WMZ: Z191701361450 WMR: R209318204033 |
Gene therapy-mediated enhancement of protective protein expression for the treatment of Alzheimer’s disease | |
---|---|
Alzheimer's disease (AD) является преимущественно нейродегенеративным нарушением, достигающим во всем мире к 2030 75 миллионов (Prince et al., 2015). AD характеризуется клинически прогрессирующим снижением памяти и когнитивной способности, приводящим в конечном итоге к гибели из-за осложнений, включая неправильное питание или пневмонию. Патологической характеристикой AD являются отложения внеклеточных амилоидных бляшек (преимущественно в неокортексе), состоящих из амилоидного-β (Aβ) пептида (Thal et al., 2002) и нейрофибриллярных переплетений (NFTs; возникающих в entorhinal кортексе) формируемых путем аномально фосфорилированных агрегатов белка tau, ассоциированного с микротрубочками (Braak & Braak, 1991). Бляшки и узелки могут развиваться в головном мозге за 30 лет до проявления клинических симптомов (Perl, 2010).
1.1. Abnormal protein aggregates are central to the aetiology of AD Две принятые гипотезы в принципе объясняют этиологию AD. 'Амилоидная гипотеза' (Hardy and Allsop, 1991, Selkoe, 1991) объясняет возникновение болезни аномальным накоплением в 39-43 аминокислоты Aβ-пептидов (Nunan & Small, 2000). Aβ-пептиды формируются путем расщепления amyloid precursor protein (APP), интегрального белка мембран, концентрирующегося на синапсах нейронов (Priller et al., 2006). APP может расщепляться протеолитически посредством amyloidogenic или the non-amyloidogenic пути (Fig. 1). В последнем случае, α-secretase семейства A Disintegrin And Metalloprotease (ADAM) инициирует juxta-мембранное расщепление по Lys16-Leu17 мостику внутри Aβ-пептидного региона (Anderson et al., 1991). Это генерирует растворимый APPα (sAPPα) и с мембраной связанный С-терминальный фрагмент (CTFα). Дальнейшее расщепление CTFα с помощью γ-secretase комплекса дает APP intracellular domain (AICD) и короткий P3 пептид (Chow et al., 2010).
Fig. 1. Inter-relationships between pathogenic events culminating in neuronal injury and disease exacerbation in AD. APP can be cleaved by ADAM10, forming neuroprotective sAPPα and, following γ-secretase cleavage, P3 and AICD. Alternatively, BACE1 cleavage results in Aβ-peptide formation, which can misfold and accumulate into oligomers and fibrils, leading to oxidative stress, neuroinflammation and tau hyperphosphorylation. Tau hyperphosphorylation can occur independently of Aβ-peptide accumulation, resulting in its dissociation from microtubules and accumulation in PHFs and NFTs. Pink boxes denote the detrimental effects of these pathways whilst green boxes denote mechanisms leading to reduced Aβ-peptide or tau accumulation. Yellow bolts denote putative therapeutic targets for gene therapy-mediated overexpression. На амилоидогенном пути APP расщепляется на N-конце до Asp1 в Aβ регионе с помощью β-secretase (β-site APP cleaving enzyme 1, BACE1), давая растворимый APPβ (sAPPβ) и CTFβ (Vassar et al., 1999). Последующее внутримембранное расщепление intramembrane cleavage of CTFβ с помощью γ-secretase комплекса, продуцируя AICD и Aβ-пептид, последний из которых существует в двух предпочтительных формах; многочисленной в 40 аминокислот формой (Aβ(1-40)) и в более гидрофобной в 42 аминокислоты форме (Aβ(1-42)), склонной к агрегации (Mori et al., 1992, Jarrett et al., 1993). Агрегированные Aβ первоначально формировали олигомеры прежде чем превратиться посредством промежуточных протофибрилл, чтобы сформировать зрелые фибриллы (Verma et al., 2015). Зрелые фибриллы первоначально, как полагают, вызывают нейротоксичность, обнаруживаемую при AD, но Aβ олигомеры впоследствии идентифицируются как первичные разновидности нейротоксичности (He et al., 2012, Nimmrich et al., 2008).
Амилоидная гипотеза подтверждается идентификацией мутаций в APP и генах PRESENILIN (PS1 and PS2), которые обусловливают предрасположенность к AD и ассоциированы с повышенными уровнями Aβ-пептидов или аномальных пептидов или высоким соотношением Aβ(1-42) к Aβ(1-40) (Goate et al., 1991, Lanoiselee et al., 2017). У здоровых индивидов, Aβ-пептиды быстро деградируют с помощью разных протеаз, которые коллективно нацелены на мономерные, олигомерные и фибриллярные формы (Saido & Leissring, 2012). Способность деградировать у Aβ-пептидов снижается с возрастом и вследствие оксидативных стрессов (Caccamo et al., 2005, Shinall et al., 2005, Wang et al., 2003) и она снижена у AD субъектов (Mawuenyega et al., 2010). Кроме того, очистка от Aβ-пептидов из головного мозга в кровообращение с помощью низкой плотности lipoprotein receptor-related protein 1 может быть дефектной при AD, хотя это остается спорным [Reviewed in Shinohara et al. (2017)]. Тем не менее неспособность к удалению Aβ-пептидов посредством процессов деградации или очистки приводит к их накоплению и агрегации в головном мозге.
Вторая гипотеза патогенеза AD предполагает, что избыточное фосфорилирование tau is является причиной болезни. Физиологически, фосфорилирование tau отвечает за полимеризацию и стабилизацию микротрубочек, ключевого компонента клеточного цитоскелета (Weingarten et al., 1975). В головном мозге человека, альтернативный сплайсинг гена MAPT дает 6 разных изоформ tau (Goedert et al., 1989). При AD все изоформы tau гиперфосфорилированы, в результате возникает диссоциация от микротрубочек и агрегация в параллельные спиральные филаменты (PHFs), которые представлены NFTs, характерными для AD (Grundke-Iqbal et al., 1986).
NFT переплетения из гиперфосфорилированных tau не могут связывать tubulin или способствовать формированию микротрубочек (Alonso et al., 2006). В своей non-fibrillised гиперфосфорилированной форме tau также препятствует связыванию менее фосфорилированным tau с tubulin. Это дестабилизирует имеющиеся микротрубочки и способствует формированию резистентных к деградации нерастворимых PHFs (Alonso et al., 1994, Yamada et al., 2015). Такое накопление нерастворимых tau нарушает транспорт по аксонам (Cabrales Fontela et al., 2017), нарушает интеграцию митохондрий (DuBoff et al., 2012) и нарушает синаптическую функцию (Zhou et al., 2017), приводя в конечном итоге к потере нейронов.
Амилоидная и tau гипотезы не являются взаимно исключающими. Напр., Aβ-пептиды могут индуцировать фосфорилирование tau посредством mitogen-activated protein kinase (MAPK) p38 или передачи сигналов glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) (Terwel et al., 2008, Zheng et al., 2002, Zhu et al., 2000). В самом деле, Aβ-индуцированный оксидативный стресс увеличивает экспрессию Regulator of Calcineurin 1 (RCAN1), которая подавляет calcineurin и способствует экспрессии GSK-3β (Lloret et al., 2011). Это увеличивает содержание GSK-3β и способствует нейротоксичности Aβ-пептидов (Koh et al., 2008).
Подавление calcineurin и усиление активности GSK-3β могут повышать уровни гиперфосфорилироанных tau, путем подавления дефосфорилирования tau и способствуя гиперфосфорилированию tau, соотв. (Wei et al., 2002). Сходным образом, Aβ-индуцированный оксидативный стресс увеличивает активацию MAPK p38 у APP/PS1 трансгенных мышей, подтверждая участие во многих механических действиях Aβ-пептида при гиперфосфорилировании tau (Giraldo et al., 2014).
1.2. AD-associated protein aggregates promote oxidative stress and neuroinflammation Оксидативные стрессы участвуют в патогенезе AD, возможно посредством связывания Cu2+ с Aβ-пептидами (Jiang et al., 2007), генерируя нейротоксические reactive oxygen species (ROS) , такие как HOo (Guilloreau et al., 2007). ROS окисляют липиды, белки и ДНК (Dorfman & Adams, 1973), приводя к гибели клетки посредством переокисления мембранных липидов, нарушений клеточного метаболизма или повреждений митохондриальной ДНК (Markesbery, 1997, Tramutola et al., 2017).
Воспаление нейронов также является критическим при AD (Rogers et al., 1988). Aβ олигомеры и фибриллы соединяются с рецепторами иммунных клеток, такими как CD14, CD36, scavenger receptor A и toll-like receptors 4 и 6 (Hickman et al., 2008, Liu et al., 2005b, Stewart et al., 2010), заставляя клетки микроглии высвобождать способствующие воспалению цитокины и мигрировать в бляшки, чтобы фагоцитировать Aβ-пептиды в попытке устранить их (Stalder et al., 1999). Астроциты также высвобождают цитокины и nitric oxide (NO), которые накапливаются вокруг Aβ-пептидов, откладывающихся в головном мозге (Beach & McGeer, 1988). По мере прогрессирования болезни, хроническая активация иммунных клеток головного мозга приводит к устойчивой продукции молекул, способствующих воспалению и снижает очистку от Aβ (Hickman et al., 2008). Недавно установлено, что tau также участвует в воспалении нейронов, что сопровождается их совместной локализацией с астроцитами и микроглией (Nilson et al., 2017). В культурах глиальных клеток, укороченные tau повышают уровни NO и активируют путь MAPK, приводя к гиперфосфорилированию tau (Zhu et al., 2000), и повышению способствующих воспалению цитокинов, включая interleukin-1β (IL-1β), IL-6 и tumour necrosis factor α (TNFα) (Kovac et al., 2011).
Следовательно, отложения Aβ и гиперфосфорилирование tau вносят вклад в оксидативные стрессы и воспаление нейронов, что еще больше обостряет болезнь.
1.3. Current drug treatments for AD are limited to symptomatic relief 4 лекарства сегодня лицензированы для лечения AD. Ингибиторы acetylcholinesterase (donepezil, rivastigmine и galantamine) усиливают холинергическую нейротрансмиссию и компенсируют холинергическую нейродегенерацию (Mehta et al., 2012), тогда как неконкурентноспособный рецептор N-methyl-D-aspartate (NMDA) , антагонист memantine, ограничивает вызываемую excitotoxicity нейродегенерацию (Schmitt, 2005, van Marum, 2009). Ни одно из них не излечивает, а лишь временно снижает симптоматику AD (Areosa et al., 2005, Farlow, 2002). Лечеие, нацеленное на причинные факторы AD, крайне необходимо.
Пока многие низкомолекулярные лекарства и лечение с помощью белков и пептидов дошли до клинических испытаний, немногие попытки достичь успеха при AD оказались неэффективны, сопряжены с побочными эффектами и осложнениями (Mehta et al., 2017). AD является длительной болезнью, которая делает возможной индуцибельную активацию терапевтических белков (напр., с помощью генотерапии) (Nikol & Huehns, 2001). Генотерапия может быть связанной с: (1) замещением известного поврежденного аллеля функциональной копией или (2) усилением экспрессии благоприятных белков (Somia & Verma, 2000). Т.к. AD в основном идиопатические, то в первую очередь лечение д. касаться тех немногих с семейным наследованием, затем только использовать для более широкого круга пациентов (summarised in Table 1).
Table 1. Summary of potential gene therapies for AD discussed in this review. 2. Enhancing protective protein expression by gene therapy for AD 2.1. Gene therapies that modulate pathogenic protein aggregation as potential treatments for AD 2.1.1. Reducing the generation of Aβ-peptides Хотя разработано несметное число лекарств, которые механистически ослабляют функцию β- или γ-secretase (rev. Zhao et al., 2020), при этом существует мнение, что снижение генерации Aβ-пептидов мало, если вообще, приводит к нормализации когнитивной способности у пациентов (reviewed in Zhao et al., 2020, Kumar et al., 2018, Selkoe, 2019). Такая неэффективность такая же как при недавнем клиническом испытании, продемонстрировавшем неспособность ингибиторов BACE1, таких как MK8931, AZD-3293, JNJ-54861911, E2609 и CNP520 , которые не только продемонстрировали низкое клиническое значение для улучшения когнитивной способности, но и в некоторых случаях даже ухудшали когнитивную способность (Moussa-Pacha et al., 2020, Wessels et al., 2020).
Неожиданно обнаружены небольшие терапевтические возможности по улучшению экспрессии защитного белка для снижения генерации Aβ-пептидов. Регуляция протеолиза APP оказалась тесно связанной с метаболизмом холестерина и латеральной сегрегацией белка и его секретаз между липидными платформами (raft) и non-raft регионами клеточных мембран (rev. Arbor et al., 2016). Удаление холестерина из головного мозга зависит от превращения липидов в 24S-hydroxycholesterol (24S-HC), который2 в отличие от холестерина, может свободно пересекать энцефало-гематологический барьер. 24S-HC, генерируемый из холестерина с помощью cholesterol 24-hydroxylase (кодируемой геном CYP46A1), как было установлено, усиливает активность α-secretase и повышает соотношение активности α - к β-secretase (Famer et al., 2007). Hudry et al. (2010) впоследствии показали, что адено-ассоциированным вирусом генотерапия с помощью CYP46A1 снижает амилоидную патологию как до, так и после отложения бляшек у APP23 трансгенных мышей. Авт. далее подтвердили, что механистически феномен может быть связан со снижением рекрутирования APP и presenilin 1 в липидные платформы. Сходным образом, избыточная экспрессия у APP/PS1 трансгенных мышей транскрипционного фактора Forkhead box O1 (FoxO1), участвует в регуляции клеточного роста, дифференцировки и метаболизма, и, как было установлено, существенно снижает продукцию Aβ-пептида посредством ослабления процессинга амилоидогенных APP с помощью β-и γ-secretases (Zhang et al., 2020).
Изменения в морфологии и функции эндосом являются ранними событиями в в пораженном AD головном мозге (rev. Nixon et al., 2000) А лизосомный компартмент оказывается связанным с прогрессированием болезни из-за снижения очищения с помощью аутофагии и накоплением лизосомных cathepsins в амилоидных бляшках (Nixon and Cataldo, 2006). Следовательно, вполне возможно, что усиление экспрессии белков, способствующих лизосомной функции, может представить жизненно важную терапию AD , хотя подобные глобальные клеточные изменения могут быть непредвиденными и нежелательными последствиями. Однако, некоторый прецедент в этом отношении известен. Annunziata et al. (2013) показали, что мыши, дефицитные по лизосомной sialidase neuramindase 1 (NEU1) спонтанно формируют амилоидные бляшки. Авт. полагают, что это является результатом накопления в лизосомах 'oversialylated' формы APP (приводящего к усилению амилоидогенного процессинга белка) вместе с усиленным внеклеточным высвобождением A β-пептидов благодаря избыточному экзоцитозу лизосом. Более важно то, что в контексте данного обзора аденовирусом обусловленное восстановление экспрессии NEU1 у 5XFAD мышей посредством stereotactic инъекций в гиппокамп возникает драматическое снижение патологии бляшек, приведшее авт. к заключению, что усиление экспрессии NEU1 может представлять собой новый терапевтический подход при AD.
Однако, по мере усиления экспрессии защитного белка с целью снижения генерации A β-пептида большинство исследований было проведено на non-amyloidogenic семействе секретаз ADAM. Некоторые члены семейства ADAM участвуют как потенциальные α-secretases, включая ADAMs 8, 9, 10, 17, 19 и 33 (rev. Gough et al., 2011), однако, только в случае ADAM10 избыточная экспрессия белка in vivo, как было установлено, приводит заметному снижению числа бляшек из A β-пептида у животных моделей (Postina et al., 2004). Интерсно, что ADAM9 , как было установлено, впервые вызывает усиление продукции sAPP α в культуре клеток (Koike et al. 1999), но впоследствии было показано, что для этого необходимо присутствие ADAM10 с его способностью расщеплять APP и PrP (Cisse et al., 2005). Наша группа впервые показала, что ADAM9 способен протеолитически удалять ADAM10 с клеточной поверхности (Parkin & Harris, 2009), это до некоторой степени парадоксально, принимая во внимание, что это первый энзим , как было установлено, усиливает генерацию sAPP α (Koike et al., 1999). Это еще больше было усложнено последующим подтверждением, что ингибирование ADAM9 с использованием рекомбинантной формы его prodomain, повышает ассоциированные с мембраной уровни ADAM10, приводя к усилению α-secretase процессинга APP (Moss et al., 2011). Пока это последнее наблюдение не может объяснить кажущийся парадокс, но он открывает возможность усиления экспрессии ADAM9 prodomain, как потенциальной генотерапии при AD. Более того, недавняя публикация Scharfenberg et al. (2019) показала, что растворимый ADAM10 способен деградировать sAPP α но не полной длины APP, это указывает, что ADAM9-обусловленное удаление (shedding) ADAM10 может не только способствовать процессингу амилоидогенного APP, но и также приводить к снижению уровней защитного sAPP α фрагмента, делая упомянутую выше стратегию по использованию ADAM9 prodomain всё более привлекательной.
Несмотря на то, что др. члены семейства ADAM участвуют в разной степени в α -secretase активности, ADAM10 остается главной мишенью для воздействия с целью усиления экспрессии белка, чтобы редуцировать продукцию A β-пептида (Peron et al., 2018), при этом мутации потери функции в ADAM10 оказываются ассоциированными с поздним началом AD (Kim et al., 2009). Потенциальное значение этого подхода подтверждается данными по APP[V717I] трансгенным мышам с избыточной экспрессией ADAM10, у которых обнаруживается снижение нагрузки A β бляшек и улучшение обучения и памяти в сравнимым с контролем (Postina et al., 2004).
Однако, повышение уровней ADAM10 было обстоятельно ассоциировано с усилением прогрессии рака, возможно в результате роли энзима в передаче сигналов Notch (Gavert et al., 2007, Guo et al., 2012, Yuan et al., 2013). Это может частично объяснить , почему перенос гена ADAM10 не вызывает дальнейший прогресс в качестве терапии AD у людей.
Интерсно, что предписываемые лекарства и низко-молекулярного веса молекулы, усиливающие экспрессию ADAM10 [Rev. Wetzel et al. (2017)], включая fibrates и retinoids, не повышая показателей рака (Bonovas et al., 2012). Фактически, ретиноиды оказывают терапевтический благоприятный эффект при раке груди, меланоме и раке простаты (Tang & Gudas, 2011), а в двух крупных исследованиях fibrates описывается обратная ассоциация с показателем рака печени (Li et al., 2019, Iakobishvili et al., 2019). В целом эти исследования подтверждают, что усиление ADAM10 не способствует возникновению рака in vivo.
Более того, нежелательные эффекты, оказываемые ADAM10 на передачу сигналов Notch могут быть смягчены с помощью специфически нацеленных энзимов на липидные платформы (rafts) (предполагаемое место генерации A β-пептидов), используя синтетические glycosylphosphatidylinositol (GPI)-закрепленные формы. В самом деле, GPI-закрепленные ADAM10, нацеленные на rafts, снижают процессинг амилоидогенных APP в SH-SY5Y клетках (Harris et al., 2009).
Пока ADAM10 тестируется в качестве генотерапии, лентивирусом обеспечиваемый перенос гена peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ)-coactivator-1α, как было установлено, повышает уровни мРНК ADAM17 у APP23 трансгенных мышей (Katsouri et al., 2016). Интересно, что эти мыши с избыточной экспрессией ADAM17 обнаруживают меньше A β бляшек, пониженную активацию микроглии и улучшение памяти пространственного распознавания, подтверждая тем самым потенциальное терапевтическое значение такого подхода. 2.1.2. Inhibiting A β-peptide aggregation Прионовый белок (PrP) является гликопротеином клеточной поверхности с функциями нейрональной дифференцировки , поддержания миелина и защиты от стресса (Castle & Gill, 2017). Хотя и спорно (Calella et al., 2010, Ciss? et al., 2011, Kessels et al., 2010), но PrP может частично вызывать токсические эффекты A β-пептидов (Barry et al., 2011, Gimbel et al., 2010, Kudo et al., 2012, Laur?n et al., 2009), действуя как рецептор клеточной поверхности [Rev. (Salazar & Strittmatter, 2017)]. ADAM10 частично ответственен за устранение PrP с клеточной мембраны, продуцируя растворимую форму (Taylor et al., 2009), которая помимо предупреждения токсичности обеспечивает связанный с мембраной PrP, а также мешает агрегации A β-пептидов и нейротоксичности (Altmeppen et al., 2013, Nieznanski et al., 2012). Более того, PrP расщепление с помощью ADAM10/ADAM17 дает N-терминальный фрагмент (N1) (Vincent et al., 2001), который связывает A β олигомеры, чтобы ингибировать fibrillisation (in vitro) и ослабить дефицит памяти у мышей (Fluharty et al., 2013). Перенос генов или растворимого PrP или N1 всё ещё исследуется, но может представлять собой терапевтическую возможность для AD путем предупреждения PrP-обусловленной нейротоксичности A β-пептидов и снижения накопления A β-gtgnbljd. Более того, усиление активности upregulating ADAM10/ADAM17 (section 2.1.1), также может смягчать патологию AD как посредством удаления с мембраны связанного с ней PrP, так и путем генерации нейрозащитного фрагмента N1, независимо от каких-либо эффектов на продукцию A β-пептидов.
Наконец, имеются ограниченные дополнительные доказательства, подтверждающие, что избыточная экспрессия различных хит-шоковых белков (HSPs) может быть благоприятной для лечения болезни Альцгеймера. HSPs могут взаимодействовать с A β-пептидами, чтобы предупреждать их агрегацию и могут также подавлять агрегацию tau (Dou et al., 2003, Wilhelmus et al., 2007). HSP70 и HSP90 являются наиболее изученными HSPs при AD, а уровни HSP70 повышены при AD (Koren et al., 2009, Son et al., 2015). Однако, исследования AD преимущественно касались ингибиторов HSP [Rev. Campanella et al. (2018)]. Это может быть обусловлено наблюдаемым усилением активности HSP70 в AD головном мозге и возможно дефектные шапероны способствуют прогрессированию болезни скорее, чем её ослаблению (Marino Gammazza et al., 2016). Поскольку генотерапия с помощью избыточной экспрессии специфических HSPs может представлять собой способ предупреждения накопления A β-пептидов, то мы прежде всего нуждаемся в глубоком понимании индивидуальных и общих функций HSP в патогенезе AD. 2.1.3. Enhancing A β-peptide degradation and clearance В то время как неспособность BACE1 ингибитора продемонстрирована в клинических испытаниях, необходима альтернативная стратегия для снижения продукции A β-пептидов, необходимы альтернативные стратегии элиминации после генерации этих пептидов, что демонстрируется неспособностью многих анти-амилоидных антител в клинических испытанаиях (Rev. Aisen et al., 2020). В 2019, Biogen сообщил о завершении двух клинических испытаний с анти-A β пептидными моноклональными антителами aducanumab, при этом отсутствовал успех или наблюдалась 'бесполезность'. Biogen сегодня сотрудничает с U.S. Food and Drug Administration (FDA) для одобрения регулирующими органами препарата на основе последующих расширенных анализов, которые якобы показали замедление когнитивного снижения у участников, получавших более высокую дозу в течение более длительного периода времени. Однако, провал клинических испытаний в последние годы многих др. анти-амилоидных антител, таких как gantenerumab и crenezumab (both Roche), solanezumab и donanemab (both Eli Lilly) и BAN 2401 (Eisai) не предвещают ничего хорошего от такого терапевтического подхода, несмотря на очень недавние попытки воскресить некоторые из этих лекарств, исходя из маргинальных эффектов у некоторых участников подгрупп. Имеется поэтому настоятельная необходимость в альтернативных подходах по элиминации A β-пептидов из головного мозга.
Уровни Aβ-пептидов тонко регулируются набором протеаз (Saido & Leissring, 2012), среди которых zinc metalloendopeptidase, neprilysin (NEP), ответственны за большую часть деградации A β-пептидов (Howell et al., 1995). Совместимым с NEP является скорость-ограничивающий энзим катаболизма Aβ (Takaki et al., 2000), снижение экспрессии NEP связано с увеличением количества Aβ бляшек в головном мозге умерших с AD (Grimm et al., 2013). Напротив, herpes simplex virus (HSV), лентивирусный и адено-ассоциированным вирусом (AAV)-обеспечиваемый перенос гена NEP трансгенным APP модельным мышам вызывал снижение отложений Aβ-пептидов, уровней IL-6, активации астроцитов и улучшение функции памяти (El-Amouri et al., 2008, Hong et al., 2006, Iwata et al., 2013, Marr et al., 2003, Spencer et al., 2008). В целом, эти исследования предоставили убедительные доказательства возможности лечения избыточной экспрессией, NEP при AD.
Параллельно с NEP, zinc metalloendopeptidases endothelin converting enzymes (ECE)-1 и -2 также участвуют в катаболизме Aβ (Eckman et al., 2001). Индивиды, гомозиготные по C338A полиморфизму, который усиливает активность промотора ECE1 обнаруживают более низкий риск возникновения AD (Funalot et al., 2004). Соотв., усиление активности ECE1 посредством внутричерепного введения с использованием рекомбинантного AAV снижало общие уровни Aβ-пептидов головном мозге APP/PS1 мышей на 50% (Carty et al., 2008). Потенциальные эффекты переноса гена ECE1 на воспаление нейронов и нарушения памяти нуждаются в дальнейшем исследовании.
Очищение от Aβ пептидов через гемато-энцефалический барьер в кровообращение обеспечивается с помощью apolipoprotein E (ApoE) (Kline, 2012). В головном мозге, ApoE прежде всего экспрессируется астроцитами (Grehan et al., 2001). Существуют три распространенные изоформы ApoE; ApoE2 (Cys112, Cys158), ApoE3 (Cys112, Arg158) и ApoE4 (Arg112, Arg158) (Rall et al., 1982). ApoE4 повышает риск AD у гетерозиготных носителей в 2-3 раза и в 14 раз у гомозиготных индивидов, тогда как аллель ApoE2 снижает риск, при этом APOE генотип оказывается сильным фактором риска для AD (Farrer et al., 1997). Lin et al. (2018) использовали CRISPR/Cas9 редактирование гена, чтобы получить линию изогенных induced pluripotent stem cell (iPSC), гомозиготных по APOE4 из незатронутых родительских APOE3 клеток. Нейроны, происходящие из первых iPSCs, обладали повышенной секрецией Aβ-пептидов по сравнению с родительскими клетками, тогда как сходным образом происходящие астроциты обладали нарушенным потреблением Aβ-пептидов. Клетки микроглии, происходящие из отредактированных iPSCs, также обладали довольно пониженным потреблением Aβ-пептидов и повышенной активацией воспалительных генов. Напротив, авт. также наблюдали, что превращение APOE4 в APOE3 в клетках головного мозга, произошедших из спорадических AD iPSCs ослабляло многие связанные AD патологии. Дополнительные исследования с использованием CRISPR/Cas9 редактирования происходящих из iPSC нейронов показали, что токсическая избыточная функция APOE4 ответственна за связанную с AD патологию, т.к. такие изменения могут в основном смягчаться после редактирования в APOE3 (Wang et al., 2018, Wadhwani et al., 2019).
Поскольку редактирование генов, ослабляющее токсические эффекты ApoE4, подают надежду и активно исследуется на пре-клинически моделях, тот факт, что ApoE2, по-видимому, защищает от возникновения AD и является наиболее эффективным в очистке от Aβ-пептидов из головного мозга (Castellano et al., 2011) это уже привело к исследованию переноса гена ApoE2 в пре-клинических моделях AD. В первом исследовании лентивирусом управляемая экспрессия ApoE2 у PDAPP трансгенных мышей снижала общее количество Aβ-пептидов по сравнению с GFP и ApoE4 контролем (Dodart et al., 2005). Недавно AAV-управляемая экспрессия ApoE2 продемонстрировала поддержание синаптических уплотнений у APP/PS1 мышей (Hudry et al., 2013) и AAV-обусловленное усиление ApoE2 у PDAPP мышей также снижало ApoE4-ассоциированную патологию Aβ-пептидов в зависимости от экспрессии ApoE2 и уже существующей амилоидной патологии (Zhao et al., 2016). Т.к. введение в желудочки головного мозга является оптимальным методом AAV-опосредованной доставки гена у не человеко-образных обезьян (Rosenberg et al., 2018), то phase I клинического испытания была инициирована в 2019, с ApoE2-экспрессирующим AAV вектором, вводимым в желудочки головного мозга 15 ApoE4 гомозиготным индивидам (NCT03634007).
2.1.4. Decreasing tau phosphorylation Комплементарным подходом для снижения накопления Aβ-пептидов является индукция дефосфорилирования tau с помощью serine/threonine фосфатаз. Потенциальное значение такого подхода подчеркивается некоторые недавними публикациями, выявивших tau фосфорилированые по threonine-217 (p-tau217) как потенциальный биомаркер для AD. В самом деле, уровни p-tau217 и p-tau181 были описаны как повышенные две декады тому назад перед появлением патологии агрегированных tau (Bath?lemy et al., 2020), но первый после количественной оценки в спинно-мозговой жидкости был определен как лучший биомаркер AD (Janelidze et al., 2020). Более того, в плазме p-tau217 оказался повышенным на ранней стадии AD (Mattsson-Carlgren et al., 2020) и позволял четко отличить болезнь от др. нейродегенеративных нарушений (Palmqvist et al., 2020).
Protein phosphatase 2A (PP2A) объясняет ~ 70% дефосфорилирующей активности tau (Liu et al., 2005a), которая снижается до ~ 30% в AD головном мозге (Gong et al., 1995), в соответствии с понижением уровней PP2A мРНК в гиппокампе AD пациентов (Vogelsberg-Ragaglia et al., 2001). Исследования на мышах продемонстрировали, что индуцируемое голоданием подавление PP2A вносит вклад гиперфосфорилирование tau , даже если tau киназы, такие как GSK-3β, подавлены (Planel et al., 2001). Следовательно, усиление активности PP2A скорее, чем подавление tau киназ, может стать опцией для лечения AD.
Активность PP2A, модулируется с помощью устойчивого к теплу ингибитора 1 (I1PP2A) и 2 (I2PP2A) с разной эффективностью по определенным местам фосфорилирования tau (Li et al., 1995, Tsujio et al., 2005). Лентивирусные векторы, экспрессирующие I2PP2A siRNA были разработаны, чтобы усилить активность PP2A у пациентов с AD. Инъекции в гиппокамп I2PP2A siRNA снижали гиперфосфорилирование tau по многим остаткам, снижали активацию GSK-3β улучшали плотность шипов на нейронах и устраняли дефицит памяти у трансгенных мышей с tau человека (Zhang et al., 2014).
Однако, PP2A имеет разные субстраты, влияющие на функции клеток, такие как передача сигналов β-catenin, на активность p53 опухолевого супрессора и накопление c-Myc [Rev. Virshup and Shenolikar (2009)]. Т.о., в то время как побочные эффекты нерегулируемой экспрессии PP2A неизвестны, они могут быть обширны. Необходимы дальнейшие исследования PP2A и др. изоформ фосфатаз, специфически участвующих в дефосфорилировании tau (Sontag & Sontag, 2014).
2.1.5. Enhancing tau clearance Снижение гиперфосфорилирования tau может быть также достигнуто путем усиления очистки посредством протеолитических и деградирующих механизмов. Исследования in vitro продемонстрировали расщепление мономерного tau с помощью протеазы thrombin, calpain и puromycin-sensitive aminopeptidase (Khlistunova et al., 2006, Liu et al., 2011, Sengupta et al., 2006). Однако, некоторые продукты протеолиза tau сами по себе являются токсичными (Garg et al., 2011, Khlistunova et al., 2006, Wang et al., 2007), необходима глубокая деградация с помощью протеосомных и аутофагических механизмов для нейтрализации.
Tau может быть также очищен с помощью аутофагии (Wang & Mandelkow, 2012). Безусловно пре-лизсомные аутофагические вакуоли многочисленны в головном мозге при AD, подтверждая, что аутофагия индуцируется при AD, что созревание лизосом нарушено, тем самым сильно нарушается нейрозащитное действие аутофагии в отношении очистки tau (Nixon et al., 2005). Индукция аутофагии, по-видимому, может служить потенциальной возможностью лечения, поэтому необходимы дальнейшие исследования. Используя генотерапию, избыточную экспрессию модуляторов аутофагии, было успешно осуществлено на модельных грызунах [Rev. Levine et al. (2015)]. Напр., управляемая избыточная экспрессия транскрипционного фактора EB (TFEB), с помощью инъекции AAV-TFEB вектора в substantia nigra у PD крыс, приводит к экспрессии TFEB и повышению уровней мРНК лизосомных маркеров в dopaminergic нейронах, подтверждая повышенную активность autophagy-lysosomal пути (Decressac et al., 2013). Важно, что экспрессия лизосомных маркеров подтверждает прогрессию аутофагии посредством стадии деградации, указывая тем самым, что перенос гена TFEB gene может способствовать деградации tau при AD.
Наконец, генотерапией обеспечиваемая избыточная экспрессия parkin, белка, ответственного за трафик митохондрий в околоядерный регион для аутофагии (Vives-Bauza et al., 2010), была испытана пре-клинически при AD. 3xTg-AD трансгенные мыши получали с помощью лентивирусного вектора избыточную экспрессию parkin, что обеспечивало повышение уровней белков, связанных с аутофагией в течение 3-х мес. после инъекции и снижение уровней Aβ-пептидов (Khandelwal et al., 2011).
Многочисленные исследования при др. болезнях продемонстрировали. что способствование аутофагии возможно и эффективно (Levine et al., 2015, Byun et al., 2017). Однако, поскольку аутофагия вносит вклад в клеточную гибель, то дальнейшие исследования необходимы для проверки безопасности индукторов аутофагии при AD (Levine et al., 2015).
2.2. Gene therapies that modulate neuroinflammation as potential treatments for AD 2.2.1. Anti-inflammatory cytokines Критическим компонентом воспаления нейронов в AD-затронутом головном мозге является продукция способствующих воспалению цитокинов путем активации микроглии и астроцитов. Однако, роль противо-воспалительных цитокинов в патологии AD очень неясна (Domingues et al., 2017). Напр., кратковременная AAV-обусловленная экспрессия противо-воспалительного цитокина IL-4 у трансгенных TgCRND8 модельных мышей усиливает отложения Aβ-пептидов (Chakrabarty et al., 2012), но долговременная экспрессия у APP/PS1 мышей достоверно снижает накопление микроглии, astrogliosis и груз Aβ-пептидов (Kiyota et al., 2010). Сходным образом, AAV-обеспеиваемая доставка мышиного IL-10 гена APP/PS1 мышам супрессировала astrogliosis, усиливала нейрогенез и устраняла дефицит пространственной обучаемости (Kiyota et al., 2012). Однако, сложные взаимоотношения между уровнями IL и 10 и AD-родственной патологией могут существовать, поскольку дефицит белка у APP/PS1 мышей, как было установлено, усиливает микроглиальный фагоцитоз Aβ-пептидов и устраняет поведенческие нарушения (Guillot-Sestier et al., 2015). Это подтвержздает сложные взаимоотношения между уровнями противо-воспалительных цитокинов и важной для AD патологией, которые могут быть независимыми по своим эффектам на Aβ-пептиды.
2.2.2. Trem2 Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) является трансмембранным рецептором, экспрессирующимся на миелоидных клетках, включая микроглию (Colonna and Wang, 2016, Schmid et al., 2002). Стимуляция TREM2 у мышей преимущественно в культурах микроглии усиливает фагоцитоз, тогда как снижает экспрессию, способствующих воспалению, цитокинов TNF-α и IL-1β (Takahashi et al., 2005). Мутация R47Hв TREM2, которая может вызывать снижение уровней мРНК (Cheng-Hathaway et al., 2018), повышать риск позднего начала AD в 2-3 раза (Carmona et al., 2018). Интересно, что избыточная экспрессия TREM2 посредством лентивирусного переноса гена APP/PS1 мышам, достоверно редуцирует плотность Aβ бляшек, снижая уровни способствующих воспалению цитокинов и улучшая пространственную память (Jiang et al., 2014). Это исследование подчеркивает потенциал TREM2 генотерапии при AD, но необходимы дальнейшие исследования.
2.3. Gene therapies modulating neurotrophic and neuroprotective factors as potential treatments for AD 2.3.1. sAPP α sAPP α, генерируется путем не-амилоидогенного протеолиза APP, участвует в нейрогенезе, развитии и пластичного головного мозга [Reviewed in Dar and Glazner (2020)]. Нейрозащитное действие sAPPα in vivo включает усиление жизнеспособности нейронов, защиту от ROS и снижение glutamate-обусловленной excitotoxicity (Araki et al., 1991, Goodman and Mattson, 1994, Mattson et al., 1993). Более того, имеющиеся доказательства подтверждают, что sAPP α подавляет BACE1, теоретически снижая процессинг амилоидогенного APP (Obregon et al., 2012). Перенос гена sAPPα, с использованием AAV вектора исследовали на APP/PS1 трансгенных мышах. Направленная избыточная экспрессия sAPPα у таких мышей частично снижает количество Aβ, улучшает синаптическую пластичность и восстанавливает дефицит пространственной памяти. Наблюдалось увеличение рекрутирования в микроглию амилоидных бляшек, указывая тем самым на возможность усиления фагоцитоза Aβ-пептидов (Fol et al., 2016).
2.3.2. Neurotrophins Нейротрофины являются факторами роста, важными для пролиферации, жизнеспособности, дифференцировки и миграции нейронов (Kerschensteiner et al., 2003). Кроме того, они играют роль в развитии и синаптической пластичности (Ledda & Paratcha, 2016). Первым среди них был открыт nerve growth factor (NGF) (Levi-Montalcini & Angeletti, 1963), способствующий выживанию холинергических нейронов после повреждений (Aloe et al., 2015). Это особенно интересно, принимая во внимание дегенерацию холинергических нейронов при AD, роль этого подтипа нейронов в когнитивных симптомах при нарушениях и тот факт, что лекарства, нацеленные на эти симптомы, являются эффективными для воздействия на симптомы (Whitehouse et al., 1981, Whitehouse et al., 1982). Следовательно, NGF участвует в качестве терапии AD как средство сохранения холинергической нейротрансмиссии. Перенос гена NGF является широко исследуемым вопросом во многих пре-клинических исследованиях (Bishop et al., 2008, Blesch et al., 2005, Fischer et al., 1987, Kordower et al., 1994)[Rev. Tuszynski (2007)] и некоторых клинических исследованиях. Результаты первого клинического исследования гена NGF получены в 2005 (NCT00017940), после ex vivo доставки NGF 8 пациентам на ранней стадии AD; величина когнитивных нарушений у пациентов снижалась без побочных явлений (Tuszynski et al., 2005). Вторая phase I клинического испытания (NCT00087789) продемонстрировала безопасность AAV-обеспечиваемой доставки NGF, в дополнение к зависимому от дозы снижению когнитивных нарушений (Rafii et al., 2014). Исследования головного мозга умерших пациентов в обоих исследованиях выявили разрастания холинергических аксонов в местах доставки NGF, демонстрируя, что дегенерирующие нейроны всё ещё могут отвечать на факторы роста (Tuszynski et al., 2015). Фаза II испытания (NCT00876863) оказалась неспособной продемонстрировать существенное улучшение в нейронах в качестве первичного клинического исхода (Rafii et al., 2018). Однако, патологический анализ показал, что хотя целенаправленное воздействие инъекций было аккуратным в большинстве случаев, ограниченное распространение AAV-NGF от места инъекции не позволяет NGF достигать холинергические нейроны (Castle et al., 2020).
Второй нейротрофин, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), частично осуществляет свои эффекты посредством модуляции процессов воспаления нейронов. BDNF избыточная экспрессия снижает уровни способствующего воспалению цитокина TNF-α, тогда как повышает уровни противо-воспалительных цитокинов IL-4, IL-10 и IL-11 (Makar et al., 2009). BDNF синтезируется во многих регионах головного мозга, включая entorhinal кортекс, где он антероградно переносится в гиппокамп (Leal et al., 2017). Уровни белка BDNF снижены в entorhinal коре и гиппокампе AD-затронутого головного мозга (Hock et al., 2000, Narisawa-Saito et al., 1996). BDNF генотерапия у моделей AD. Nagahara et al., продемонстрировали, что лентивирусом обеспечиваемый перенос гена BDNF J20 трансгенным мышам устраняет потерю синапсов и нарушения памяти независимо от эффектов на уровень Aβ-пептидов, при этом сходные эффекты наблюдали у модельных крыс и приматов (Nagahara et al., 2009). Внесение в гиппокамп, опосредованное вектором Sendai viral (SeV) Tg2576 трансгенным мышам подтвердило эти находки (Iwasaki et al., 2012). Первое исследование было повторено у более молодых мышей с более ранним применением BDNF и предупреждало потерю нейронов, при этом эффекты были независимыми от уровня Aβ-пептида (Nagahara et al., 2013). Недавно, magnetic resonance imaging были использованы, чтобы отследить доставку AAV-BDNF в entorhinal кортекс non-human приматов, чтобы целенаправленно максимизировать экспрессию. Такая доставка повышает мечение BDNFв dentate gyrus гиппокампа, но функциональные и поведенческие последствия не были описаны (Nagahara et al., 2018). Помимо этих целенаправленных и избирательных манипуляций с BDNF, косвенное увеличение экспрессии BDNF с помощью генотерапии также было исследовано; наблюдались повышенные уровни CREB (cyclic adenosine monophosphate-response element binding protein) связанного белка (CBP) посредством лентивирусной доставки, индуцирующей экспрессию BDNF и восстановление нарушений обучения и памяти у 3xTg-AD мышей (Caccamo et al., 2010).
В целом, эти результаты базируются на прямой или косвенной избыточной экспрессии BDNF, ценном кандидате для лечения AD. Важно, что MRI-наводимые инъекции могут предупредить неаккуратное использование и улучшить ограниченное распространение NGF.
2.3.3. Progranulin Progranulin является трофическим фактором, способствующим развитию нейронов, жизнеспособности и росту нейритов (Van Damme et al., 2008), помимо модуляции воспаления нейронов (Yin et al., 2010). Мутации гена GRN, кодирующего progranulin , строго ассоциируют с frontotemporal dementia (Mackenzie et al., 2006, Yu et al., 2010) и являются также факторами риска AD (Perry et al., 2013). P301L tau трансгенные мыши, гемизиготные по GRN, обнаруживают усиленное фосфорилирование tau (Hosokawa et al., 2015), хотя внесение GRN гемизигот APP трансгенным мышам действительно снижает накопление Aβ-пептида (Hosokawa et al., 2018).
Применение GRN с использованием AAV-опосредованной генотерапии снижало microgliosis и улучшало лизосомные аномалии у трансгенных модельных мышей с frontotemporal деменцией (Arrant et al., 2018). AAV-GRN недавно был разрешен для использования в клинических испытаниях для лобно-височной деменции (Prevail Therapeutics, 2020). Распространение этой генотерапии на AD могло бы подтвердить целительное действие благодаря снижению гиерфосфорилирования tau и воспаления нейронов. 2.3.4. Glucagon-like peptide 1 (GLP1) signalling GLP-1 является incretin гормоном, преимущественно синтезируемым в кишечнике и высвобождаемым в кровоток после приема пищи (Yildirim Simsir et al., 2018). В головном мозге GLP-1 является фактором роста, который способствует жизнеспособности, пролиферации и репарации за счет подавления апоптоза (Perry and Greig, 2004, Sharma et al., 2014). После соединения со своим рецептором активация нижестоящего сигнального пути содействует передаче сигналов инсулина и достигает своей кульминации ингибированием GSK-3α (Mussmann et al., 2007).
Многие исследования продемонстрировали потенциальную нейрозащитную роль GLP-1 при AD [Reviewed in Yildirim Simsir et al. (2018)]. Напр., подавление GSK-3α с помощью GLP-1 снижает зависимое от возраста гиперфосфорилирование tau у диабетических трансгенных модельных мышей (Ma et al., 2015). GLP-1 воздействие снижает уровень внутриклеточных A β-пептидов в PC12 клетках и защищает первичные культивируемые нейроны от вызываемых A β повреждений (Perry et al., 2003). У APP/PS1 мышей, Liraglutide, агонист GLP-1, снижает уровень A β бляшек и восстанавливает обучаемость и память (McClean et al., 2011). Сходным образом, др. агонист GLP-1, Lixisenatide, снижает нагрузку A β-пептидов, NFTs и воспаление нейронов у APP/PS1/tau мышей (Cai et al., 2018). Такое снижение воспаления нейронов может зависеть не только от A β- но и от tau, т.к. GLP-1 снижает экспрессию IL-1 β мРНК, активирует микроглию и вызывает оксидативные повреждения in vitro и in vivo (Iwai et al., 2006, Spielman and Klegeris, 2014, Teramoto et al., 2011).
В то время как безопасность и эффективность GLP-1 лекарств позволяет сегодня лечить типа II diabetes mellitus (TIIDM), неудобства составляют длительная поддатливость и систематические побочные эффекты. Избирательная избыточная экспрессия GLP-1 в ЦНС может, следовательно, представлять собой новую мультимодельную терапию AD. Перенос гена GLP-1 пока описан in vivo на моделях AD, хотя это было проверено в связи TIIDM (Tasyurek et al., 2014). В то время как эти исследования сфокусированы на системной экспрессии GLP-1, в противовес избирательной нейрональной экспрессии, они подтверждают возможность устойчивой экспрессии GLP-1 посредством генотерапии. Путем модификации промотора и/или пути применения, перенос гена GLP-1 избирательно в нейроны может обладать нейрозащитными эффектами у AD трансгенных модельных мышей. Хотя это нуждается в адекватном тестировании. 2.4. Enhancing proteins that regulate oxidative stress Антиоксиданты ранее изученные в отношении AD, включают glutathione, carotenoids, vitamin C, vitamin E и α-lipoic кислоту (Mironczuk-Chodakowska et al., 2018). Эффект орального приема витамина E на AD был исследован во многих клинических испытаниях в ходе 20 лет (Sano et al., 1997), однако, результаты остаются неубедительными (Browne et al., 2019).
Nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) соединяется с antioxidant response element (ARE), чтобы способствовать транскрипции генов (Liu et al., 2017) , а некоторые пре-клинические исследования подтвердили терапевтический потенциал модуляции Nrf2. Напр., применение sulforaphane, активатора Nrf2, у PS1V97L-Tg мышей снижало амилоидную патологию и устраняло когнитивный дефицит (Tian et al., 2019). Более того, лентивирусом обеспечиваемый перенос гена Nrf2 в гиппокамп APP/PS1 мышей снижал astrocytosis и усиливал пространственное обучение (Kanninen et al., 2009). Nrf2 был также использован в качестве негативного регулятора транскрипции BACE1 в эмбриональных фибробластах мышей (Bahn et al., 2019), подтвердив, что усиление активности может представлять собой мульти-механистическое лечение AD с использованием снижения окисления и модификации амилоидного процессинга. α-lipoic кислота может действовать посредством нескольких механизмов, чтобы активировать Nrf2 (Brandes & Gray, 2020). Перенос гена синтетазы α-lipoic acid, энзима, участвующего в биосинтезе α-lipoic кислоты, также может выступать в качестве потенциального лечения. Однако, бионакопление многих антиоксидантов делает генотерапию антиоксидантами при AD недостаточно изученной областью. 3. Gene transfer technologies can allow specific and highly regulated protein expression Ряд пре-клинических и в меньшей степени клинических исследований уже проверили стратегии генотерапии для лечения AD. Однако, необходимо в точности убедиться в безопасности прежде передачи технологии в клинику. Одним из ключевых соображений в этом отношении является иммунная реакция хозяина на терапию в терминах как непосредственных побочных эффектов, так и в терминах адаптивной иммунной реакции, приводящих к продукции терапевтических нейтрализующих антител (rev. Shirley et al., 2020). В случае болезни Альцгеймера такие реакции могут до некоторой степени, быть ослаблены с помощью stereotactic терапевтических инъекций, хотя это далеко от клинического идеала. Генотерапия может также вызывать тяжелую токсичность, если уровень экспрессии трансгена недостаточно отрегулирован или он экспрессируется вне мишени. Схожие токсические последствия у не человеко-образных приматов включают атаксию, нарушения ходьбы, proprioceptive дефицит и повреждения ганглиев дорсальных корешков (Hinderer et al., 2018). Кроме того, инсерционный мутагенез и генотоксичность, скорее всего, приводят к проблемам, когда определенные трансгены инъецируются векторами в высокой дозе (Chandler et al., 2017). Несмотря на это, генотерапия для AD остается привлекательной и актуальной технологией и, по крайней мере, некоторые из этих проблем уже преодолены. 3.1. Specificity Большой потенциал генотерапии при AD с использованием прямых инъекций в головной мозг, чтобы гарантировать региональную специфичность экспрессии. Специфичные к нейронам промоторы также могут использоваться для вызывания целенаправленной экспрессии генов. Напр., промотор neuron-specific enolase (NSE) и platelet-derived growth factor управляют экспрессией генов исключительно в нейронах, при этом экспрессия длится более 2-х мес. у взрослых крыс (Peel et al., 1997). Сходным образом, нейрональная специфичность промоторов человеческого synapsin-1, α-tubulin и calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIα (CaMKIIα) была описана ранее (K?gler et al., 2003, Mayford et al., 1996, Gloster et al., 1994). Кроме того, все 5 из этих промоторов были успешно слиты с cytomegalovirus энхансером, чтобы создать гибридные промоторы с 2-4- раза более высокими уровнями экспрессии относительно исходных нейрон-специфических промоторов (Hioki et al., 2007). 3.2. Inducible systems Обычная генотерапия не может регулировать или обращать экспрессию генов, когда она инициирована. Неконтролируемая системная генная экспрессия связана с большим количеством побочных эффектов (Liu & Kirn, 2007). В попытке решить этот вопрос, была разработана система экспрессии индуцибельных генов [for review see Kallunki et al. (2019)].
Наиболее широко используется tetracycline (Tet)-индуцибельная система экспрессии, которая обладает тем преимуществом, что производные tetracycline превалируют в клинической практике (Naidoo & Young, 2012). Система имеет три возможные конфигурации: (1) repression-based, (2) Tet-off и (3) Tet-on (Kallunki et al., 2019). В последнем случае, присутствие лекарства активирует транскрипцию генов мишеней. Такая конфигурация является благоприятной для генотерапии, т.к. производные tetracycline могут быть остановлены, если происходит избыточная экспрессия, которая больше не нужна или возникают побочные явления. Система была ещё больше оптимизирована, чтобы застраховаться от незначительного "протекания (leakiness)" в отсутствие лекарства (Shaikh and Nicholson, 2006, Zhou et al., 2006).
Использование систем индуцибельной экспрессии для лечения болезней было оценено при терапии рака, где системное введение IL-12 пациентам с продвинутой почечной клеточной карциномой приводило первоначально к тяжелой токсичности и двум смертям (Leonard et al., 1997). Использование RheoSwitch Therapeutic System®, которая использует veledimex в качестве лиганда активатора привело к опухоль специфичной индуцибельной экспрессии IL-12, которая хорошо переносилась как при пре-клиническом, так и при Phase I клинического испытания при глиобластоме и продвинутой меланоме (Barrett et al., 2018, Linette et al., 2013, Schwartzentruber et al., 2011).
В комбинации с клеточно- или ткане-специфическим промотором и возможно с локальной инъекцией, индуцибельная система может ослаблять побочные события при довольно широко распространенной избыточной экспрессии терапевтического белка. Напр., специфичный для переднего мозга CaMKIIα промотор был использован в Tet-индуцибельной системе, что делало возможной индуцибельную и обратимую экспрессию , специфическую для нейронов мыши (Michalon et al., 2005). Сходным образом, tamoxifen-индуцибельная экспрессия, управляемая с помощью промотора NSE приводила к исключительной экспрессии гранулярных клеток мозжечка у мышей (Pohlkamp et al., 2014). Следовательно, интеграция индуцибельной системы и специфичных для нейронов промоторов в будущих исследованиях позволит контролировать экспрессию терапевтических белков с помощью генотерапии при AD, это может улучшить успешность клинических испытаний.
4. Concluding remarks Despite the large number of candidate treatments previously developed for AD, many drugs have failed in clinical testing. While gene therapy itself is not a new concept, our expanding knowledge of AD aetiology and recent developments in gene therapy systems provides new promise for this currently incurable disease. Here, we have discussed several therapeutic proteins that remain to be validated using gene therapy. The range of putative therapeutic target proteins will likely increase as our understanding of AD further develops. Whilst further preclinical validation of gene therapy-mediated protein overexpression is needed before testing in clinical trials, the in vitro and in vivo studies described herein demonstrate the feasibility of gene therapy as a future treatment strategy for AD.
|