К настоящему времени известны два разных класса, 6 типов и 21 подтип системы CRISPR-Cas [2]. Длина повторяющихся последовательностей варьирует между 25 и 40 nt, тогда как длина спейсерной последовательности варьирует между 21 и 71 nt [3]. Многочисленных методы созданы для целенаправленного редактирования генов в клетках и у модельных животных. Сюда входят Zinc-Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs). Но Clustered-Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) и CRISPR Associated (Cas) белок (CRISPR/Cas) является быстрым, простым и часто чрезвычайно эффективным методом редактирования генов [4,5]. При этом с помощью инструментов геномного редактирования можно целенаправленно модифицировать геномную ДНК с помощью CRISPR/Cas [6]. Сегодня CRISPR/Cas редактирование гена позволяет вносить точные изменения в широкое разнообразие геномов, включая dsDNA вирусов. Как только gRNA-направляемая Cas создает double-stranded break (DSB) в геноме запускаются два основных процесса репарации, конкурирующие за репарацию повреждения генома, приводя к некоторым модификациям исходной последовательности.

de Wilde et al. [8] исследовали CypA-зависимость репликации трех родственных nidoviruses в одной и той же линии клеток (Huh7), в которой экспрессия CypA подверглась нокауту с использованием CRISPR/Cas9 системы редактирования генов (Huh7-CypAKO клетки). Целью данной работы является обсуждение технологии редактирования генов против новйших болезней, подобных короновирусам (COVID-19).

CRISPR/Cas технология редактирования генов используется и против новых болезней, подобных короновирусам (COVID-19 или SARS-CoV2) [8, 14, 19, 22, 25, 26]. Nidovirales состоят из семейств ronivirus, mesonivirus, arterivirus и coronavirus. В 2002-2003, произошла чрезвычайно патогенная вспышка (продолжающаяся и сейсас) человеческого короновируса (HCoVs), тяжелого острого респираторного синдрома короновируса (SARS-CoV) и Middle East респираторного синдрома короновируса (MERS-CoV) возникших в виде зоонозов и перешедших на популяции людей, с высокой смертностью. Вспышка SARS-CoV привела к более чем 8000 подтвержденным случаям в течение нескольких мес., (доля смертности: ~ 10%) [27] а вспышка MERS-CoV привела к более 2000 случаям у людей (~ 35% смертность) (http://www.who.int/emergencies/mers-cov/en/) [28]. Но в декабре 2019, др. патогенный HCoV, 2019 , назв. novel coronavirus (2019-nCoV, COVID-19 или SARS-CoV2), был обнаружен в Ухане, Китае [29, 30], и величина смертности составила ~ 35% (https://www.worldometers.info/coronavirus/). У большинства пациентов инфекция COVID-19 ассоциирована с цитокиновым штормом [27, 28, 30-33]. В случаях выздоровления, избыточная иммунная реакция приводила к долговременному повреждению и фиброзу легких, вызывая функциональное бессилие и снижая качество жизни [34, 35]. Не существует противовирусного лечения и разработка эффективных противовирусных лекарств против COVID-19 продлится несколько лет [36-38] хотя существует потенциальная возможность перепрофилировать имеющиеся средства для лечения инфекции COVID-19.

Следовательно, отсутствие подходящей стратегии по контролю nidovirus-инуцированных болезней, повышает важность знаний о репликациях вирусов, а также их взаимодействиях с клетками хозяина и особенно о роли CRISPR-Cas технологии редактирования генов против этих вирусов. Nidoviruses являются +RNA вирусами с разными геномами (arteriviruses с 13 - 16 kb и короновирусы с 26-34 kb) [39, 40], со сложной геномной транслокацией для продукции nsps (polyprotein precursors of the nonstructural proteins), а также с вложенным множеством (nested set) субгеномных (sg) мРНК для экспрессии структурных белков [41, 42]. Нидовирусные nsps, возможно с разными факторами хозяин собираются в replication and transcription complexes (RTCs), которые управляют синтезом вирусной РНК [43-46]. Эти RTCs, по-видимому, ассоциированы с сетью, продуцирующей вирусы, из endoplasmic reticulum-derived membrane (ERDM) структур, включая многочисленные пузырьки с двойными мембранами [43, 47-49].

Репликация нидовирусов зависит от доставки мембран, клеточных белков и мембран и путей передачи сигналов у хозяина или клеточных факторов и процессов у хозяина [50-52]. Члены семейства cyclophilin (Cyp) белков участвуют в репликации нидовирусов. Из семейства Cyps peptidyl-prolyl isomerases (PPIases), действуют как шапероны, чтобы облегчить укладку белка, целенаправленную поставку и активацию иммунных клеток[53, 54]. Семейство Cyps, которое распространено повсеместно и включает многочисленные цитозольные белки, особенно экспрессируемый CypA, это важный фактор, участвующий в репликации различных РНК вирусов. CypA выполняет также специфическую роль в разных вирусах, подобных вирусу гепатита человека C (HCV) и вируса иммунодефицита (HIV-1). Он способствует процессингу HCV полипротеина, взаимодействует с HCV NS5A при ремоделировании клеточных мембран в HCV репликативные органеллы и стабилизирует капсиды HIV-1, чтобы способствовать импорту в ядро генома HIV-1 [55].

Исследования общего ингибитора Cyp, такого как cyclosporine A (CsA) показало, что cyclophilins первоначально участвовали в качестве факторов хозяина в репликации нидовирусов. В культуре клеток репликация разнообразных arteriviruses и coronaviruses, как было установлено, сильно подавляется с помощью низкомолекулярный концентраций CsA, и non-immunosuppressive CsA аналога Alisporivir (ALV) и NIM-811 [56-63]. И затем репликация нидовирусов может зависеть специфически от CypA и/или CypB.

Репликация в клеточной культуре alpha-короновируса, кошачьего короновируса [64], arterivirus вируса конского артериита (EAV) [65]; и человеческого короновируса (HCoV)-NL63 [56] и HCoV-229E [63] , как было установлено, затрагивается нокаутом или нокдауном CypA. Наконец, стало очевидным, что нормальный цитозольный CypA седементируется вместе с мембранными структурами, содержащими EAV RTCs, обнаруживая непосредственную ассоциацию с arteriviral аппаратом, синтезирующим EAV [65].

Все исследования зависят от типа нидовирусов и клеточных линий, в отношении уровней экспрессии CypA и индикаторов измерений эффективности репликации вирусов. de Wilde et al. [8] исследовали CypA-зависимость репликции у трех родственных нидовирусов в одной линии клеток (Huh7), где вызывали нокаут экспрессии CypA с использованием CRISPR/Cas9 системы редактирования генов (Huh7-CypAKO клетки). Используя разные линии клеток, репликация arterivirus EAV [65] и alphacoronavirus HCoV-229E [63], пришли к предварительному заключению о зависимости от CypA. И зависимость от CypA у betacoronaviruses, подобных MERS-CoV также была подтверждена de Wilde et al. [8]. Они сообщили, что инфекция Huh7-CypAKO клеток MERS-CoV продемонстрировала, что его репликация лишь умеренно затрагивается отсутствием CypA, тогда как напротив у вируса конского артериита строго подавляется. Они установили, что репликация HCoV-229E не затрагивается вовсе во всех Huh7-CypAKO клетках. Т.о., они установили существенные отличия зависимости репликации от CypA arterivirus EAV по сравнению с др. короновирусами. Требуется оценка роли CypA в репликации членов последнего семейства вирусов.

Диагностика с использованием технологии CRISPR обладает огромными преимуществами при использовании в клинке. Проведено огромное количество исследований с использованием CRISPR редактирования и диагностики для коррекции генетических основ большинства болезней в клетках животных моделей. Первая волна клинических испытаний с использованием CRISPR энзимов для лечения наследственных нарушений у людей использовала уничтожение клеток пациента, редактирование ex vivo, и управляемое сращивание клеток. Такое ex vivo геномное редактирование сегодня является наиболее технически разработанным подходом и обладает потенциалом лечения разрушающих болезней крови, подобных серповидно-клеточной болезни и β-thalassemia. Стратегия ex vivo также лежит в основе иммунотерапии рака [66]. В 2018 опубликовано несколько статей об использовании CRISPR в диагностических тестах ранних стадий рака или инфекционных болезней [25].

Сегодня, создание, разрушение или модификации человеческих эмбрионов, включая и наследственные генетические изменения с исследовательскими целями объявлены вне закона U.S. federal funds. NASEM всё ещё подразумевает, что если безопасность гарантируется, то клинические испытания возможно будут начаты [69].