Спустя 8 лет после публикации важного сообщения относительно CRISPR-обеспечиваемого редактирования генов, в 2020 Нобелевская Премия по Химии была присуждена докторам. Jennifer Doudna и Emmanuelle Charpentier, что подчеркнуло важность этого открытия.¹

Одним из основополагающих уроков открытия CRISPR стала разработка подхода по использованию мощного прокариотического молекулярного инструмента, чтобы вызывать генетические альтерации в клетках людей. На базе этого примера исследователи генотерапии разработали множество более эффективных и разносторонних версий технологии CRISPR.

Мы получили интервью от др. David Liu of Harvard Medical School, невероятно творческого пионера в области, открывшего два совершенно новые подразделы в редактировании генов, редактирование оснований и prime editing (See page 237). Используя преобразование белка он получил слияния энзимов cytosine deaminase и adenine deaminase с измененной версией Cas9. Такое слияние комбинирует управляемую РНК специфичность последовательности ДНК в Cas9 со способностью энзимов deaminase превращать C-в-T или G-в-A в геноме хозяина. , Dr. Liu не стал покоиться на лаврах после этого изобретения и даже после более важного изобретения слияния Cas9 с обратной транскриптазой, комбинации, которая позволяет особенно эффективно переписывать любую последовательность в геноме хозяина.

Так наз. CRISPR-transactivators (CRISPRa) и CRISPR-inhibitors (CRISPRi) представляют собой смелые новые прорывы в Cas-based RNA-guided в ген изменяющих энзимах. В обзоре Lek et al. описываются эти изобретенные разработанные энзимы.² Оригинальная CRISPRa технология ими описанная содержит Streptococcus pyogenes Cas9 RuvC и HNH домены с точковыми мутациями, чтобы деактивировать эндонуклеазную активность, слитую или с трансактиватором транскрипции (в случае CRISPRa) или с репрессором транскрипции (в случае CRIPSRi). Согласно их описаниям в обзоре имеется множество вариаций этих мультидоменовых слияний с использованием др. RNA guidance доменов, доменов, которые или непосредственно активируют или репрессируют гены, или доменов, которые обусловливают эпигеномные модификации. Обзор Lek показывает, что подход CRISPRa успешно используется в качестве исследовательского инструмента по скринингу генома, а также как потенциальное терапевтическое средство. Особенно интересным является использование CRISPRa при нарушениях одиночных генов, вызываемых гаплонедостаточностью, таком как синдром Dravet.²

Фокусом этих двух обзоров является прямое редактирование генов in vivo. Т.к. обзор Dasgupta et al. подчеркивает, ex vivo манипуляции с аутологичными клетками с помощью редактирования генов, безусловно мощной технологии, но прямая доставка инструментов редактирования генов в органы мишени in situ может соответствовать гораздо более широкому спектру потенциальных возможностей.³ По крайней мере на определенном уровне осуществимость была продемонстрирована этого подхода в нескольких разных системах органов модельных животных, напр., базирующаяся на recombinant adeno-associated virus (rAAV) доставка аппарата редактирования гена в печень и мышцы. Способность перемещать in vivo редактирование генов в направлении определенных типов клеток, которые не являются хорошими кандидатами для долговременной обычной in vivo rAAV генотерапии, такие как гематопоэтические стволовые клетки и клетки предшественники, может сформировать важную нишу для успешного применения CRISPR в будущем.

Наиболее продвинутые программы для in vivo редактирования генов нацелены на ретинальные болезни, которые являются фокусом обзора Quinn et al.⁴ Этот обзор показывает, что глаза представляют собой идеальную мишень для in vivo редактирования генов, поскольку довольно малы, доступны и замкнутые мишени. Они также довольно иммуно-привилегированные и поэтому избегают иммунной реакции на происходящие из бактерий Cas9 белки.⁴ Внутренне присущие преимущества позволяют редактирование генов in vivo в глазах , это отражается в том факте, что наибольший прогресс в редактировании генов in vivo достиг клинической стадии испытаний в EDIT-101 согласно Editas Medicine. Авт. также подчеркивают условия, для которых prime editing может стать следующим поколением CRISPR процесса для лечения глазных болезней, вызываемых гаплонедостаточностью.

В данном номере также два интересных оригинальных исследования. Статья Zhang et al. из Oregon Health Sciences Center изучает ряд переменных, которые могут влиять на редактирование генов in vivo у модельных мышей с наследственной tyrosinemia type 1, модель для которочя уже была продемонстрирована ранее in vivo.⁵ Их окончательные заключения показали, что подход с двойным rAAV для создания Cas9, sgRNA и гомологичной матрицы может обеспечивать коррекцию 7 - 20% новорожденных мышей и у меньшего количества взрослых мышей.

Статья Li et al. из Wenzou Medical University и nationally leading Wenzhou Eye Hospital описывает новую систему оптимизации условий для homology-directed repair (HDR) с помощью разных редактирующих энзимов. Они использовали стратегию мутантного репортерного green fluorescent protein (GFP), при которой только точное HDR редактирование мутантного GFP (внедренного в сайт AAVS1 клетки хозяина) будет восстанавливать экспрессию GFP.⁶ Это делает возможным прямое сравнение эффективности HDR в клетках с использованием разных Cas энзимов и оптимизацию условий для HDR.

Этот специальный номер предоставляет важную новую информацию о том, как CRISPR технология развивается в последние годы, предоставляя всё более мощные инструменты для генотерапии. Оригинальная концепция CRISPR-Cas9-обеспечиваемого генного редактирования, нацеливаемого с помощью коротких гид РНК, была связана с индукцией сиквенс-специфических разрывов двойной нити ДНК, чтобы вызывать нокаут генов посредством nonhomologous end joining или репарации их с помощью HDR. Технологии CRISPR следующего поколения, представленные здесь расширяют репертуар, включая редактирование оснований, prime editing, CRISPRa и CRISPRi. Они теперь применяются in vivo и ex vivo.