Целостность экспрессиии всех генов базируется на РНК и свойства нуклеиновых кислот, позволяющие комплементарное спаривание оснований давно привлекает как способ изменения экспрессии генов путем модулирования структуры, функции или концентрации РНК для лечения болезней человека. Успехи в этой области основываются на фактах разработки синтетических аналогов нуклеиновых кислот (1), устойчивых к деградации нуклеазами и которые могут быть модифицированы, чтобы создать новые механизмы. Антисмысловые (the reverse complement) последовательности нуклеиновых кислот (олигонуклеотиды) к региону молекулы мишени могут быть синтезированы и оценены рутинным способом, чтобы идентифицировать соединения с необходимой специфичностью и сродством, чтобы менять обилие, структуру или функциональную способность возникающего в результате транскрипта ( Figure 1). Такие исходы обнаруживают далеко идущий потенциал, чтобы изменить течение болезней человека, и в то же время указывают на очень редкие наследуемые заболевания с иным образом ограниченными вариантами лечения. Эта область вызывает споры относительно высокой цены лечения и клинических испытаний и результатов и одобрения регулирующей оценки исходов и некоторой неопределнности относительно мехнизмов действия¹ и появляющихся сообщений об эффектах вне мишени^{2, 3}. Хотя лишь небольшое количество антисмысловых лекарств используется в клинике⁴ или undergoing translation в настоящее время, делаются попытки улучшить доставку лекарств олигонуклеотидов и эффективность и лучшее понимание антисмысловых механизмов, которые в будущем принесут свои плоды.



Currently approved antisense oligonucleotide drugs, indicating chemistry and mechanisms of action. Antisense strategies that induce transcript degradation (left panel) include RNaseH degradation of the target transcript, activated by annealing of a complementary oligodeoxynucleotide ( A) and transcript degradation by small interfering RNA (siRNA) ( B). Transcript modification by RNA analogues (right panel) can be achieved by targeting splice motifs to exclude an exon to alter the reading frame or remove exons carrying mutations ( C) or strengthen exon selection, otherwise compromised by base changes ( D). 2?-O-MOE, 2?- O-(2-methoxyethyl); DMD, dystrophin; ISS-N1, intron splice silencer N1; PMO, phosphorodiamidate morpholino oligomer; PO, phosphodiester; PS, phosphorothioate; RISC, RNA-induced silencing complex; SMN2, survival motor neuron 2.

Натуральные нуклеиновые кислоты биологически лабильны и их использование для разработки лекарств требует химических модификаций оснований и остова нуклеиновых кислот, чтобы повысить резистентность к эндогенным нуклеазам и повлиять на активность. Phosphorothioate остов наиболее широко используется для химических модификаций (Figure 2), и хотя замена серы на non-bridging кислород обеспечивает нуклеазную стабильность, изменения в рибозомном фрагменте могут придать РНК-подобные характеристики и гидрофобность олигонуклеотиду (напр., 2'- O-methyl, 2'- O-methoxyethyl и 2'- O-fluoro). Phosphorothioate олигонуклеотиды несут сильный негативный заряд, позволяющий связывание различных белков и образование комплексов с катионовыми липосомами для эффективной трансфекции in vitro. Др. модификации нуклеиновых оснований и основной цепи могут придать специфические характеристики и механизмы действия и включать пептиды нуклеиновых кислот и phosphorodiamidate morpholino олигомеры (PMOs) ( Figure 2) , несущие нейтральный заряд, но обнаруживающие неэффективное потребление клетками (for review, see 5).



Figure 2. Natural and chemically modified nucleotides. Upper panel: DNA, RNA and phosphorothioate (sulphur substituted for a non-bridging oxygen)-modified nucleotide (PS DNA). Lower panel: 2'- O-methyl phosphorothioate (2'-OMePS), 2'- O-methoxyethyl phosphorothioate (2?-O-MOE-PS) and phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO).

Наиболее широко антисмысловые стратегии используют аналоги ДНК, которые активируют деградацию с помощью RNase H1 транскрипта мишени ( Figure 1), и тем самым подавляют экспрессию генов, или используют двунитчатые РНК, чтобы индуцировать молчание генов (см. обзор Shen and Corey ⁶). Концепция изменения места выбора сайта сплайсинга, чтобы модифицировать болезнь-вызывающие транскрипты была оценена in vitro более 25 лет назад⁷ и нуждалась в разработке и использовании аналогов РНК, которые целенаправленно воздействовали бы на мотивы мишени, участвующие в выборе экзона и в удержании в зелой мРНК. Антисмысловое целенаправленное воздействие на сайты сплайсинга или мотивы, необходимые для выбора экзона, может влиять на эндогенный альтернативный сплайсинг, блокировать аберрантный сплайсинг, исключать скрытый экзон или экзон, несущий мутацию, вызывающую болезнь, или восстанавливать открытую рамку считывания вокруг делеции, вызывающей сдвиг рамки, тогда как целенаправленное воздействие silencers может усиливать выбор экзона, тем или иным способом скомпроментированного заменой нуклеотида (for reviews, see 8, 9).

В настоящее время описаны два мРНК сплайсинг-модулирующие лекарства, способные предоставлять терапевтический эффект у ряда пациентов с мышечной дистрофией Дюшена (DMD)¹⁰ и у пациентов со спинальной мышечной атрофией (SMA)¹¹. Eteplirsen ( Exondys51), Sarepta Therapeutics, Cambridge, MA, USA) является антисмысловым PMO, который целенаправленно воздействует на мотивы энхансера сплайсинга в DMD пре-мРНК, чтобы исключить экзон 51 и восстановить рамку считывания дистрофиновой мРНК, разрушенную большими делециями, начинающимися в экзоне 52 или заканчивающиеся в экзоне 50. Eteplirsen был одобрен US Food and Drug Administration (FDA) в сент. 2016, но ещё не был использоан в Европе. Лекарство nusinersen ( Spinraza ®, Biogen, Cambridge, MA, USA) для лечения SMA является 2'- O-methoxyethyl антисмысловым олигонуклеотидом (AO) , воздействующим на phosphorothioate остов. Nusinersen целенаправленно воздействует на splice silencer ( ISS-N1) в интроне survival motor neuron 2 ( SMN2)⁷ и способствует выбору экзона 7 и удержанию во время сплайсинга пре-мРНК¹² и был одобрен FDA в дек. 2016. Почти 25-история разработки антисмысловых лекарств шла параллельно с увеличивающимся интересом к терапии редких болезней. Из пациентов, страдающих от более 6000 описанных редких болезней, лишь небольшая группа пациентов имеет эффективное лечение. Здесть рассматривается разработка ит сопрвемнное состояние AO лекарств, которые меняют выбор экзонов и вызывают терапевтический эффект по восстановлению или изменению структуры и функции белка.