие ретротранспозиции L1, Alu и SVA в hiPSCs; Сходным образом, одна Alu de novo инсерция была обнаружена как возникшая во время культивирования hESC линии H9, которая была единственной линией hESC, проанали зированной в этом исследовании [79]. Т.о., эти исследования подтвердили, что hESCs и hiPSCs являются естественной средой обитания для L1-обеспечиваемой ретротранспозиии, это согласуется с наследуемой ретротранспозицией во время раннего эмбриогенеза человека. Однако, доступные на сегодня данные по мобилизации L1 в hiPSCs vs hESCs недостаточны, чтобы сделать заключение о частоте L1-обусловленных событиях ретротранспозиции в индивидуальных hESCs или hiPSCs. Удивительно, более раннее секвенирование всеого генома (WGS) мышиных ESCs не позволило выявить ретротранспозиции эндогенных L1 [134]. Отсутствие ретротранспозиций в mESCs в сравнении с hESCs/hiPSCs может отражать чрезвычайно различные свойства человеческих primed [79] и мышиных naïve [134] состояний плюрипотентности; или отражать ограничения использованных методов для детекции de novo событий ретротранспозиций, а именно, геномное секвенирование ДНК с [79] или без [134] ступени предварительного обогащения ретротранспозиций. В целом эти данные могутуказывать на то, что геном mESCs может быть более стабильным, чем у hESCs/hiPSCs, хотя некоторые исследования предоставили доказательства, демонстрирующие осуществление (и наследуемой) L1 ретротранспозиции во время раннего эмбриогенеза мыши [107, 113]. Т.о., также возможно, что культивируемые mESCs неспособны воспроизводить этот аспект биологии раннего эмбриогенеза мыши.

Интригующим аспектом исследований ретротранспозиций L1 в hESCs/hiPSCs является то, чтобольшинство оцененных инсерций являются полной длины. У hiPSCs, 57-66% от всех оцененных эндогенных и преобразованных L1 de novo событий ретротранспозиций были полной длины [79, 100]. В лдр. сообщении было найдено 7 потенциальных de novo L1 инсерций в двух линриях hiPSC, при использовании целенаправленного секвенирования L1, но не было произведено PCR-оценки или полной характеристики мест геномной интеграции для этих событий [133]. Успешность идентификации событий мобилизации L1 зависит от множественных факторов, таких как гетерогенность исследуемой популяции клеток и методологических факторов, таких как условуия культивирования стволовых клеток, популяционное узкое горло для культивируемых клеток, высокопроизводительное секвенирование, биоинформационные параметры и то, как оценивали кандидатов для L1 инсерций, всё это могло влиять на результаты. Напр., недавнее исследование WGS для 9 hiPSC линий [135] не выявило каких-либо de novo rинсерций ретротранспозонов и и лишь немногие мутации по сравнению с более ранними исследованиями [25, 26]. В то время как в ранних сообщениях hESCs оценивали для небольшого числа преобразованных, но не 5'-укороченных L1 инсерций [97], дополнительная характеристика в hESCs недавно выявила, что более 70% из них были полной длины (Cano and Garcia-Perez, personal communication). Находка, что 66-75% событий ретротранспозиции преобразованных L1 в hESCs и hiPSCs быцли полной длины находтся в резком контрасте с ситуацией в линиях раковых клеток, где только ~ 5% преобразованных L1 de novo инсерций были представлены элементами полной длины [136]. Поскольку это расхождение потребовало дополнительных исследований, то время предположить, что это обусловлено избыточной экспрессией L1, факторами хозяина, участвующими в 5' укорочении, могут быть titrated/sequestered в hESCs/hiPSCs, что делает возможной высокую скорость инсерций полной длины в этих клетках. Очевидно, что др. свойства de novo L1 событий инсерций не отличаются существенно у раковых клеток и hESCs/hiPSCs; Напр., ~ 50% всех оцененных событий ретротранспозиций L1 в обоих типах клеток происходит в интиронах генов хозяина [79, 100, 136]. Сходным образом, относительно трансформированных клеток интронные L1 инсерции в hiPSCs могут вмешиваться в транскрипцию затрагиваемых генов хозяина [79].

Несмотря на неизвестные аспекты биологии L1 в ESCs, имеющиеся данные показывают, что репрограммирование вызывает динамичную, но устойчивую дерепрессию эндогенных L1 s, и что они переживают реляксацию контроля генома со стороны хозяина в плюрипотентных стволовых клетках, получаемых из эмбриональных тканей [111, 128, 132, 137, 138]. Недавнее исследование по проверке транскрипционного контроля эндогенных ретроэлементов во время репрограммирования гематопоэтических стволовых клеток человека из крови пуповины и первичных гепатоцитов в hiPSCs, а последующее культивирование выявило заметную активацию транскрипции активных SVA_A и L1Hs ретротранспозонов, а также до этого неактивных HERV-K, HERV-H и HERV-W элементов [132]. Острое увеличение транскрипции L1 и SVA наблюдается в течение нескольких дней после трансдукции репрограммирующими векторами и обе РНК сохраняют высокий уровень экспрессии после культивирования hiPSCs [132]. Посколку существует назначительная гетерогенность в экспрессии L1 между протестированными линиями hESC, наблюдается существенная гетерогенность между клонами hiPSC [132]. Сравнение уровней экспрессии индивидуальных эндогенных ретроэлементов между hiPSC клонами, происходящими от одного донора и происходящих в ходе одного и того же эксперимента по репрограммировани выявляет существенные различия, заметные для HERV-H, HERV-K и L1Hs. Т.о., эти данные подтверждают, что эпигеномное репрограммирование генома может не происходить с однинаковой степенью вло всех репрограммированных клетках и что hESCs могут представлять собой более реалистическую модель для изучения ранних эмбриональных процесов человека. Было предположено, что транскрипционно активированные функциональные L1Hs элементы, чьи антисмысловые промоторы могут влиять на экспрессию соседних генов [139], сходный эффект обнаруживается во время или после репрограммирования hiPSCs [132]. Вмешательство цис- и транс-действующих транскрипционных регуляторных элементов предсуществующих или de novo TE инсерций с транскрипцией генов, близких к TE, может приводить к фенотипическим аномалиям, трудным для обнаружения с помощью обычных методов, таких как блокада дифференцировки определенных клонов, предрасположенность к онкогенным изменениям и аберрантное высвобождение биоактивных молекул, изменения иммуногенности или эктопическая активация связанных с болезнями генов в iPSCs или их потомстве [67, 132]. В hiPSCs, неустойчивая продукция транскриптов с внедрившихся TE, обычно замалчивается в ESCs, но отмечается вторичная активация соседних генов [67]. Этот феномен д. вносить вклад в неэффективность репрограммировани за счет стахастически актаивированных генов, затрагивающих путь плюрипотентности [140]. Нарушения транскрипции близких к TE генов может также досаждать iPSCs и их потомству в виде фенотипических аномалаий [141]. Эти находки свидетельствуют в пользу глубоких геномных, транскрипционных и эпигенетических состояний повторяющихся геномных iPSC клонов, которые используются для базовых исследований или клинического использования. В этих исследованиях bona fide установленные hESC линии могут предложить отличный пример для выявления вредных изменений в HiPSCs , которые могут ограничивать их использование. В самом деле, поскольку использование hESCs в регенеративной медицине четко ограничено, то hESCs становятся выдающимися контрольным показателем для становления клинически безопасных клеток, подобных плюрипотентным эмбриональнальным стволовым клеткам человека.

TEs являются прототипом "selfish DNA", чьей единственной целью является генерация множества копий самой себя. Поэтому было предположено, что большинство активности TE у млекопитающих может происходить только в клеточных нишах, которые передают генетическую информацию следующему поколению, поскольку это гарантирует эволюционные преимущества TEs. Хотя пионерская работа Barbara McClintock, открывшая TEs в соматических тканях зерна [142], лишила активности TE в соматических тканях млекопитающих и это длительное время было догмой. Однако, эта "dogma" недавно была оспорена выявлением активности TE в здоровых соматических клетках млекопитающих, в особенности в стволовых клетках взрослых в головном мозге. Первое доказательство существования мобильности L1 s в стволовых клетоках взрослых было получено в клетках нервных предшественников (NPCs), происходящих из нейральных стволовых клеток гиппокампа крыс [112]. Было продемонстрировано, что NPCs поддерживают повышенные уровни ретротранспозиции, используя преобразованные L1 репортерные элементы человека. Использя модельных трансгенных мышей было продемонстрировано, что L1 s генерируют геномный соматический мозаицизм во время развития головного мозга и у взрослых мышей. Соотв. NPCs человека, выделенные из головного мозга плодов или происходящие из hESCs, как было установлено, экспрессируют умеренные уровни РНК L1 и L1-ORF1p (Fig. 3), и достоверно подтвержденные повышенные уровни преобразованных L1 ретротранспозиций in vitro [143]. Эти и предыдущие исследования на мышах (i.e., [112]) позволили сделать существенный прорыв в области TE, т.к. было продемонстрировано впервые, что количество эндогенных L1 копий увеличивается в некоторых регионах головного мозга человека (включая гиппокамп) по сравнению с др. соматическими тканями человека [143, 144]. Недавно, использование adenoviral/L1 гибридного вектора [145] позволило продемонстрировать ретротранспозиции L1 в неделящихся зрелых нервных клетках, дифференцирующихся из hESCs [99] (Fig. 3). Поскольку L1 s обычно представлены в соматических тканях, то механизм, ответственный за активацию L1 в нейральных предшественниках, был исследован (rev. [146, 147]). Поскольку L1 промотор, чья активность, как известно, регулируется с помощью метилирования CpG [93, 148], а в зрелых нейронах обнаруживается гипометилирование, которое меньше, чем метилирование в фибробластах [143] и эти данные подтверждают, что дополнительные факторы помимо метилирования ДНК могут позволять экспрессию L1 в нейронах. Наиболее приемлемая модель регуляции экспрессии L1 и реторотранспозиции в нейронах и NPCs связана с активностью Sox2 и WNT3A в комбинации с метилированием ДНК. Короче, Sox2, негативный регулятор нейрональной дифференцировки, как полагают, взаимодействetn с L1 промотором и репрессирует экспрессию L1 в нейральных стволовых клетоах грызунов и людей [112, 143]. Methyl-CpG-binding protein 2 (MeCP2), как было установлено, ассоциирует с L1 промотором зависимым от метилирования способом и репрессирует экспрессию L1 в нейральных стволовых клетах [149, 150]. После дифференцировки, Sox2 подавляется, промотор L1 мягко деметилирetncz и тем самым снижается связывание MeCP2 и повышается экспрессия L1. В то же самое время активация WNT3A может стимулировать экспрессию L1 посредством канонического Wnt пути [151].

Приведенные выше исследования использовали в основном преобразованные L1 репортерные конструкции, хотя недавно подходы, базирующиеся на секвенировании, были использованы, чтобы продемонстрировать происходящие эндогенные ретротранспозиции L1 в головном мозге человека, не только в NPCs, но и также в нейронах [144, 152-154]. Некоторые методы для детекции событий эндогенных ретротранспозиций были недавно разработаны и применены к выборкам, происходящим из головного мозга (rev. [155]). Retrotransposon capture sequencing (RC-seq, [156]) и L1-seq [72] являются двумя использованными методами, чтобы продемонстрировать ретротранспозицию L1 в нервных клетках, выделенных из коры головного мозга, хвостатого ядра и гиппокампа. Хотя эти исследования выявили существенную вариабельность в выявленной скорости мобилизации L1 в головном мозге [144, 152-154, 157], основным заключением из этих исследований оказалось, что события соматической ретротранспозиции L1 накапливаются во время разных стадий нейрального развития, включая ранние клетки предшественники и зрелые нейральные клетки. Итак, в то время как современные подсчеты величины ретротранспозиций L1 в нейронах варьируют от 0.04-0.6 до 13.7 L1 инсерций на клетку (see [111, 146, 157]), очевидно, что наш головногй мозг состоит из мозаики геномов.

Активны ли L1 в др. соматических тканях помикго головного мозга или все соматические стволовые клетки взрослых людей поддерживрь ретротранспозиции? Чтобы решить этот вопрос, Macia с колл. сравнивали частоты ретротранспозиций L1 и преобразованных L1 среди разных типов клеток человека, используя изогенные линии [99]. В результате способность к дифференцировке hESCs оказалась пригодной, чтобы продуцировать относительно чистые популяции стволовых клеток взрослых, которые затем были использованы для изучения экспрессии L1 и ретротранспозиции. Очевидно, такой подход позволяет сравнивать разные типы клеток, имеющих один и тот же генетический фон. Т.о., экспрессия и ретротранспозиции L1 были проанализированы в кератиноцитах (KERs, считающихся мультипотентными клетками эмбриональнальных предшественников, генерирующих эпидермальный барьер, волосы и ногти), NPCs, полностью дифференцированные нейроны, MSCs и HSCs (Fig. 3). Это позволяет сравнивать NPCs и нейроны с др. происходящими из эктодермы типами клеток (KERs) и с мультипотентными типами стволовых клеток, происходящих из мезодермы (MSCs и HSCs). Удивительно, данные показывают, что все типы протестированных клеток экспрессируют эндогенные L1-мРНК и кодируют L1-ORF1p, хотя существуют достоверные отличия в уровнях их экспрессии (Fig. 3): L1-RNAs и L1-ORF1p экспрессируются на одинаковых низких уровнях во всех типах клеток, но не в NPCs, которые экспрессируют умеренные уровни генных продуктов, выявляемых с помощью RT-qPCR, immunoblot анализа и конфокальной микроскопии [99]. Соотв., отсутствие обнаружимых полной длины L1 транскриптов в происходящих из костного мозга человека MSCs было продемонстировано [158]. Анализ статуса метилирования ДНК промоторов L1 в разных тестированных дифференцированных типах клеток, выявили обратную корреляцию с уровнями экспрессии L1 [99], это согласуется с гипотезой, что метилирование ДНК является основным механизмом ингибирования ретротранспозиции L1 в соматических клетках [159].

Чтобы исследовать, действительно ли, KERs, HFFs, нейроны и мультипотентные NPCs, MSCs и HSCs поддерживают ретротранспозиции L1, Macia с колл. получили подходящий гибридный базирующийся на аденовирусе L1 вектор, который был специфичесаки видоизменен для провед6ения экспериментов на неделящихся клетках [160]. В соотв. с данными экспрессии L1, ретротранспозиции L1 во всех типах протестированных клеток чрезвычайно низкий уровень за исключением NPCs (Fig. 3). Однако, это исследование подтвердило повышенные уровни ретротранспозиций в NPCs, и продемонстрировало, что неделеящиеся зрелые нейроны поддерживают ретротранспозицию L1, использовав видоизмененные L1 репортерные элементы in vitro. Т.о., эти данные подтвердили, что активность L1 характерным свойством всех типов соматических стволовых клеток тела человека. Интерсно, что недавно было сообщено, что трансгенные мыши, несущие преобразованные человеческие L1 репортерные элемеенты, подтвердили, что ионизирующая радиация увеличивала экспрессию L1 в мышиных HSCs, и что эти клетки могут экспрессировать более высокие уровни L1 РНК, чем человеческие HSCs [161]. Низкие уровни ретротранспозиции L1, наблюдаемые в необлученных HSCs, также увеличивались после облучения [161]. Однако, нельзя исключить, что некоторые или большинство ретротранспозиций L1 уже накопились во время эмбриональнального развития [161].

Приведенные выше исследования подтверждают, что среди проанализированных типов клеток ретротранспозиции L1 в мультипотентных стволовых клетках возникают на очень низком уровне за исключением NPCs (Fig. 3). Эти данные также показывают, что даже при низких уровнях, активность L1 в мультипотентных стволовых клетках будет приводить к новым инсерциям L1, перенося их в производные специфические ткани. Соотв., некоторые предполагаемые соматические инсерции L1 были идентифицированы в здоровых тканях, включая печень [162], желудок [163] и пищевод [164]. Хотя в этом сообщении одна de novo инсерция была выявлена в ткани толстой кишки [163] и пищевода [164], необходимы дополнительные исследования, чтобы понять, до какой степени, происходит мобилизация эндогенных L1 в здоровыъ тканях взрослых или на ранних стадиях развития. Принимая во внимание, что (что подобно нервным клеткам) ЖКТ происходит из энтодермы, то углубленный анализ мобилизации L1 в стволовых клетках взрослых, происходящих из зародышевого слоя может прояснить, действительно ли способность поддерживать ретротранспозиции L1 ограничена NPCs или также касается популяций энтодермальных стволовых клеток. Было показано, что наследуемые инсерции L1 появляются не только в плюрипотентных эмбриональных клетках, но и также в ранних примордиальных зародышевых клетках (PGCs), по крайней мере, у мышей [113]. У людей, PGCs представляют собой преимущественно недифференцированные типы стволовых клеток, которые дифференцируются в гаметы (сперматозиды и ооциты). Благодаря терапевтическому потенциалу PGCs для лечения бесплодия [165], влияние активности L1 в этих клетках необходимо учитывать. Итак, среди протестированных типов стволовых клеток у взрослых соматические ретротранспозиции L1 ограничены NPCs и PGCs, и это не является, по-видимому, родовым свойством мультипотентных взрослых стволовых клеток.

Тело человека находится в постоянной борьбе с TEs, с такими как L1, чтобы предотвратить их амплификацию и выход активности за пределы, поскольку функциональные, активные L1 элементы обладают значительным мутагенным потенцималом. Соматические L1-обеспечиваемые ретротранспозиции в соматических клетках, таких как стволовые клетки, также оказались связанными с болезнями, особенно в контексте рака [75, 76, 162, 166]. Ограничение мобильности этих элементов является поэтому критическим для поддержания геномной стабильности, особенно во время становления зародышевой линии раннего эмбриогенеза, т.к. новые инсерции TE в этих клетках могутпотенциально передаваться следующему поколению [167].

Во время первых нескольких дней эмбриогенеза, большинство TEs подвергается целенаправленному воздействию механизмов замалчивания и удерживается под контролем во время раннего эмбриогенеза с помощью эпигенетического замалчивания и пост-транскрипционной регуляции мРНК L1 [99, 168, 169]. Эпигенетическое замалчивание экспрессии TE обеспечиваетс с помощью 1) Krüppel-associated box domain-containing zinc finger proteins (KRAB-ZFPs), медиатора формирования гетерохроматина [98] 2) метилирования цитозина, процесса, управляемого действием белка, подобного DNA methyltransferase-3 в зародышевых клетках [93] и 3) семейства белков ten-eleven translocation (TET) [170]. TEs распознаются с помощью базирующихся на сиквенс-специфических белках- или RNA-базирующихся репрессорах, с последующим привлечением комплексов, индуцирующих гетерохроматин [171]. Метилирование гистонов, деацетилирование гистонов и метилирование ДНК контролируют экспрессию TE и репрессируют их цис-действующие транскрипционные компоненты, которые д. помо этого активировать соседние гены посредством эффектов промотора или энхансера [172-178]. Гистоновые репрессивные метки играют большую роль в этом процессе, а триметилирование гистона 3 по лизину 9 (H3K9me3) является модификацией, обнаруживаемой в широком круге разнообразных TEs, включая ERVs, LINEs, SINEs и SVAs в hESCs [98, 179-184]. Замечательные обзоры опубликованы недавно о том, как хозяин контролирует активность активных TEs [67, 110, 155].

KRAB-ZFPs является крупнейшим семейством регуляторов транскрипции у высших позвоночных [185] и играет главную роль в контроле экспрессии NT в раннегм эмбриогенезе позвоночных, включая ERV, LINE, SINE и SVA элементы [98, 178, 184]. Присутствие N-терминального домена KRAB и C-терминального массива ДНК-связывающих цинковых пальчиков обеспечивают молчание путем рекрутирования кофактора KRAB-associated protein 1 (KAP1, известен также как TRIM28), который действует как стыковочный белок для белков с гетерохроматин-формирующей активностью, включая H3K9 methyltransferase SETDB1 [178, 186]. Система KRAB/KAP1 репрессирует транскрипцию эндогенных ретроэлементов преимущественно посредством деацетилирования гистонов, триметилирования H3K9 trimethylation и привлечения HP1, при этом метилировани ДНК происходит только вторично, чтобы гарантировать прочность процесса молчания [187, 188].

Эволюционно старые подсемейства L1, которые возникли между ~7 и 25 миллионами лет тому назад замалчиваются в hESCs [98, 185, 189] посредством специфических KRAB-ZFPs, таких как ZNF93/KAP1, и имеются доказательства, что KRAB-ZFPs также соединяются с более молодыми компетентными к ретротранспозиции L1Hs элементами [185]. Помимо L1s, в hESCs две трети эндогенных ретроэлементов, соединяющихся с KAP1, являются SVAs, указывая тем самым, что KAP1 является основным репрессором активности SVA. Итак, KRAB-ZFP/KAP1 комплексы контролируют активность TE в hESCs, включая элемеенты, способные к ретротранспозиции, обладающие потенциалом влиять на целостность генома и помогать поддержанию транскрипционного гомеостаза и нормальной дифференцировки ESCs.

Метилирование ДНК по CpG динуклеотидам играет жизненно-важную роль в замалчивании TE как в соматических, так и зародышевых клеткахи предполагается, что оно участвует прежде всего в защите хозяина от TEs. [93, 190, 191]. У млекопитающих, метилирование CpG осуществляется с помощью ДНК метилтрнасфраз DNMT3a, 3b, 3L и 3C и поддерживается с помощью ъ метилтрансферазы DNMT1 и кофакторов. DNMTs необходимы, чтобы повторно устанавливать метилирование ДНК TE после двух волн репрограммирования, которым подвергаются зародышевые клетки и ранние эмбрионры [192-195]. Метилирование ДНК, как известно, контролирует экспрессию L1, а промотор L1 имеет канонический CpG островок, метилировани которого обратным образом скоррелировано с экспрессией L1 [93, 148, 149, 196].

Как модели раннего эмбриогенеза, hESCs/hiPSCs обнаруживают достоверное гипометилирование промоторов L1, и избыточная экспрессия полной длины мРНК L1 , L1 ORF1p и L1-RNPs [79, 96-101, 132, 133, 197, 198]. Однако, метилирование ДНК также участвует в долговременном контроле транскрипции пока неактивных L1 s, а в hESCs, L1PA4 и L1PA5 обнаруживаются более высокие уровни метилирования, чем активные на сегодня элементы L1Hs [98]. Исследование корреляции между метилированием CpG и экспрессией TE в naïve и primed человеческих ESCs показало, что TEs в naïve клетках оказываются менее метилированными по сравнению с primed клетками [128]. Несмотря на общий низкий уровень метилирования в naïve hESCs, эндогенные SVAs, которые представляют собой наиболее экспрессирующееся TE семейство в таких клетках, обнаруживают тенденцию быть более гипометилированными по сравнени с копиями, не обнаруживающими избыточной экспрессии в naïve клетках [128]. Т.о., метилирование ДНК является ключевым для контроля экспрессии и мобилизации L1 и является главным контролирующим механизмом TE во время гаструляции [125].

TET белки: Поскольку преимущественный механизм, лежащий в основе деметилирования ДНКво время раннего эмбриогенеза, связанное с репликацией разведение 5mC [199, 200], активный механизм, зависящий от TET энзимов, как было установлено, стирает метилирование ДНК в специфических локусах в этот период [170, 201-203]. TET энзимы катализируют окисление 5-methylcytosine в 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), и далее в 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxylcytosine (5caC), которые могут замещаться немодифицированными цитозинами за счет эксцизионной репарации оснований [204, 205]. Некоторые из белков TET экспрессируются на высоком уровне в ESCs и бластоцистах [206], и, как было установлено, связывание и деметилирование TET в определенных классах TE, таких как LTR ретротранспозоны, действует совместно с факторами плюрипотентности Nanog, Oct4 и Sox2, для поддержания экспрессии субнабора генов в ESCs [170]. Истощение TET1 и TET2 в mESCs, как было установлено, вызывает потерю 5hmC в 5' регионе L1 [207]. В hESCs белки TET преимущественно соединяются с эволюционно молодыми функциональными L1 элементами и участвуют в их активном деметилировании, но не взаимодействуют со старыми неактивными подсемействами. Хотя TETs управляют деметилированием L1, L1s могут удерживаться в репрессированом состоянии посредством TET-зависимого рекрутирования репрессора транскрипции SIN3A. Rj-репрессивный комплекс SIN3A соединяется с функцональными L1s в ESCs мышей и людей, гарантируя их репрессию TET-зависимым способом [92, 170]. Т.о., амест о того, чтобы быть единственными позитивными регуляторами экспрессии L1, TET энзимы могут обладать двойной ролью в регуляции TE также за сяет привлечения SIN3A к деметилированию L1 элементов. Недавнее сообщение предоставило доказательтсво, что methyl-CpG связывающий домен, также как и соседний с неспецифическими последовательностями ДНК связывающий домен MeCP2 обоеспечивает репрессию индуцированную TET1 мобилизацию L1 [208]. Также комплекс KZFP/KAP1, как было установлено, поддерживает гетерохроматин и метилирование ДНК в TEs в naïve мышиных ESCs частично зп счет защиты этих локусов от TET-обусловленного деметилирования [209].

Класс РНК, включая PIWI-interacting RNAs (piRNAs), эндогенно продуцирует small interfering RNAs (siRNAs) или micro RNAs (miRNAs), а важность базирующейся на малых РНК репрессии в контроле экспрессии L1 в плюрипотентных стволовых клетках человека известна [114, 210, 211]. Двунитчатые РНК (dsRNAs) со специфичной последовательностью к части транскриптома, котороя происходит из TEs с двунаправленными промоторами, такими как L1s, как полагают, служат в качестве субстрата для продукции siRNAs [212]. Более того, dsRNA, продуцируемые с 5'UTR L1, могут запускать interferon-зависимый рестрикционный фактор ribonuclease L в некоторых раковых клетках, заставляя деградировать L1 мРНК [213].

piRNAs являются сложным классом малых некодирующих РНК, которые представлены в основном 24-32 нуклеотидами, специфически взаимодействующими с подсемейством белков PIWI из семейства ARGONAUTE [214], и репрессирующими мобильные генетические элементы в зародышевой линии Drosophila и млекопитающих [169]. piRNAs генерируют транскрипцию длинных кластеров TE, приводя к накоплению коротких зрелых piRNAs в цитоплазме с помощью ping-pong механизма [215]. piRNAs затем действуют как наводчики на разрушение комплементарных TE транскриптов с помощью эндонуелеолитического расщепления. PIWI-обеспечиваемый контроль в самом деле запускается путем распознавания проксимальных последовательностей L1 с помощью комплекса, состоящего из членов PIWI subclade из белков Argonaute и происходящихз из L1 piRNAs, это приводит подавлению транскрипции L1 посредством метилирования ДНК [216-218]. Система piRNAs-PIWI и ДНК метилтрансфераз, действующих ниже лействия piRNA, играет критическую роль в раннем эмбриональнальном контроле самых молодых и мобильных L1 клонов в в плюрипотентных клетках человека [98, 186, 211, 219].

Роль miRNAs и аппарата биогенеза miRNA в контроле non-LTR ретротранспозонов человека подтверждена демонстрацией, что комплекс, наз. Microprocessor, который состоит из RNase III типа энзима Drosha и его партнера DGCR8, катализирует ядерную ступенть биогенеза микроРНК [220, 221] и соединяется с происходящими из L1, Alu и SVA малыми РНК у клетках человека [210]. Эти результаты подтверждают, что Microprocessor распознает и преобразует структурные регионы внутри способных к ретротранспозиции L1 и Alu элементов, приводя к снижению функциональных L1 и Alu РНК, сто может приводить к снижению частоты ретротранспозиций L1 и Alu [169, 210]. miR-128, член класса miRNAs, состоящего из 20- до 24-nt-длиной некодирующиъх РНК, которые подавляют инициацию трансляции и стимулируют распад мРНК мишеней [222, 223], как было установлено, снижает как количества полной длины L1 РНК, так и частоты ретротранспозиций преобразованных L1 в культуре клеток, что было выявлено на раковых клетках человека и индуцированных плюрипотентных стволовых клеткахs [198].