Посещений:
БОКОВОЙ АМИОТРОФИЧЕСКИЙ СКЛЕРОЗ



Генотерапия

Gene therapy for ALS: A review
Defne A.Amado1Beverly, L.Davidson
https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.04.008

Боковой амиотрофический склероз (ALS) всегда фатальная болезнь, характеризующаяся дегенерацией верхних и нижних двигательных нейронов, приводящей к прогрессирующему параличу, респираторной недостаточности и гибели в возрасте 2-5 лет. Это также наиболее распространенное заболевание двигательных нейронов у взрослых, встречающаяся с частотой 5 на 100,0001 и риском для жизни 1:400-1:800.2 Исследования терапии с модифицированием болезни долго сдерживалось плохим пониманием механизма болезни. Фактически из более 80 клинических испытаний у людей,3 только riluzole4,5 и edaravone6-8 выявили замедленный прогресс, оба они оказались скромными и действовали неспецифически на excitotoxicity и оксидативный стресс. Недавние успехи в нашем понимании патофизиологии ALS, включая открытие множество лежащих в основе его генетических факторов, позволили разработать целенаправленную терапию.
Патологический признак ALS, встречающийся у более 97% пациентов, это ubiquitinated цитоплазматические включения, состоящие в основном из Tar-DNA binding protein of 43 kDA (TDP-43).9,10. Патология TDP-43 также обнаруживается у 50% пациентов с frontotemporal dementia (FTD) и обнаруживается почти во всех случаях ALS-FTD спектра.9-13 Обычно обнаруживаемый в ядре, TDP-43 широко обеспечивает транскрипцию, трансляцию и сплайсинг,14-17 взаимодействует с примерно ~30% транскриптома.14 Его неправильное расположение в цитоплазме, как полагают, вредно по двум причинам: (1) токсичности цитоплазматических агрегатов,18,19 и (2) потери нормальной функции в ядре.20-24 В большинстве нейронов от пациентов с ALS, белок TDP-43 ассоциирует с цитоплазматическими стрессовыми гранулами (SGs),25,26 конгломераторами из белков и РНК, которые становятся неадекватными при болезни. Кроме того, SGs связаны с факторами импорта в ядро хозяина, экспортом и транскрипцией и трансляцией, это приводит к потере снования между ядром и цитоплазмой и в конечном итоге гибели клеток.25-27 Этот внутриклеточный каскад предоставляет некоторые терапевтические мишени в виде патологических элементов, общих большинству случаев ALS.14
Др. подход и один из особенно подходящих подходов генотерапии является целенаправленное воздействие на генетические мутации, вызывающие ALS. 10 процентов ALS может быть отнесено к семейным, при этом ~70% от семейных случаев объясняются известными генными мутациями.28 Первым ассоциированным с ALS геном стал ген superoxide dismutase-1 (SOD1),29, описанный в 1993 и объясняющий 12%-20% семейных и 1%-2% спорадических случаев ALS.28,29 Спустя полтора десятка лет после его открытия, он остается единственной крупной наследственной причиной и лежит в основе всех преклинических моделей ALS.30,31 Однако, в отличие от 97% случаев, описанных выше, SOD1-ALS пациенты не демонстрируют патологии TDP-43 при аутопсии, указывая на возможность, что SOD1 модельные животные не представляют собой большую часть патологии ALS, а исследования, проведенные на этих моделях, не могут быть перенесены на людей.30,31 В самом деле, большинство ранних исследований оказались безрезультатными при клинических испытаниях на людях.32,33 В 2008 обнаружен второй участник в наследственном ALS, TARDBP, кодирующий TDP-4334,35. Мутации в TARDBP объясняют 4% семейных и 1% спорадических случаев, показано, что это прямая генетическая причина, а идентификация TDP-43 во включениях в двигательных нейронах предоставило дополнительные мышиные модели.30,31,36,37 Годом позже открыты мутации в гене fused in sarcoma (FUS) , объясняющие др. 4% семейных ALS,38,39 хотя подобно SOD1, FUS пациенты не имеют патологии TDP-43. В 2010, увеличение промежуточной длины CAG тринуклеотидных повторов в гене ataxin-2 (ATXN2) были найдены, связанными с 4.7% всех ALS.40 Наиболее важным генетическим открытием, кстати, стало то, что C9Orf72 в 2011;41,42 G4C2 экспансия гексануклеотидных повторов в этом гене бывла обнаружена у 40% семейных и у 8% спорадических случаев, или у 11% всех ALS,28,43 , а некоторые мышиные модели воспроизводили патофизиологию ALS.44,45 Более 20 дополнительных, ассоциированных с ALS генов в целом объясняют дополнительно 12%-15% семейных ALS,28,46 составляя 25%-30% семейных случаев необъясненных. Помимо SOD1 и FUS, TDP-43 патология обнаруживается среди всех мутаций, при этом почти все известные ассоциированные с ALS гены, были также идентифицированы при FTD или действовали как модификаторы фенотипов FTD , SOD1 остается известным исключением.10
Генотерапия использует доставку генетического материала в клетки, чтобы внести функциональные копии дисфункционального гена, внося трофические факторы и др. болезнь-модифицирующие гены или замалчивая экспрессию вредных генов, используя антисмысловые олигонуклеотиды (ASOs), RNA interference (RNAi) или технологию редактирования генов, такую как CRISPR. Чтобы целенаправленно воздействовать на ЦНС этот материал необходимо доставить голым, как это часто делается в случае ASOs; с помощью вирусных векторов, включая adeno-associated virus (AAV) и др.; или с помощью физической или химической систем, таких как наночастицы.2,47 Методы достижения ЦНС через гемато-энцефалический барьер включают внутривенные (i.v.), внутрь мозговых желудочков (i.c.v.), intrathecal (i.t.) или внутрь паренхимы введения. В случае ALS необходимы специфические доставки в моторный кортекс и спинной мозг.
вирусные векторы обладают преимуществами в обеспечении существенной экспрессии генетического материала в трансдуцируемых клетках после одного введения. Среди них, AAV проявляется как ведущий вектор для доставки ЦНС, благодаря его способности трансдуцировать окончательно дифференцированные клетки и устанавливать ядерные эписомы без внесения риска инсерционного мутагенеза.48,49 Столь же благоприятным является избирательный тропизм его многих разных серотипов, как возникших натурально, так и в результате модификаций.47,50 До сих пор серотипы, которые преимущественно использовали при преклинических исследованиях ALS и клинических испытаниях были естественно возникшие AAV9 и AAVrh10, благодаря своей способности целенаправленно воздействовать на двигательные нейроны.47,51,52 В частности, открытие, что self-complementary AAV9 (scAAV9) векторы пересекают гемато-энцефалический барьер51 ведет к их использованию для лечения spinal muscular atrophy (SMA), врожденного нарушения низших двигательных нейронов, при котором пациенты лишены функциональной копии гена SMN1. i.v. введение scAAV9, кодирующего SMN1 устраняет SMA у модельных мышей,53-55 и в последующих клинических испытаниях на людях, обнаруживая драматическую эффективность у SMA пациентов,56 это позволило US Food and Drug Administration (FDA) разрешить Zolgensma в 2019. Это служит важным подтверждением принципа для терапии ALS, при котором также д. подвергаться целенаправленному воздействию низшие двигательные нейроны.49 Недавно новая технология была использована для создания новых серотипов AAV с повышенным тропизмом к ЦНС и экспрессией при де-таргетинге периферических тканей,57, 58, 59, что может расширить эффективность и повысить специфичность будущих терапевтических средств, использующих AAV. Конечно, лентивирусные подходы также были использованы с определенным успехом на преклинических моделях ALS,49,60, но использование их у людей ограничено из-за ограничения их небольшой области трансдукции, низких титров вируса и широкого тропизма, а также их интеграции в геном хозяина, сопровождаемой риском мутагенеза.47,61 По этой причине большинство преклинических исследований с лентивирусами при ALS рассматриваются в др. месте,49 и сконцентрированы на доставке в мышцы и на переносе генов ex vivo,49,62 включая также подход с с комбинированием обеих стратегий62 (ClinicalTrials.gov: NCT02943850).

ASOs


ASOs являются однонитчатыми, длиной в 8- 50-оснований синтетическими олигонуклеотидами, которые могут быть изготовлены, чтобы они были комплементарными мРНК мишени для RNase H enzyme-обеспечиваемой целенаправленной деградации или изготовлены против первичных транскриптов, чтобы индуцировать альтернативный сплайсинг (Figure 1A).63-65 Недавно разные модификации были получены, чтобы повысить стабильность ASO, защитить от деградации нуклеазами, улучшить потребление клетками, рекрутировать RNase H и снизить иммунногенность.64 Хотя они не пересекают гемато-энцефалический барьер широкое распространение в ЦНС происходит после i.t. введения,63,65 делая их важным инструментом из арсенала против ALS. В самом деле, ASOs были разработаны для лечения SMA, обеспечив важную проверку концепции и для ALS. Для терапии SMA, доставка изменяющих сплайсинг ASO приводит в результате к конверсии SMN2 в SMN1, обнаруживая эффективность на мышиных моделях SMA, также как распределение затронутых областей спинного мозга у nonhuman primates (NHPs).66 Клинические испытания, обнаружили заметные улучшения в силе и продолжительности жизни детей с SMA,67-69 это позволило FDA разрешить nusinersen в 2016 и теперь он широко используется в клинике.

Figure 1. Summary of gene therapy strategies (A) Non-viral strategies include using ASOs to induce alternate splicing or RNase H-mediated degradation. (B and C) Viral strategies include (B) AAV-mediated gene silencing, through RNA interference or CRISPR-Cas9 or (C) AAV-mediated gene delivery including neurotrophic factors. AAV, adeno-associated virus; ASO, antisense oligonucleotide; Cas, CRISPR-associated system; miRNA, microRNA; PAM, protospacer adjacent motif; RISC, RNA-induced silencing complex; RNAi, RNA interference; shRNA, small hairpin RNA.



SOD1


Мутации в SOD1, как полагают, вызывают ALS посредством избыточной токсической функции, вызываемой агрегацией неправильно упакованных SOD1 белков.30,70 Хотя описано более 150 ALS-ассоциированных SOD1 мутаций, мутация G93A , редкая у людей, довольно широко исследована на преклинических моделях, т.к. уже существуют подходящие SOD1G93A мыши71,72 и крысы.73 В ключевом пре-клиническом исследовании поставлялось 20-mer ASO для целенаправленного воздействия на SOD1 в виде непрерывного вливания в боковой желудочек крыс и поясничный отдел позвоночника у NHPs и было продемонстрировано достоверные и широко распространенные концентрации ASO по всему головному мозгу и спинному мозгу с глубоким тканевым проникновением.74 У SOD1G93A крыс, обработанных до появления симптоматики, достигался устойчивый нокдаун SOD1 мРНК и белка в головном и спинном мозге, это сопровождалось замедлением прогрессирования болезни и увеличением жизнеспособности.74 Это привело к клиническому испытанию у людей phase I (ClinicalTrials.gov: NCT01041222), когда ASO ISIS 333611 доставлялся в виде единственного, 11.5-h i.t. вливания пациенту с SOD1-ассоциированным ALS.75 После того как исследование продемонстрировало надежность и переносимость, спинномозговую жидкость (CSF) SOD1 стали использовать в качестве фармакокинетического маркера, не было обнаружено снижения в CSF SOD1 белка при использовании осторожных концентраций (макс. доза, 3 mg). При последующем испытании (ClinicalTrials.gov: NCT02623699) доставляли ASO, под названием BIIB067/Tofersen (IONIS-SOD1Rx), посредством серийных поясничных i.t. инъекций в течение 12 недель, дозами в пределах 20-100 mg.76 Испытание продемонстрировало безопасность высоких доз, а также снижение в CSF белка SOD1 на 33% в группе с наивысшей дозой. Анализ показал многообещающее снижение скорости снижения, измеряемой с помощью уточненной ALS functional rating scale (ALSFRS-R) в группе с высокой дозой, особенно среди пациентов с быстром прогрессированием.76 Безопасность и эффективность сегодня оценены в phase 3, рандомизированного, double-blind, placebo-controlled испытания (ClinicalTrials.gov: NCT02623699) и его расширенного исследования (ClinicalTrials.gov: NCT03070119). Помимо традиционной доставки голых ASOs др. группа сообщила о новом подходе с использованием AAV для достижения целенаправленной и устойчивой экспрессии ASO. AAVrh10, экспрессирующий анти-смысловую последовательность, нацеленную на SOD1, внедренную в U7 small-nuclear РНК, с помощью i.v. и i.c.v. мышам SOD1G93A, при рождении или до появления симптомов у взрослых, это приводило к nonsense-обусловленному распаду SOD1 и заметному увеличению жизнеспособности, силы и веса в обеих возрастных группах.77

C9orf72


Хотя полностью механизмы, с помощью которых C9orf72 гексануклеотидные повторы вызывают ALS, неизвестны, исследования указывают на существенную роль функции избыточной токсичности, обеспечиваемой частично РНК с G4C2 повторами и частично белками с дипептидными повторами, продуцируемыми с помощью repeat-associated non-ATG (RAN) трансляции.78,79 Это первая базирующаяся на ASO стратегия, сфокусированная на снижении токсичности в индуцируемых плюрипотентных стволовых клетках (iPSCs), происходящих от людей с избытком C9orf72. Три таких исследования были опубликованы в тандеме в 2013, показавшими, что ASO-обеспечиваемое снижение C9orf72 транскрипта - или путем соединения с увеличенными повторами или с окружающими регионами - снижает фокусы ядерной РНК при C9orf72-ассоциированных ALS.78,80,81 Две группы обнаружили кроме того, что воздействие ASO обращает экспрессию аберрантного гена и снижает чувствительность к excitotoxicity в происходящих из iPSC нейронах,78,81 тогда как третья группа продемонстрировала сохранение экспрессии аберрантной РНК после целенаправленного воздействия на sense-нить, а доказательства подтвердили важность одновременного целенаправленного воздействия на анти-смысловую нить.80 Эта группа также впервые осуществила исследование in vivo, продемонстрировав устойчивую эффективность и переносимость нокдауна C9orf72 РНК у мышей дикого типа после 18 недель от одиночной инъекции ASO в боковые желудочки.80 В последующем исследовании авт. использовали одиночную i.c.v. инъекцию для доставки ASOs, нацеленных на G4C2 повторы-содержащие sense-нити РНК у взрослых мышей до появления симптомов, экспрессирующих до 450 повторов. Они продемонстрировали устойчивое снижение фокусов РНК и белков с дипептидными повторами в коре и спинном мозге, а также ослабление когнитивного дефицита.82 работа в конечном итоге привела к phase I клинического испытания ASO BIIB078 (ClinicalTrials.gov: NCT03626012) для C9orf72-ALS пациентов.

ATXN2


Хотя экспансия длинных тринуклеотидных повторов в ATXN2 является известной причиной spinocerebellar ataxia type 2,83-86 экспансия промежуточной длины, как было установлено, в 2010 является относительно распространенной причиной наследуемых ALS.40,87-89 Ataxin-2 выполняет разные функции в клетках, включая процессинг РНК и эндоцитоз рецепторов, но его критические функции заключаются в формировании стрессовых гранул27,90 и индукции аберрантного расщепления TDP-43 с помощью caspase 391,92 что имеет особое значение для ALS. В 2018 было продемонстрировано, что нуклео-цитоплазматические транспортные факторы хозяина связывают ataxin-2-содержащие SGs после индукции стресса в HEK293T клетках. Далее, доставка ASOs, нацеленных на ataxin-2 в нейроны, дифференцированные из PSCs от C9orf72-ALS пациентов устраняли неправильную локализацию в цитоплазме ядерных белков.27 Конструктивная работа in vivo с использованием быстро прогрессирующей мышиной модели TDP-43 ALS, чтобы продемонстрировать, что одновременное введение Atxn2-ASO в боковой желудочек при рождении приводит к устойчивой, заметной редукции Atxn2 мРНК , а также к увеличению продолжительности жизни и к улучшению походки.93 В то время как эта стратегия может быть благоприятной для пациентов с ATXN2-ALS, важно, что она также открывает путь терапии для более широкой популяции ALS, т.к. TDP-43 локализация в ATXN2-зависимых стрессовых гранулах является важным патологическим конечным итогом.25 Фаза I клинического испытания ASO BIIB105 (ClinicalTrials.gov: NCT04494256) пока в ходу на пациентах как с , так и без экспансии повторов CAG в ATXN2.

FUS


FUS является наиболее распространенным мутантным геном, обнаруживаемым у юношей и детей ALS, с мутацией p.P525L, вызывающей особенно агрессивную с ранним началом форму94,95 посредством механизма избыточной токсической функции. В 2019, Ionis Pharmaceutical, в содружестве с Columbia Medical Center, разработали ASO, нацеленный на эту мутацию посредством i.t. доставки и получено разрешение FDA для экспериментального использования у молодых женщин, для которых используется терапия jacifusen.96 Jacifusen был также использован для лечения трех дополнительных пациентов с FUS-ALS через сострадание FDA's и 8 пациентам разрешено лечение с исследовательской целью ассоциацией ALS и Project ALS.95,97,98

AAV-mediated gene silencing


AAV-обусловленное замалчивание имеет преимущество перед ASOs из-за отсутствия необходимости повторного применения при целенаправленном воздействии на головной мозг и спинной мозг. AAVs часто используются для доставки небольших некодирующих РНК для осуществления RNAi, естественно возникающего процесса, при котором молекулы двунитчатых РНК регулируют экспрессию мРНК посредством гомологичного спаривания оснований и последующего расщепления посредством RNAi-induced silencing complex (RISC; Figure 1B).2,99 Два типа малых не кодирующих РНК, small hairpin RNA (shRNA) и artificial microRNA (miRNA), вусё шире используются в качестве терапевтической стратегии при нейродегенеративных болезнях, особенно miRNA, благодаря их более приемлемому профилю безопасности.100,101 Дальнейшая обработка достигается использованием биоинформационных инструментов, чтобы минимизировать загрузку passenger нити102 и оптимизировать промотор, серотип и выбор дозы,99 приводя к общему значительному снижению эффектов вне мишени. Первое AAV-RNAi клиническое испытание на людях для нейродегенративной болезни (ClinicalTrials.gov: NCT04120493) сегодня находится в phase I/II и использует AAV5 для доставки miRNA, нацеленной на Huntingtin для лечения болезни Huntington's.2,103 Это исследование предоставило важные данные по безопасности и осуществимости в области ALS.
Альтернативный подход к лечению нарушений с избыточностью функции предоставляет редактирование генов, которое может быть осуществлено с использованием CRISPR-associated (Cas) систем, большинство из которых широко использует RNA-guided Cas9 эндонуклеазу104 (Figure 1B). CRISPR-Cas9 позволяет специфически целенаправленно воздействовать на геномные последовательности и индуцировать разрывы двойной нити ДНК, вызывая инсерции или делеции оснований (indels) в результате сдвига рамки считывания при разных подходах,105 хотя её использование в области ALS только намечается.106 Помимо этого у CRISPR-based систем был разработан трансформирующий потенциал.107-110 Сюда входит CRISPR-interference (CRISPRi), коорая использует каталитически dead Cas9, чтобы репрессировать ДНК без потенциальных мутагенных эффектов, ассоциированных с расщеплением;111 семейство Cas13, которое целенаправленно воздействует на деградацию РНК112,113, а варианты которой являются довольно небольшими для упаковки AAV;114, а prime editing, который является методом для внесения специфических геномных инсерций или делеций без индукции разрывов двойной нити.115 Применение этих технологий к ALS вполне ожидаемо.

SOD1


Т.к. первая идентифицированная форма ALS, SOD1 стала мишенью большинства базирующихся на AAV-RNAi подходов, с обнадеживающими результатами. Первое исследование с AAV9 по доставке shRNA против SOD1 оказалось сравнимым с i.v. применением SOD1G93A у мышей разных возрастов и было установлено 39% увеличение жизнеспособности после P1-инъекции, которая снижалась существенно с возрастом и по мере прогрессирования болезни;116 было отмечено всё более увеличивающееся предпочтение глиальных мишеней по сравнению с нейронами при более поздних инъекциях.116,117 Было также установлено, что заметно увеличивается выживаемость у медленно прогрессирующих SOD1G37R мышиных моделей, даже если они подвергались лечению после начала болезни и был продемонстрирован мощный нокдаун SOD1 мРНК по всему спинному мозгу у NHPs после поясничных i.t. инъекций.116 Др. группа использовала двухсторонние прямые инъекции в кору AAV9-shRNA, нацеленных на SOD1 у пре-симптомальных взрослых SOD1G93A крыс и было установлено, что супрессия SOD1 только в верхних двигательных нейронах способна сохранять моторную функцию и увеличивать жизнеспособность на 20 дней.118 Исследование в 2016 использовало AAV9 для доставки искусственных miRNA против SOD1 (mi-SOD1) в желудочки новорожденных SOD1G93A мышей. Авт. обнаружили 50% увеличение жизнеспособности с достоверной задержкой паралича задних конечностей, а также с улучшением многих гистопатологических параметров, включая ряд спинальных моторных нейронов.119 Очевидно, что воздействие на новорожденных , обнаруживает ограниченную translatability, поскольку большинство пациентов являются уже взрослыми после появления симптомов и авт. поэтому сделали провели отдельное исследование с использованием rAAVRh10 для доставки mi-SOD1 системно взрослым SOD1G93A мышам. Они установили существенную задержку начала болезни и 21% увеличение выживаемости, при этом сохранялась сила и респираторная функция.120 Затем они тестировали вектор у мартышек посредством i.t. инъекций и установили достоверное снижение SOD1 в нижних моторных нейронах всего спинного мозга без кратковременной токсичности.120 Последующие исследования rAAVRh10.mi-SOD1 у макак, доставляемые с помощью i.t. при опущенной голове под углом 30 градусов, продемонстрировало мощное замалчивание на уровне мРНК в laser-отлавливаемых моторных нейронах по всему спинному мозгу, которое пропорционально силе используемого промотора.121 Авт. продемонстрировали низкий профиль вне мишени и не установили побочных явлений в течение 92 дней после введения, прокладывая тем самым путь к исследованиям на людях. В этом исследовании два пациента с SOD1-ALS подвергались воздействию i.t. вливания rAAVRh10.mi-SOD1. Первый пациент имел временное улучшение силы в своей правой конечности и легкое снижение уровней CSF SOD1 без др. указаний на успех и ход лечения был осложнен тяжелым менингорадикулитом с сенсорными симптомами. Эти сенсорные симптомы не были обнаружены у второго пациента который подвергался действию иммуносупрессии во время вливания. При аутопсии уровни SOD1 были ниже в спинном мозге пациента 1 по сравнению с не леченными SOD1 пациентами, а нейроны были истощены с обей сторон в ганглиях дорсальных корешков (DRG) , при этом наблюдали инфильтрацию нервных корешков T- лимфоцитами. Пациент 2 сохранял устойчиво силу и жизнеспособность в течение 12-мес. периода.122
Токсичность в DRG, наблюдаемая в клиническом испытании, была также отмечена, когда AAV9 применяли системно к новорожденным поросятам и молодым приматам,123 хотя NHPs не обнаруживали клинических признаков токсичности. Далее мета-анализ CSF и системного введения 33 NHP (из общего количества 256 NHPs) показал токсичность в DRG в 83% у CSF-обработанных и у 32% системно получавших NHPs, которые имели отличия по серотипу, полу, промотору и трансгену; важно, однако, патология обнаруживала зависимость от дозы и в целом была умеренной и не наблюдалось клинических осложнений.124 Интересен альтернативный подход для устранения DRG токсичности давал варьирующие успешные результаты. Напр., AAV-Rh10-обеспечиваемое воздействие miSOD1, описанное выше, также приводило к 50-дневному увеличению выживаемости после прямой инъекции в язык и внутриплевральное пространство взрослым пре-симптоматичым мышам SOD1G93A,125, у которых слабость была ведущей причиной гибели при ALS. Недавние исследования успешно использовали DRG-специфические мРНК, чтобы подавлять экспрессию трансгенов в этих клетках при этом сохранялась намеченная трансдукция ЦНС, эффективная стратеги без нацеливания может использоваться для любой базирующейся на AAV терапии.126 Наконец, одно известное исследование использовало новый subpial метод доставки, с использованием AAV9-shRNA, чтобы сузить пространство между паренхимой спинного мозга и наиболее внутренним слоем менингеальных оболочек. Авт. достигли долговременной супрессии болезни моторных нейронов у SOD1G37R мышей, леченных до возникновения симптомов, а также в качестве мощного блокатора прогрессирования болезни у мышей, лечение которых началось с появления симптомов. Он затем использовали такую доставку у взрослых свиней и NHPs и установили гомогенную и мощную экспрессию трансгенов по всему спинному мозгу, включая двигательный нейроны.127 Несмотря на технические затруднения продемонстрирована осуществимость этого подхода на крупных модельных животных, это обещает, что subpial введение AAV возможно у людей.
Первое исследование с использованием CRISPR при ALS опубликовано в 2017. Авт. использовали модифицированный AAV9 для доставки происходящей из Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) и single-guide RNA (sgRNA), нацеленной на ген hSOD1 посредством лицевой вены у новорожденных SOD1G93A мышей.128 Они установили концентрированную экспрессию SaCas9 во всех клетках вентральных рогов спинного мозга, при этом наблюдали более, чем 2.5-кратное снижение 4уровней белка SOD1. Обработанные мыши обнаруживали сохранение моторных нейронов с улучшенной моторной функцией, 37% задержку с началом болезни и 25% увеличение выживаемости, при этом низкая доля indel вне мишени для трансгенов по всему спинному мзгу.128 Др. группа использовала AAV9-SaCas9-sgRNA для лечения новорожденных SOD1G93A мышей посредством i.c.v. инъекций и обнаружила снижение SOD1 в клетках передних рогов. Это исследование также сообщило о повышении в моторных нейронах значительно улучшенной моторной функции, а также удивительное 54.6% увеличение выживаемости, при низком уровне доли indel вне мишени для предсказанных последовательностей вне мишени.129 В последующем исследовании первой группы, была предложена intein-обеспечиваемая trans-splicing система для in vivo редактирования одиночных оснований SOD1, чтобы минимизировать потенциальные мутагенные исходы от разрывов двойной нити ДНК. Авт. использовали двойные векторы AAV9 для доставки этой системы с помощью i.t. у пре-симптоматических взрослых SOD1G93A мышей и установили 40% снижение в SOD1 включениях, что сопровождалось улучшением нейро-мышечной функции и массы мышц, а также 11% увеличением выживаемости,130 несмотря на преимущественное воздействие на астроциты. Эти базирующиеся на CRISPR стратегии обнадеживают.

C9of72


Благодаря проблемам, связанными с целенаправленным воздействием интронных, GC-богатых повторных расширений131 и достижению нокдауна в ядре, где преимущественно находятся C9orf72-обеспечиваемые РНК фокусы, базирующиеся на RNAi подходы C9orf72 имеют затруднения по сравнению SOD1. В 2015, группа оказалась способной преобразовать двойную РНК, чтобы преодолеть это горлышко и эффективно целенаправленно воздействовать как на смысловые, так и анти-смысловые G4C2 расширения в клетках фибробластов, происходящих от ALS пациентов.132 Путем внесения несоответствий в ключевые регионы, они дестабилизировали родительские дуплексы, чтобы стало возможным внесение в RISC комплекс, возникающее в результате 40%-60% снижение фокусов ядерных РНК на обеих нитях. Авт. затем преобразовали однонитчатые замалчивающие РНК (ss-siRNAs), которые функционируют подобно ASOs, но обусловливают деградацию посредством RNAi, и обнаружили, что эти преобразования обладают даже более мощным подавлением смысловых и анти-смысловых G4C2 повторяющихся расширений в мутантных клетках C9orf72 фибробластов людей.133 Биотехн. компания uniQure разработала разные двунаправленные базирующиеся на miRNA подходы, используя сцепленные miRNA hairpins, нацеленные на C9orf72 (miC), и получив 50% снижение ядерных фокусов РНК как смысловых, так и анти-смысловых в (G4C2)44-экспрессирующих клетках. Они далее вставляли эти miC конструкции в AAV5 и эффективно замалчивали C9orf72 в нейронах, происходящих из iPSC от FTD пациента.135 Они затем доставляли свои AAV5-miC конструкции в striatum взрослых трансгенных C9orf72_3 мышей линии 112, линии, обладающей несколькими тандемными копиями человеческого C9orf72, которые не приводили к нейродегенерации, но обладали фокусами РНК и poly(GP) белком. Они установили снижение в 20%-40% C9orf72 мРНК и смысловых интронных транскриптов в трансдуцируемых регионах, хотя мыши не жили достаточно долго, чтобы успеть определить снижение poly(GP).135
Известны лишь немногие исследования CRISPR для C9orf72, но недавнее исследование с использованием CRISPR-Cas9 использовано, чтобы получить делеции в регионе промотора iPSCs, происходящих от пациентов, обладающих расширениями C9orf72. Они установили, что эти делеции снижают экспрессию C9orf72 варианта, содержащего повторяющиеся расширения, это, в свою очередь, почти элиминирует продукцию всех дипептидных повторов и заметно снижает дегенерацию аксонов.136 Др. недавнее исследование идентифицировало Ku80 в качестве белка репарации ДНК, который избыточно активирован у Drosophila, обладающих расширениями G4C2 , и в клетках iPSCs, происходящих от C9orf72-ALS пациентов, приводя к преждевременному апоптозу. Авт. использовали CRISPR-Cas, чтобы редуцировать Ku80 и установили снижение активности про-апоптических путей; они также установили снижение ядерных фокусов РНК после непосредственных CRISPR-обусловленный делеций повторяющихся расширений G4C2.137

ATXN2


Кстати, нет публикаций о базирующихся на RNAi или CRISPR подходах, нацеленных на ATXN2.Однако, потенциал этого подхода может быть выведен из родственных исследований при spinocerebellar атаксии и из ASO-обусловленном снижении Atxn2 у мышиных моделей SCA2138 и ALS93. Вирусная доставка при RNAi-based подходах продемонстрировала успешность на мышиных моделей SCA1,139,140 SCA3,141,142 и SCA7,143 , тогда как подход, базирующийся на CRISPR к клеткам iPSCs, полученным от пациентов, оказался обнадеживающим при SCA3.144 Кроме того, ASO, RNAi и CRISPR-базирующиеся подходы для spinocerebellar атаксии подробно рассмотрены в др. месте145 и продемонстрировали пригодность и перспективу этих подходов, приспособленных к целенаправленной доставке в нейроны с помощью AAV.

AAV-mediated gene delivery


В большинстве случаев подходы генотерапии связаны с терапевтическими трансгенами. В отличие от случаев Zolgensma для SMA, однако, отсутствуют мутации, вызывающие ALS, использующие исключительно механизм потери функции и поэтому доставка терапевтических трансгенов сконцентрирована на нейротрофных факторах, чтобы поддерживать дегенерирующие нейроны (Figure 1C). Нейротрофины обычно секретируются и участвуют в росте и жизнеспособности нейронов, а некоторые нейротрофины, как было установлено, со временем снижаются у ALS пациентов и животных моделях,49 подтверждая потенциальную роль в поддержании здоровья нейронов. Неспецифические и вряд ли лечебные эти методы привлекательны в качестве способа продления жизнеспособности всех форм ALS. Использование факторов роста, к сожалению, 32,146 оказалось безуспешным в клинических испытаниях,147, при которых в большинстве случаев действовали неадекватные дозировки к поврежденным областям нервной системы. По этой причине, ген-терапевтические подходы разыскиваются многими группами в надежде улучшить доставку в ЦНС и дозировку. Ранние исследования по генотерапии рассматриваются в др. местах.47,49 Здесь мы сконцентрировались на недавних AAV-обеспечиваемых исследованиях, большинство из которых проведены на SOD1G93A мышах. Мы также обсуждаем AAV-обеспечиваемую доставку не трофических факторов, включая модуляторы нервно-мышечных соединений и терапию, нацеленную на агрегаты.
Внутримышечная доставка insulin-like growth factor 1 (IGF1) с использованием AAV9, как было установлено, в двух отдельных исследованиях, чтобы сохранить спинальны моторные нейроны и слегка увеличить продолжительность жизни SOD1G93A мышей, леченных до появления первых симптомов или в раннем возрасте после появления симптомов.148,149 Сходные результаты были получены с использованием системной доставки AAV9-IGF1.150 При разных подходах, i.c.v. доставка AAV4 использовалась для целенаправленного воздействия на эпендимные клетки для секреции IGF1 в CSF у ранних SOD1G93A мышей с симптомами. Авт. выявили улучшение моторной функции и в умеренной степени жизнеспособность,151 эффекты. которые были слегка выше при доставке с помощью AAV4 vascular endothelial growth factor (VEGF), который, как полагают, действует на том же самом пути, что и IGF1.152 Доставка AAV4-IGF1 и AAV4-VEGF не предоставила дальнейшего улучшения.151 VEGF был приспособлен для терапии ALS как на уровне генотерапии , так и белка.153 Используя i.t. доставку AAV9, одна группа продемонстрировала, что экспрессия VEGF у взрослых мышей SOD1G93A с симптомами улучшала моторную функцию и увеличивала жизнеспособность.154 Когда использовал AAV1 и AAV9 для доставки VEGF у кошек при болезни нижних моторных нейронов посредством i.c.v., i.v. или intra-cisterna magna (i.c.m.) инъекций, только i.c.m. доставка давала устойчивые, высокие уровни экспрессии VEGF в спинном мозге; однако, не выявлены терапевтические эффекты.155
Хотя в ранних исследованиях AAV-обусловленная доставка glial-derived neurotrophic factor (GDNF) подавала надежды,156,157 эффекты были умеренными и наблюдались только после внутримышечных введений. В 2017 системная доставка AAV9-GDNF SOD1G93A крысам до появления симптомов, давала слабое улучшение силы и задержки паралича передних конечностей. Однако, не наблюдалось увеличения продолжительности жизни и присутствовали побочные эффекты, включая снижение рабочей памяти, уровней активности и веса.158 Др. нейротрофный фактор, granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), как было установлено, предохраняет моторные единицы и увеличиает жизнеспособность на 10%, когда вводился взрослым SOD1G93A мышам до появления симптомов посредством инъекций в спинной мозг AAV1.159 Hepatocyte growth factor (HGF) также был оценен с использованием i.t. AAV1160 или внутримышечного введения AAV6161 при лечении взрослых pre-symptomatic SOD1G93A мышей, с умеренными улучшениями в силе и жизнеспособности при использовании обоих методов введения.
Факторы, действующие на нервно-мышечные соединения, также были оценены, включая внутримышечную доставку AAV1-neuregulin, чтобы способствовать коллатеральным разрастаниям и электрофизиологической функции у взрослых, лишенных симптомов SOD1G93A мышей. Однако, не выявлено эффектов на силу и жизнеспособность.162 Системное введение AAV9, поставляющего ген, кодирующий белок нервно-мышечных соединений DOK7, сохраняет нервно-мышечные соединения, улучшает подвижность и умеренно увеличивает продолжительность жизни у ранних SOD1G93A мышей с симптомами, не влияя на количества двигательных нейронов.163 D-amino acid oxidase (DAO) , как полагают, модулирует excitotoxicity, а i.t. доставка AAV9-DAO ранним SOD1G93A мышам с симптомами приводит к сохранению двигательных нейронов и умеренному увеличению жизнеспособности.164
Факторы с прямыми эффектами на неправильно упакованные ассоциированные с ALS белки также были исследованы. Напр., цитозольный шаперон, macrophage migration inhibitory factor (MIF), подавляет неправильную упаковку мутантного SOD1.165 AAV9-обеспечиваемая экспрессия MIF после прямого внутрипозвоночного введения новорожденным SOD1G93A мышам или модельным мышам loxSOD1G37R с медленным прогрессированием достоверно снижала урони неправильно упакованных белков SOD1 в спинном мозге SOD1G93A мышей и улучшает силу и жизнеспособность обеих моделей.166 Доставка с помощью i.t. AAV1, экспрессирующего моноклональные антитела, нацеленные на неправильно упакованные SOD1 у пре-симптомных взрослых SOD1G93A мышей приводила к заметному 28% увеличению продолжительности жизни, что сопровождалось снижением неправильно упакованных SOD1 в спинном мозге и ослаблению сигналов нейрональных стрессов и глиоза.167 Сходная стратегия была протестирована на TDP-43G348C мышах, которые обнаруживали цитоплазматические накопления TDP-43, а также нарушения памяти. AAV9-обеспечиваемая кортикальная доставка антител, нацеленных на регион, склонный к агрегации TDP-43, снижала протеинопатию TDP-43, когнитивные нарушения, моторные дефекты и воспаление нейронов. 168

Conclusions and perspectives


The ability to provide targeted, sustained treatment gives gene therapy the potential to permanently alter the therapeutic landscape for diseases of the CNS, as it has already done in the case of SMA. ALS in particular is in dire need of impactful, disease-modifying approaches capable of reaching some of the body’s most protected regions, the cerebral cortex and the anterior horn cells of the spinal cord, which can increasingly be achieved through minimally invasive means by harnessing the tremendous potential of gene therapy. Once delivered to their target, these therapies can act through knockdown-mediated amelioration of gain-of-function mechanisms or through delivery of protective agents, enabling approaches ranging from targeting a specific ALS-causing mutation to modifying a common pathologic endpoint across sporadic cases. As we continue to hone our delivery methods, vector specificity, and cargo efficacy, there is great hope that truly impactful treatments for ALS will emerge in the near future.