Посещений:
СИНДРОМ АПРЕРТА



Генотерапевтические подходы

Insights and future directions of potential genetic therapy for Apert syndrome: A systematic review
Nisreen Mohammed Al-Namnam, Soher Nagi Jayash, Firdaus Hariri, et al.
Gene Therapy (2021)

Мембранозные кости, из которых образуется мозговой череп удерживаются вместе за счёт прямой оссификации их швов. Эти швы содержат недифференцированные мезенхимные клетки, отделяющие остеогеннные фронты [1]. Весь процесс скоординирован за счет взаимодействия нескольких сигнальных молекул, таких как fibroblast growth factors (FGFs), Bone morphogenetic protein (BMP), hedgehog, and transforming growth factor beta (TGF-β ). Швы черепа появляются между 15- м днем эмбрионального развития у мышей и на 18-й неделе беременности у людей и они делают возможным постоянный рост головного мозга, они остаются свободными у плодов при рождении. Краниосиностоз является результатом неправильного формирования кости при формировании свода черепа. Это рассматривается как врожденное нарушение преждевременного срастания швов, приводя в результате к ограничению нормального роста свода черепа и в конечном итоге к нарушению развития головного мозга и лица. Установлено, что 1 из 2,500 живорожденных рождается с черепно-лицевыми аномалиями, что делает его, одним из наиболее распространенных нарушений, возникающих в этой области [2]. Краниосиностоз может быть локальным, не синдромным феноменом или может быть частью более крупного синдрома с вовлечением нарушений пальцев, формированием дефектов скелета, сердца или аномалий др. органов.
Синдром Аперта обусловлен преждевременным слиянием швов свода и основания черепа, что сопровождается гипоплазией средней лица, симметричной синдактилией пальцев и др. общими уродствами с участием черепно-лицевых и висцеральных нарушений, скелетных, ротовых, дыхательных и кожных [3]. Аномалии ЦНС внутричерепное давление часто выявляются у таких пациентов. Наиболее характерным аспектом у затронутых детей является двухсторонний коронарный синостоз, который приводит к укорочению головы в передне-заднем направлении, но к расширению и увеличению в высоту макушки. Т. к. характерной особенностью синдрома Аперта является акроцефалия и синдактилия, поэтому он обозначается ка акроцефалосиндактилия. Ротовые, черепно-лицевые клинические признаки являются наиболее впечатляющими проявлениями синдрома Аперта у пациентов. Более длинное мягкое нёбо и более короткое твердое нёбо, чем в норме, при этом встречается расщепление мягкого нёба и удвоение язычка обнаруживаются в 76%, [4,5,6]. Показатель возникновения синдрома варьирует между 9.9 и 15.5/ на миллион и объясняет приблизительно 4.5% краниосиностозов [3].




FGFs семейство содержит примерно 22 известные сигнальные молекулы, которые регулируют клеточную пролиферацию, дифференцировку и миграцию по целому ряду слжных путей. Они действуют посредством fibroblast growth factor receptors (FGFRs)- трансмембранных рецепторных тирозин киназ - семейство представлено 4 тирозин киназными рецепторами. Каждый из FGFRs содержит 3 immunoglobulin-like domains (Ig I-III), одиночный трансмембранный домен (TM), и 2 тирозин-киназных домена (TK1-2) [7]. Лиганд соединяется с внеклеточными immunoglobulin-like доменами (IgI, IgII и IgIII). Лигандом вызываемая димеризация приводит к аутофосфорилированию расщепленных тирозин киназ (TK1 и TK2). Частые повторно возникающие мутации в Ig II-III приводят к синдромам краниосиностоза [8]. Мутации в сигнальном FGF пути играют критическую роль в развитии синдрома краниосиностоза. Нарушения типа Аперта сцеплены с мутациями в гене FGFR2, который картируется в хромосоме 10q25-10q26 и характеризуется аутосмно доминантным наследованием [9]. Сюда входят специфические мутации в двух соседних аминокислотах , Ser252 и Pro253 в FGFR2, предполагается, что они расположены в линкерной зоне между Ig II и Ig III в FGFR2 лиганд-связывающего домена [10]. Этот ген отвечает за развитие и соединение швов черепа во время роста и развития костей.

Description of the intervention


Инициация передачи сигналов FGFs/FGFR2 нарушает стабильность дифференцировки, клеточной пролиферации и апоптоза с помощью нижестоящих сигнальных путей. Эти мутации повышают сродство к лиганду рецепторов и тем самым способствуют избыточной активации. Мутантный FGFR2 вызывает AS , понуждая клетки к остеодифференцировке посредством ERK1/2, AKT, PKC, p38, PLC?, JNK, EGFR, PDGFR и др. сигнальных путей. ERK1/2 обнаруживает важную роль в дифференцировке остеобластов. AKT, нижестоящая мишень для phosphphatidylinositol-3-kinase (PI3-K), является критическим медиатором клеточной пролиферации и жизнеспособности путем фосфорилирования разных мишеней, которое приводит к инициации или супрессии их функции. Protein kinase C (PKC) является serine/threonine-protein киназой и обеспечивает несколько клеточных функций, таких как клеточная пролиферация и дифференцировка. Более того, PKC передача сигналов регулирует дифференцировку остеобластов и является жизненно важным basic fibroblast growth factor (bFGF)- индуцирующим формирование кости. p38 MAPKs относится к сверхсемейству MAPK и , как было установлено, участвует в пролиферации, дифференцировке, апоптозе, старении и продукции цитокинов. Phospholipase C (PLC) трансформирует phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) в inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) и diacylglycerol (DAG) и регулирует создание жизнеспособных вторичных мессенджеров, которые предопределяют клеточное поведение [3]. Сигнальные пути, приводящие к AP, суммированы на Fig. 1.

Fig. 1: FGFR2 mutation and signaling pathways of Apert Syndrome.

ERK1/2; extracellular signal-regulated protein kinase, AKT; Protein kinase B (PKB), PKC; Protein kinase C, p38; mitogen-activated protein kinases, PLC?; Phosphoinositide phospholipase C, JNK; c-Jun N-terminal Kinas, EGFR; epidermal growth factor receptor, PDGFR; Platelet-derived growth factor receptor.



Review purpose


В последние годы понимание биохимических и молекулярных сигнальных путей, особенно FGFRs, играет существенную роль в изучении возможной фармакологической и генной терапии, которая бы точно репрессировала инициацию этих путей, что в свою очередь могло бы быть полезным для лечения и ослабления осложнений у AS пациентов. Генетические исследования в области краниосиностоза позволят обнаруживать новые мишени для не хирургической терапии и приведут к разработке новых технологий. Это может в конечном итоге создать возможность альтернативы инвазивному хирургическому вмешательству.
Понимание молекулярных и патогенетических механизмов, участвущих в возниркновении синдрома Аперта и роли генотерапии безусловно поможет в разработке новых терапевтических стратегий.

Fig. 2 Literature search and screening according to PRISMA statement (Moher et al. [11]).



Discussion


В целом после скрининга литературы, исходя из наших критериев только 20 исследований было привлечено в данный обзор. Самое раннее исследование Mansukhani et al. [22] и самое последнее Kim et al. [20]. Хотя это количество кажется небольшим, но эти исследования осуществили прорыв и предоставили доказательства прогресса в изучении потенциала генотерапии при синдромальном краниосиностозе.
Т.к. большинство исследований не были гомогенными и описывали разные исходы, то был проведен мета-анализ. Несмотря на это SYRCLE и OHAT инструменты позволили нам оценить степень пристрастности для всех включенных in vivo in vitro исследований, соотв. В целом, большинство статей несут умеренные качества при этом более половины исследований обнаруживают низкий риск пристрастности.
Знание нормальных и патологических процессов развития черепа важны для понимания аномалий в сложных молекулярных сигнальных путях и их последствий для тканевого развития. Сходства в черепно-лицевом развитии и его молекулярных путей обнаружены между мышами и людьми, что делает мышей идеальной моделью для изучения краниосиностоза благодаря генетическому и физиологическому сходству между видами [31,32,33]. Следовательно, многие исследования in vivo на модельных мышах позволили вызывать слияние швов черепа и имитировать действительный краниосиностоз при AS.

Apert syndrome molecular pathogenesis


Значительное большинство AS пациентов имеет одну из двух missense мутаций в соседних аминокислотах; S252W или P253R в гене FGFR2. Мутация S252W обнаруживается у двух третей AS пациентов, она коррелирует с наиболее тяжелыми черепно-лицевыми аномалиями [34, 35]. Генотерапия обладает огромным потенциалом в лечении болезней, которые ранее были неизлечимы. Этот подход может предупреждать, смягчать или излечивать нарушения и снижать необходимость в хирургических вмешательствах.
AS обнаруживает определенные морфологические и рентгенологические признаким, гистологические аномалии в результате потери функции или избыточности функции у FGFR2c мутантов. Морфологические и радиологические проявления при AS обнаруживают избыточный рост пластинок свода черепа, сводчато-образный череп, широко расставленные глаза, недоразвитие средины лица и др. признаки как результат мутации FGF [15,16,17,18]. Мутации в FGF приводят к увеличению насыщенности клетками ткани и нарушению дифференцировки остеобластов в швах, что в свою очередь приводит преждевременному слиянию. Т.о., подавление передачи сигналов FGF приводит к редукции насыщенности клетками и задержке остеогенных фронтов и слиянию швов [15, 16, 20-24, 28, 36-38]. Сходные свойства обнаруживаются в виде изменений экспрессии клетками разных белков, напр., увеличение экспрессии Bax и collagen I и экспрессии TGF- β1, Runx2 b Opn, снижение Bcl-2, FGF2, и ERK у мутантных животных [15, 18, 21, 25, 29], тогда как животные, подвергшиеся лечению, обнаруживают противоположные паттерны регуляции этих белков [17, 36-39].
Nakamura et al. [40] продемонстрировали, что передача сигналов ERK-MAPK является ключевым медиатором гипер-активированной передачи сигналов FGF и может вносить вклад как в краниосиностоз, так и аберрации черепно-лицевого роста; преимущественно за счет зависимого от остеобластов механизма [40]. Эти находки согласуются с некоторыми включенными в исследования AP [14, 16, 17, 21, 25, 28, 38]. Т.о., открытость или слияние швов являются вторичными по отношению к альтерациям биологической активности FGF, скорее всего, из-за изменений в клеточной пролиферации. Доказательством служит гистология, выявляющая формирование новой кости и увеличение экспрессии маркеров формирования кости таких как; Opn, type 1 collagen и osteocalcin [15, 21, 25, 28, 29, 39]. Согласно этим находкам, мы полагаем, что генотерапия с использованием FGF при AS является критической для регуляции слияния и открытости швов, возникающих благодаря нарушениям клеточной пролиферации.

Progress in gene therapy in craniofacial surgery in human


25 лет назад инсерции маркерных генов в лимфоциты раковых пациентов стало первой доставкой гена в клинике. Потенциально улушение эффективности, безопасности и осуществление доставки гена и внесение технологии редактирования генов казалось делом будущего. Доставка генов стала доступной по цене как описывает Collins [41]. Многообещающий прогресс в доставке генов в испытаниях на людях включает использование вирусных векторов из преобразованных стволовых клеток костного мозга, терапию наследственных ретинопатий и hemophilia B, а также определенных злокачественных и инфекционных болезней [41].
Широкая и сконцентрированная база генетических данных необходима чтобы получать больше информации в области генетических и эпигенетических влияний на эти условия [42]. Недостаток молекулярных генетических данных по краниосиностозу в литературе оказывается одним из основных препятствий для разработки геномных подходов в направлении прецизионной медицины. Кроме того, необходимы клинические испытания для оценки генотерапии у пациентов с синдромом Аперта.

Potential difficulties, side effect, and complications of gene therapy in Apert syndrome


В целом, проблемы с генотерапией при синдромальном краниосиностозе включают отсутствие обстоятельного понимания молекулярного патогенеза AS, поскольку состояние включает разные фенотипические характеристики. Кроме того, эффективная доставка генов непредсказуема в реальных клинических условиях, т.к. терапия является необходимым вмешательством во время внутриутробной фазы, что может представлять существенный риск для матери и плода.
В смысле стабильности и интеграции некоторые подходы по воздействию на гены имеют целью долговременный эффект. Такая продолжительность необходима, т.к. терапевтический материал д. оставаться функциональным в течение намеченного периода. Как сообщалось, имеются два пути достижения этого, или использование множественных раундов генотерапии или комбинация терапевтических генов, которая делает их активными в течение длительного времени [43]. С др. стороны, ученые исследуют способы достижения долговременного терапевтического эффекта без интеграции, напр., с использованием стабильного не интегрирующегося вектора. Кроме того, безопасность векторов, главным образом, вирусов создает несколько потенциальных затруднений. Поэтому усиление иммунной системы по отношению к векторам у реципиентов может затруднить воспроизводимое применение генной терапии.
Вирусная доставка неспецифической щелочной фосфатазы уменьшает краниосиностоз в двух моделях FGFR2C342Y/+ синдрома Crouzon у мышей [44, 45]. Авт. предлагают новую перспективу по созданию благоприятной атмосферы, такой как вирусные векторы с технологиями генной инженерии, и персонализацию всех характеристик генной терапии для пациента, необходимых для преобразования жизни пациентов с генетическими нарушениями с синдромом Аперта перед клиническим испытанием .

Gene therapy and precision medicine in Apert syndrome


Нарушения, возникающие в результате мутаций одиночного гена являются наилучшими кандидатами для генотерапии. Разные способы генотерапии были продемонстрированы в отобранных исследованиях. В целом, для коррекции мутантных генов используются широко распространенные подходы с вовлечением инсерции нормального гена в неспецифическое место внутри генома, чтобы заместить нефункциональный ген. Др. альтернативами были, напр., редактирование генома; замещение аномального гена нормальным геном посредством гомологичной рекомбинации; репарация аномального гена посредством селективной обратной мутации и посредством регуляции или альтерации определенного гена [46, 47]. Превосходные результаты могут быть получены с помощью биологической терапии, направленной на передачу сигналов FGF / FGFR. PD98059, MEK1 ингибитор, как было установлено, уменьшает слияние коронарного шва в культивируемых сводах черепа FGFR2+ /P253R мышей в исследовании Yin [15]. Кроме того, Yokota et al. и Morita et al. открыли растворимую форму FGFR2 с мутацией Ser252Trp, которая может частично ослаблять фенотип Apert у модельных мышей за счет ослабления преждевременного закрытия швов в культивируемых сводах черепа и у трансгенных мышей [25, 26]. Более того, ингибирование MEK1/2 посредством U0126 ослабляет проявления краниосиностоза у Fgfr2±S252W мышей в исследовании Shukla [16]. Фармакологический ингибитор [juglone (5-hydroxy-1,4 naphthoquinone; 420120, Calbiochem)] редуцирует RUNX2, подавляет нижестоящие Dusp6, Spry2 и снижает экспрессию Cyclin D1, Cdk2, Cdk4 и PCNA, это приводит к нормальному закрытию коронарных швов [36]. Более того, это приводит к экспрессии collagen type II alpha 1 и type X, которые, в свою очередь, подавляют слияние по швам у мышей [20]. Adeno-Associated Virus-Mediated RNAi (S2) подавляет уровни белка FGFR2, фосфорилирует ERK1/2 и P38 и снижает мутантную экспрессию FGFR2, Runx2, Collagen 1, osteocalcin и osteopontin, это сопровождается снижением слияния швов [38]. Tamoxifen увеличивает p-ERK1/2 MAPK и экспрессию Runx2, Opn, ALP, Col1A1, osteocalcin и соотношение Rankl/Opg, это приводит к нормальному закрытию коронарного шва [21]. Эти результаты подтверждают важность биологического подавления активных молекулярных путей при AS на нарушения свода черепа.
Первые результаты измерений варьируют в зависимости от перехода экспрессии белка к генам. Эти находки представляют многообещающие результаты в отношении прогресса для прецизионной медицины по управлению AS. Согласно US Precision Medicine Initiative, прецизионная медицина определятся как как подход к лечению болезней и профилактике, учитывающих индивидуальную изменчивость генов, окружающей среды и образа жизни для каждого человека [48]. Несмотря на это, иные, чем протеомные и генные модификации, идентификация характеристик для фенотипических вариантов также важна, т.к. она позволяет проведение специфических терапий, использующих или генные или фармакоцевтические подходы для целенаправленного воздействия на эти варианты, а также на изменения стиля жизни, которые могут модифицировать исход.
Итак, синдром Аперта тесно связан с мутациями гена FGFR2. Генотерапия прогрессивно проверялась в клинических испытаниях, что привело к увеличению потенциала клинических показаний. Достигнут существенный прогресс по генотерапии синдромов с краниосиностозом и некоторые исследования изучали её влияние на предупреждение и уменьшение осложнений при синдроме Аперта. Эти исследования использовали разные техники генотерапии и их влияние на прогрессирование синдрома Аперта. Систематические поиски осуществляли с использованием электронных библиографических баз данных, включая PubMed, EMBASE, ScienceDirect, SciFinder и Web of Science для всех исследований генотерапии синдрома Аперта. Первые результаты измерений варьировали в зависимости от экспрессии белков и генов. Согласно находкам этих отобранных работ мы пришли к заключению, что генотерапия с использованием FGF при синдроме Аперта является критической для регуляции слияния или открытия швов в результате альтераций в клеточной пролиферации. Превосходный результат может быть получен с помощью биологической терапии, направленной на передачу сигналов FGF / FGFR. Ещё многие исследования по молекулярной генетике синдрома Аперта необходимы.