В последнее время разработаны сайт-специфические модификации клеточного генома. Они также способны редактировать геном опухолевых клеток, чтобы вызывать апоптоз, снизить резистентность к лекарствам и восстановить мутантный ген. Они также могут быть использованы для внесения генетических манипуляций в иммунную систему, чтобы усилить противоопухолевую иммунную реакцию (1-4). CRISPR система обладает исключительным потенциалом и эффективностью для генетических манипуляций опухолевых и иммунных клеток.

Система CRISPR/Cas была предложена Cong et al. and Mali et al. в качестве платформы для редактирования генома клеток (11-13) и затем была использована с терапевтической целью (14-17). После того как crRNA)/Cas белковый комплекс детектирует мобильные генетические элементы, происходит спаривание оснований между crRNA и ДНК мишенью (21). Система class 2 базируется только на одной наводимой РНК эндонуклеазе (Cas9 при type2 и Cpf1 при type5), и широко используется (14, 19-21).

Cas9 является RNA-guided эндонуклеазой, а crRNA выступает в качестве наводящей гид (guiding RNA), тогда как trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) является некодирующей РНК и обязательна для процессинга crRNA processing, Cas9 соединяется с и целенаправлено разрезает ДНК (Figures 2B,C) (при type5 CRISPR системы, Cpf1 обнаруживает и разрезает ДНК мишень независимо от tracrRNA) (22-24).

Каталитически инактивированная Cas9, т.е. dCas9, имеет множество применений помимо редактирования генома. Т.к. dCas9 не может разрезать нити ДНК, она используется в качестве сиквенс-специфического элемента соединения с ДНК. Посредством присоединения разных эффекторных частей к dCas9, она может быть использована как ингибитор транскрипции или активатор или даже эпигенетический модулятор (16) (Figure 3). CRISPR демонстрирует существенные преимущества перед ZFNs и TALENs , т.к. она функционирует посредством взаимодействий ДНК-РНК. Кроме того, система CRISPR может быть нацелена на новый сайт лишь путем изменения последовательности guide RNA (4, 21). Более того, множественные сайт-специфические генетические альтерации возможны благодаря доставке единственной формы Cas и многих sgRNAs, что снижает клеточную токсичность. Считается также некоторыми, что CRISPR обладает более высокой эффективностью редактирования генома по сравнению с ZFNs и TALENs (11, 26, 27).

Характеристика и целенаправленное воздействие на гены, ответственные за туморогенез и прогрессирование ракового роста остаются критической проблемой. Изменения в регуляции таких генов, известных как онкогены и опухолевые супрессоры, обусловливают устойчивость к терапии и прогрессированию рака. Система CRISPR/Cas используется для обнаружения и внесения таких генов в качестве новых мишеней .

Избыточное накопление специфических мутаций приводит к возникновению биологических признаков злокачественного фенотипа (28). Посредством генотерапии технология CRISPR/Cas9 пригодня для инактивации онкогенов или восстановления опухолевых супрессоров и апоптических и стимулирующих иммунитет функций.

Распространенной характеристикой многих опухолевых клеток является мутация белка опухолевого супрессора tumor protein 53 (TP53 in human or TrP53 in mice). Этот ген кодирует белок опухолевого супрессора p53, ответственный за остановку клеточной пролиферации в ответ на внутренние стрессы и аномальные сигналы (29). Почти половина злокачественных опухолей у людей обладает поврежденной формой TP53 (2). Albers et al. показали, что CRISPR/Cas9-опосредованная инактивация Transformation Related Protein 53 (TrP53) и экспрессия онкогена H-Ras приводят к трансформации клеток и формированию опухоли в модельных ксенотрансплантатах (30).

Восстановление у мутантного TP53 его функции дикого типа с использованием разнообразных соединений может вызвать апоптоз и старение опухолевых клеток. Chira et al. предложили новую Tp53 терапевтическую концепцию замещения всего мутантного локуса TP53 (~20.5 kb длиной) его функциональной версией кДНК посредством гомологической рекомбинации. Такая рекомбинация нуждается в экспрессии двух sgRNAs (single guide RNA comprising crRNA and tracrRNA fusion), соединяющихся с верхним и нижним фланкирующим сайтом мутантного локуса TP53. Они разработали гибрид из Adeno-Associated Virus и bacterioPhage (AAVP) , нацеленный на опухолевые клетки. Эта конструкция увеличивала специфичность и могла обладать индуцирующей способностью посредством применения простого антибиотика, подобного doxycycline. Внутривенное введение этого терапевтического вектора приводило к ограниченным побочным эффектам и повышенному распрелению, приводя к устойчивой экспрессии p53 и регрессии опухоли даже в удаленных метастазах (2).

Ген Human Estrogen Receptor 2 (HER2) является хорошо известным онкогеном и он избыточно экспрессируется в некоторых опухолях, таких как рак молочной железы, является терапевтической мишенью для Herceptin (Trastuzumab). В качестве альтернативы, Wang et al. использовали новую стратегию для целенаправленного воздействия на онкоген HER2 с помощью системы CRISPR/Cas9. Совместная экспрессия Cas9 и трех sgRNAs, нацеленных на HER2 экзоны 5, 10 и 12 существенно снижали клеточный рост и туморогенность в Her2-позитивных клетках рака молочной железы (31). Одним из преимущества использования CRISPR/Cas9-опосредованного подавления HER2 перед обычной терапией, такой как моноклональные антитела (mAbs) является простота получения новых guide RNAs для целенаправленного воздействия на новые мутации в случае резистентности.

Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) является гликопротеином, закрепленным на клеточной мембране и имеющим внутриклеточный tyrosine kinase домен. Конституитивная активация тирозин киназы, обусловленная генетической мутацией, вызывает образование и прогрессирование рака. Хотя Tyrosine Kinase Inhibitors (TKIs) и стали терапевтическим выбором для EGFR-экспрессирующих злокачественных опухолей, резистентность к этим медикаментам развивается в течение 2-х лет. Huibin et al. предложили молекулярную хирургию с использованием системы CRISPR для репарации мутантных EGFR, применяя платформу CRISPR/Cas9 nickase. Эта стратегия должна сохранять свою активность благодаря внедрению стоп-кодона или indel (random insertions and deletions) посредством HDR и NHEJ, соотв. (32). Этот подход предоставляет возможность персонализованной генотерапии для болезней, вызываемых генетическими аномалиями, которые могут сопровождаться традиционными терапевтическими стратегиями, включая хирургию и радиацинную терапию.

одним из основных подходов терапии раковых клеток является нокаут генов, ответственных за индукцию резистентности к лекарствам. Ген NFE2L2 [кодирующий Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor (NRF2)] активируется в разных условиях, таких как оксидативные или электрофильные стрессы. Они также являются следствием применения химиотерапевтических лекарств. NRF2 целенаправленно воздействует на многочисленные гены, кодирующие GSH медиаторы, антиоксидантные белки и откачивающие насосы и вызывают клеточную резистентность против химиотерапии (33). Bialk et al. применили CRISPR/Cas9, чтобы вызывать нокаут гена NRF2в химио-резистентных клетках рака легких. Они сообщили о восстановлении эффективности противоопухолевого лекарства cisplatin, carboplatin и vinorelbine поле редактирования гена (34). Следовательно, взаимоусиливающие (synergistic) эффекты комбинации редактирования генов и стандартных терапевтических подходов, таких как химиотерапия, могут быть использованы при резистентности к лекарствам.

Сегодня известно, что эпигенетические механизмы играют критическую роль в формировании и прогрессировании различных опухолей (35). Недавно система CRISPR/Cas9 пролила свет на лежащие в основе эпигенетические неурядицы и позволила исследователям целенаправленно воздействовать на эти отклонения, используя платформу CRISPR/Cas9. Wang et al. (36) целенаправленно воздействовали на granulin (GRN), печеночный маркер раковых стволовых клеток, используя систему CRISPR/Cas9. Система состояла из C-концевого каталитически неактивной dCas9, слитой с тремя эпигенетическими супрессирующими доменами: DNMT3a, histone 3 K27 methyltransferase EZH2 и heterochromatin binding suppressor KRAB. Эта группа затем разработала gRNAs, специфические к промотору GRN. Эпигенетическое целевое воздействие на GRN, понижающее рост раковых клеток, было одинаковым в контрольной со случайными gRNA и контрольной dCas9 группах (36-38), тем самым предлагается мощный эпигенетический инструмент для подавления онкогенов.

Более того, некоторые вирусы могут вызывать злокачественные фенотипы в клетках путем внедрения онкогенов у клеточный геном. Система CRISPR может быть использована также против этих кодируемых вирусами онкогенов. Наиболее известным примером является вирус папиломы человека, которые является прежде всего агентом, вызывающим рак шейки матки (39). Hsu et al. целенаправленно воздействовали на E6 и E7 HPV-кодируемые онкогены с помощью CRISPR/Cas9 в полученных от пациентов ксенотрансплантатах из HPV16 + анальных опухолей у иммуно-дефицитных мышей и выявили подавление роста опухолевых клеток (40). CRISPR/Cas9 индуцируют также арест пролиферации и снижение вирусного груза в клетках, полученных от пациентов, страдающих от Burkitt's лимфомы с латентной Epstein-Barr вирусной инфекцией (41). Следовательно, CRISPR/Cas9 может быть многообещающим терапевтическим походом для воздействия на раки, обусловленные вирусной инфекцией.

Как упоминалось ранее, современные базирующиеся на CRISPR системы вызывают DSBs, которые индуцируют пути репарации клеточной ДНК, вызывающие indels в локусе мишени. Однако, большинство болезней, включая раковые опухоли, вызываются различными опухолевыми мутациями и поэтому необходимы инструменты для эффективной корреляции точковых мутаций. Поэтому новые Cas9 варианты были предложены для превращения одного основания в др. скорее, чем вызывающие DSBs. Согласно, Komor et al. сопряженные cytidine deaminase ферменты с dCas9, чтобы превращать одно основание в др. (42). Ими разработанный Base Editor (BE) был способен превращать C в T, чтобы корректировать p53 Tyr163Cys мутацию, которая ассоциирует с разными раковыми опухолями (43). С помощью того же самого подхода, Kuscu et al. вносили CRISPR-STOP для создания стоп-кодонов путем превращения одиночных оснований, используя BEs ранее предложенные Komor et al. (44). Хотя подход CRISPR-STOP имеет меньшее количество потенциальных sgRNAs для гена мишени, чем дикого типа Cas9, раннее внесение стоп-кодонов является эффективным и безопасным подходом к замалчиванию генов.

Открытие раковых биомаркеров предоставило новую область исследований, в основном благодаря улучшениям инструментов скрининга для сигнатур молекулярного уровня, таких как геномные альтерации. Биомаркеры, которые объективно измеряют и оценивают свойства, указывающие на биологический статус или процессы, может играть жизненно важную роль в исходе болезни у пациентов. Прогностические и предикативные биомаркеры отражают биологические характеристики, которые предоставляют информацию о возможном течении раковой опухоли и общем исходе для пациента, независимо от терапии и предсказании потенциальных терапевтических исходов целенаправленного лечения. Платформа CRISPR/Cas может служить в качестве ценного инструмента для идентификации этих биомаркеров посредством оценки генетических и эпигенетических изменеий в опухолевой ткани (45, 46).

Cluster of Differentiation 44 (CD44) является молекулой клеточной поверхности, которая взаимодействует с hyaluronic acid (HA) во внеклеточном матриксе. Это взаимодействие активирует mitogen-activated protein kinases (MAPK) и PI3 kinases/akt пути, участвующие в онкогенных путях (47, 48). Исследования показали, что CD44 соединяется с P-glycoprotein (P-gp), который кодируется геном ABCB1 и действует как препарат на откачивающий насос (49). Следовательно, его избыточная экспрессия приводит к резистентности против химиотерапевтических препаратов, таких как vinblastine, doxorubicin и paclitaxel в клетках остеосаркомы (50, 51). Xiaoa et al. , использовали CRISPR/Cas9 для нокаута CD44 в линии клеток, резистентных к лекарствам. Уровни P-gp снижались вследствие нокаута CD44. Нокаут CD44 снижает резистентность к doxorubicin в клетках остеосаркомы (52). Это исследование показало, что экспрессия CD44 может служить в качестве предсказателя общей жизнеспособности и реакции на химиотерапию и пролить свет на его роль в опухолевой миграции и туморогенезе.

Путь передачи сигналов Wnt рассматривается как путь, которые первоначально управляет самообновлением клеток в колоректальных опухолях (53). Мутации этого пути индуцируют постоянную активность этого пути и провоцируют резистентность к препаратам. Более того, TIAM1, который кодирует фактор обмена guanine нуклеотида, специфичный к Rac1, является чувствительным геном к пути передачи сигналов Wnt, а его избыточная экспрессия обнаруживается при раке толстой кишки человека (54). Izumi et al. сгенерировали xenograft мышиные модели со стабильным нокдауном TIAM1, используя CRISPR/Cas9 и затем лечили его с помощью 5-fluorouracil (5-FU). Клетки с нокдауном TIAM1 оказались более чувствительными к 5-FU. Также размер и вес опухоли заметно снижался по сравнению с контролем. Это исследование выявило корреляцию между избыточной экспрессией TIAM1 в CRC клетках, а также в ассоциированных с раком фибробластах, и резистентностью к лекарствам и указывая. что эта молекула является потенциальной терапевтической мишенью для устранения резистентности к лекарству (55).

Qian et al. оценили эффекты целенаправленного метилирования DERARE на лейкемогенез. Distal Element Multiple Retinoic Acid Response Element (DERARE) является специфическим Cis-Regulatory Element (CRE), который поддерживает гомеостаз между самообновлением и мульти-клональной дифференцировкой. Этот эффект обусловлен регуляцией Hoxb кластера генов зависимым от метилирования способом, это предупреждает от лейкемогенеза. Инструмент CRISPR/Cas9 для эпигенетического редактирования, используемый в этом исследовании, был сконструирован путем слияния каталитического домена DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) с C концом деактивированной Cas9 (dCas9). При таком слиянии образуется короткий линкер, делающий возможным метилирование ДНК по соседству с сайтом, с которым соединяется sgRNA на гене DERARE человека (56). Группа человеческих AML линий клеток, несущих мутации DNMT3A, была инфицирована лентивирусным вектором и при этом наблюдалось заметное снижение размера колоний и количества обработанных DNMT3A-dCAS9 AML клеток (57). Их результаты указывают на значимость паттернов метилирования ДНК в DERARE для отбора лекарств и осуществления персонализованной терапии.

MicroRNAs (miRNAs) малые, некодирующие молекулы РНК играют определенную роль в патогенезе рака. Существуют разные miRNAs, участвующие на всех стадиях функционирования рака в качестве онкогенов или, напротив, в качестве опухолевых супрессоров. Поэтому оценка их активации и подавления может быть мощным инструментом для оценки прогрессирования рака (58). Напр., miRNA, которая избыточно экспрессируется в клетках гепатоцеллюлярной карциномы, это miR 3188. Zhou et al. продемонстрировали, что эта избыточная экспрессия индуцирует образование прогрессирование опухолей, с плохим клиническим исходом. Zhou с колл. сообщили, что происходит супрессия клеточного роста, образования колоний и прогрессии клеточного цикла и повышается апоптоз после CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута miR-3188 в клетках (59), и предположили, что miR-3188 является мощной терапевтической мишенью и также биомаркером для ранней детекции связанного с HBV канцерогенеза в печени среди пациентов с анамнезом HCC.

CRISPR/Cas9 является мощным инструментом редактирования генома для обнаружения новых путей и мишеней для лечения рака, а также для выяснения механизмов, ответственных за индукцию резистентности к лекарствам и генов, лежащих в основе этого феномена. Следовательно, возможен нокаут разных генов с помощью CRISPR/Cas9, для выяснения их роли в пролиферации, жизнеспособности и метастазировании раковых клеток, а также для выяснения их вклада в возникновение резистентности к лекарствам.

Feng et al. осуществили интервенцию, используя CRISPR/Cas9, чтобы вызывать нокаут CDK11B в клетках остеосаркомы. Подавление экспрессии CDK11B снижает клеточную жизнеспособность и их миграторную и инвазивную активность. Это исследование выявило роль CDK11B в патогенезе рака и позволило высказать предположение, что целенаправленное на него воздействие может служить потенциальным подходом по улучшению жизнеспособности пациентов с остеосаркомой (60).

Urokinase Plasminogen Activator (uPA) соединяется со своим рецептором (uPAR), который кодируется геном PLAUR. Их взаимодействие вызывает ремоделирование клеточного матрикса и последующую клеточную адгезию, миграцию, пролиферацию и жизнеспособность посредством различных сигнальных путей (61, 62). Wang et al. установили, что нокаут uPAR с помощью CRISPR/Cas9 снижет резистентность к химиотерапевтическим лекарствам, таким как 5-FU, cisplatin, docetaxel и doxorubicin (63). Это доказывает, что путь uPA/uPAR является потенциальной мишенью для вмешательства также с помощью др. агентов.

G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) составляет 40% от всех целенаправленно действующих лекарств, одобренных FDA. GPRC5a, который кодирует G-Protein-Coupled Receptor family C, member 5, group A, также наз. retinoic acid-inducible 3 (RAI3), избыточно экспрессируются при разных раковых опухолях, включая рак поджелудочной железы (64, 65), это делает его потенциальным биомаркером для ранней диагностики рака. Liu et al. исследовали резистентность в GPRC5a-нокаутных клетках против широко используемого химиотерапевтических лекарств, таких как 5-FU, gemcitabine и oxaliplatin. Группа обнаружила подавление резистентности в GPRC5a нокаутных клетках по сравнению с клетками дикого типа, используя EC50 (Concentration for 50% of maximal effect) метод (66). Целенаправленное воздействие на этот сигнальный путь дело ближайшего будущего.

KRAS наиболее часто мутирующий прото-онкоген в раковых клетках, а фармакологическое целенаправленное на него воздействие остается непонятным в терапии рака (67). Т.к. активирующие мутации в KRAS являются характерным признаком pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), поэтому CRISPR/Cas был использован для изучения модели полного подавления KRAS и выяснения механизмов резистентности в субнаборах человеческих и мышиных PDAC клеток. Это исследование показало достоинства нацеленной на KRAS терапии для снижения in vitro пролиферации и in vivo туморогенного роста и выяснило роль KRAS' в обеспечении баланса между пролиферацией и метастазированием опухолевых клеток. Это исследование также рекомендовало использование активации пути PI3K в качестве потенциального механизма резистентности в KRAS нокаутных клетках и подтвердило, что одновременное подавление PI3K и KRAS пригодно в качестве терапевтической стратегии для PDAC (68).

Онко-белок N-Myc, избыточно экспрессирующийся во фракциях разного типа рака простаты (69-71), обладает функциями, способствующими прогрессированию рака (70, 72). Yin et al. сообщили, что регулируемый N-Myc путь DNA Damage Response (DDR) (N-Myc/miR-421/ATM) ассоциирует с прогрессированием опухоли и резистентностью к гормональной терапии, такой как резистентность к enzalutamide. Избыточная экспрессия N-Myc кооперирует с EZH2, чтобы супрессировать miR-421. Эта супрессия ведет к активации ATM, приводя в результате к резистентности к enzalutamide. Yin с колл. вызывали нокаут ATM посредством CRISPR/Cas9 инструмента редактирования генома и установили восстановление чувствительности клеток рака простаты (73).

Apolipoprotein B мРНК, редактирующая энзимы каталитического полипептид-подобного (APOBEC) семейства белков, участвует генетической нестабильности и гетерогенности. Семейство мутантных ферментов APOBEC обнаруживается в разных типах рака (74), включая рак молочных желез (75), мочевого пузыря, шейки матки, головы и шеи, рак лёгких (76), и глиомы (77). Schmitt et al. исследовали роль APOBEC3B в резистентности клеток глиомы к temozolomide, путем определения активности caspase 3/7. Они вызывали нокдаунAPOBEC3B, используя CRISPER/Cas9 и обнаружили более высокую чувствительность к temozolomide по сравнению с контрольными клетками (77).

miR-21 является miRNA, избыточно экспрессирующиеся при раке. Huo et al. затрудняли её экспрессию посредством indels, вносимых с помощью CRISPR/Cas9. Группа обнаружила подавление клеточной пролиферации, миграции и инвазии клеток рака яичников. Затруднение экспрессии miR-21 сопровождалось более высокой чувствительностью к лекарствам и снижением Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT), указывающее на её роль в метастазировании и химио-резистентности опухолей (78,79).

CRISPR/Cas скрининг геномного нокаута означает процесс sgRNA-опосредованного нарушения функциональности генов с целью обнаружения новых генов и путей, лежащих в основе различных фенотипических отклонений и биологических процессов, включая туморогенез и резистентность к лекарствам раковых клеток, а также оценивая их потенциал в качестве терапевтических мишеней (80, 81). Проводились многочисленные исследования genome-wide knockout libraries (GeCKO), содержащих множество sgRNAs против определенного набора генов, участвующих в возникновении рака. sgRNAs в клетках влияли на их компетентность обеспечивать жизнеспособность во время пролиферации. Увеличение или истощение вслед за этим этих sgRNAs указывало на наличие генов, ответственных за соотв. фенотип (82-88).

Среди групп развивающих и использующих GeCKO (15, 89), Shalem et al. выявили новые гены, ответственные за возникновение резистентности к Vemurafenib (PLX) (i.e., к BRAF протеин киназному ингибитору) в меланоме. Клетки были трансдуцированы с помощью пула лентивирусов, каждый нес Cas9 и a sgRNA. После этого клетки подвергались PLX селекции. Обогащенные по sgRNAs жизнеспособные клетки затем секвенировали и их гены мишени, чья потеря функции вносила вклад в возникновение резистентности, выявлялись (15).

В сходном исследовании Manguso et al. выявили механизмы, лежащие в основе резистентности к ингибирующему воздействию PD-1/PD-L1, используя библиотеку лентивирусных векторов с sgRNAs, нацеленными на 2368 генов мыши. Это исследование выявило Ptpn2 в качестве потенциальной мишени для устранения резистентности к PD-L1 иммунотерапии, поскольку его нокаут, оказался связанным с повышением чувствительности к иммунотерапии (90). Нокаут генов IRF4, STAT3, SOS1 и GRB2 в ALK + ALCL клетках также ослаблял экспрессию PD-L1 и супрессию измененных с помощью PD-L1 T клеток и NK клеток (91).

Гены, ответственные за резистентность к Bortezomib (BTZ) при Multiple Myeloma были определены с помощью проведения геномной позитивной селекции. Клетки множественной миеломы трансдуцировали с помощью лентивирусов, несущих sgRNA, и затем культивировали в присутствии BTZ в его летальной дозе. Инактивированные гены в выживших клетках были идентифицированы на базе обогащения sgRNAs, а протеосомная регуляторная субъединица PSMC6 оказалась единственным геном, который обеспечивает резистентность к BTZ воспроизводимо. Следовательно, PSMC6 ведет себя как многообещающий предикативный биомаркер и новая мишень (92).

Эта стратегия была использована для выявления механизма действия Immunomodulatory imide drugs (IMiDs), включая pomalidomide и lenalidomide. Liu et al. исследовали механизм, ответственный за резистентность линии клеток множественной миеломы к IMiDs с помощью loss-of-function геномного скрининга. Установлено, что регуляция CRBN, обеспечиваемая с помощью ЦНС, является основным фактором, определяющим чувствительность клеток множественной миеломы к IMiDs (93).

CRISPR геномный скрининг также оказался пригодным для идентификации новых мишеней. Скрининг dropout на линиях клеток с AML показал, что sgRNA-опосредованный нокаут KAT2A препятствует росту AML клеточных линий. Такой же результат наблюдался, когда линии клеток AML подвергались воздействию MB-3, ингибитора KAT2A. Поскольку KAT2A не является важным геном для клеток гематопоэтических предшественников, то его подавление, как полагают, может стать новой anti-AML терапевтической стратегией, а MB-3 стать потенциальным средством против AML (94).

Др. геномный негативный скрининг касался используемой AML мышиной lentivirus-based GeCKO v2 библиотеки. Среди генов, несущественных для гематопоэза у людей, мРНК de-capping enzyme scavenger (DCPS), по-видимому, важен для жизнеспособности AML клеток. Его ингибитор, RG3039, вызывает анти-лейкемогенные эффекты в моделях человеческих AML ксенотрансплантатов, особенно в комбинации в др. лекарствами в качестве потенциального терапевтического подхода (95).

CRISPR/Cas превосходит RNA interference (RNAi) технологию в построении геномной библиотеки нокаутов благодаря присутствию низкой частоты эффектов вне мишени, а также внесения мутаций потери функции в генные последовательности в противовес RNAi, которая приводит лишь к частичной супрессии генов в большинстве случаев (15, 81, 96). Однако, CRISPR/Cas обнаруживает некоторые ограничения; во-первых, во время drop-out скрининга CRISPR/Cas обнаруживает зависимые от условий ложно-положительные результаты в раковых опухолях с анеуплоидией. Во-вторых, геномные регионы с множественными количествами копий, включая и не экспрессирующиеся гены, становятся предметом избыточных разрывов двойной нити (DSBs). DSBs в свою очередь приводят к существенным повреждениям ДНК и к последующей индукции апоптоза. Следовательно, целенаправленное воздействие sgRNAs на не экспрессирующиеся гены д. быть исключено из библиотек. В-третьих, sgRNAs традиционно готовятся для целенаправленного воздействия на 5' экзон. Однако, ложно-негативные результаты приписываются генам с точками инициации в др. экзонах, а также исходам, зависящими от аккуратности проявлению эффектов sgRNA позиционирования (97).

Было установлено, что уклонение от иммунной деструкции является одним из признаков рака. Опухолевые клетки могут подавлять иммунные эффекторные клетки или вызывать толерантность к иммунитету посредством секреции прирожденных факторов, влияющих на микроокружение опухоли (TME) (98). Среди всех членов иммунной системы, присутствующих в TME, наибольшее нарушения отмечаются у макрофагов и Т клеток. Ассоциированные с опухолью макрофаги (TAMs) поддерживают туморогенез и метастазирование и подавляют противоопухолевую реакцию путем высвобождения EGF, IL-6, TNF, MMPs, VEGFA, TGF-β, IL-10 и PD-L1 (98, 99). Кроме того, противоопухолевая активность Т клеток и метаболическое состояние нарушаются за счет модулирующих иммунитет цитокинов, присутствующих в TME и ингибиторов иммунного КПП (checkpoint), таких как PD-1 и CTLA-4 (99, 100). Согласно исследованию Chung et al. 11 случаев рака молочных желез установлено, что присутствие M2 макрофагов в TME коррелирует с истощением Т клеток (101). Следовательно, состояние TME строго влияет на прогноз у пациентов. Следовательно, идентификация механизмов, лежащих в основе туморогенных характеристик взаимодействий между иммунными супрессирующими клетками и опухолью может предоставить новые терапевтические мишени для разработки антагонистов, таких как mAbs и модулирующих иммунитет лекарств.

Др. подход - это укрепление уже существующих иммунных реакций или развитие новых за счет избегания их зависимости от мощной интактной иммунной системы, которая, как известно, трансформируется в нефункциональное состояние (102). Adoptive T клеточная иммунотерапия рака всё ещё страдает от различных затруднений (103).

CRISPR/Cas-опосредованные генетические манипуляции стараются преодолеть некоторые затруднения, связанные с неправильным функционированием иммунной системы.

TME состоит из опухолевых клеток, стромальных клеток и иммунных клеток, а взаимодействия между этими клетками влияют на прогрессирование опухоли. Одновременное присутствие в TME цитокинов, хемокинов и факторов роста предопределяет поляризацию макрофагов и их дифференцировку в направлении M1 или M2 подтипов. M1 макрофаги способны к : (i) высвобождению способствующих воспалению цитокинов, таких как IL-12, IFN gamma, IL-1, IL-23 и iNOS; (ii) переквалификации DC и CD4 + T клеток; и к (iii) активации CD8 + T кеток и как результат они способствуют иммунному ответу на опухоль и предупреждению прогрессирования опухоли. Напротив, M2 макрофаги и TAM усиливают ангиогенез и формирование ассоциированных с опухолью фибробластов. Эти клетки ослабляют иммунные реакции в TME и усиливают прогрессировие опухоли (104-107).

Различные агенты, которые участвуют во взаимодействии между опухолевыми клетками и M2 макроофагами, подвергались целенаправленному воздействию с использованием системы CRISPR/Cas9. Эти мишени включают: (I) Signal Regulatory Protein a (SIRPa) макрофагов. Взаимодействие между SIRP-a на макрофагах и CD47 рецепторами на опухолевых клетках предупреждает фагоцитоз раковых клеток благодаря сигналу "Don't eat me" (не ешь меня). Устранение подобной передачи сигналов с помощью нокаута SIRP-α с использованием CRISPR/Cas9 делает возможным фагоцитоз раковых клеток (108); (II) Kindlin2 белок является др. терапевтической мишенью, который усиливает секрецию Cancer Stimulating Factor1 (CSF1) опухолевыми клетками. Более того, Kindlin2 индуцирует хемотаксис для макрофагов в TME, которые впоследствии составляют доминирующую популяцию. Устранение экспрессии Kindlin2 с использованием технологии CRISPR/Cas9 подавляет инвазию и миграцию опухолевых клеток, не влияя на скорость их пролиферации (109); (III) Osteopontin (OPN) гликопротеин опухолевых клеток увеличивает рекрутирование M2 макрофагов. Поэтому они подвергаются целенаправленному воздействию при лечении рака. Нокаут OPN в опухолевых клетках с помощью CRISPR/Cas9, снижает хемотаксис макрофагов и повышает чувствительность раковых клеток к цитотоксичности, вызываемой CD8 + T клетками (110); (IV) Lysosome Associated Membrane Protein Type 2A (LAMP2a) является ещё одним агентом, экспрессия которого повышается в опухолевых клетках с помощью TAMs. Инактивация LAMP2a с использованием CRISPR/Cas9 снижает активацию TAM и предупреждает супрессию иммунной системы и снижает опухолевый рост (111); (V) IL-8 высвобождаемый макрофагами усиливает опухолевый рост и метастазирование. Установлено, что нокаут IL-8 рецептора, CXCR2,с помощью CRISPR/Cas9 в линии клеток triple-negative рака молочных желез уменьшает прогрессирование опухоли (112); и (VI) Tumor-Secreted Protein S (Pros1) хорошо изученный лиганд для Tyro3/Axl/Mer (TAM) рецепторной тирозин киназы, а его делеция с помощью CRISPR подавляет поляризацию M2, приводя к усилению иммунной инфильтрации и снижению жизнеспособности опухоли (113).

Теоретически многие из этих потенциальных мишеней могут влиять на поляризацию макрофагов в направлении M2 фенотипа и их иммуносупрессивные свойства. Следовательно, они могут стать предметом будущих исследований не только в отношении лечения рака, но и обнаружения подходящих мишеней для фармакологических лекарств или моноклональных антител.

Терапия иммунными клетками появилась в качестве нового подхода после традиционных фармацевтических средств, таких как малые молекулы и биофармакоцевтические средства, подобные терапевтическим белкам, включая mAbs (114). Благодаря обширному репертуару TCR и их способности отличать самих себя от чужих эпитопов, продуцируемых во время туморогенеза, T лимфоциты играют жизненно важную роль в надзоре за опухолями и в искоренении рака. Т.о., были предприняты попытки продуцировать, наводить или усиливать клеточную иммунотерапию против рака. Базирующаяся на Т клетках иммунотерапия базируется на осуществлении ex vivo манипуляций с T лимфоцитами с целью элиминации опухолей с помощью TCR-преобразованных T лимфоцитов и Chimeric Antigen Receptors T cells (CAR T Cells) в качестве основной стратегии (83, 102). T лимфоциты от пациентов трансфицировали, чтобы они экспрессировали трансгенные TCR, происходящие от др. пациентов или животных моделей со специфичностью, нацеленной на Tumor-Associated Antigen (TAA), а позднее, чтобы эксплуатировать химерные рецепторы с их антиген распознающими доменами, приобретенными в основном из антител (115).

Несмотря на существенны прорыв в использовании CAR T клеток в элиминации гематологических злокачественных новообразований, всё ещё существуют определенные барьеры применению CAR T клеточной терапии, особенно против солидных опухолей, также из-за затруднений с продукцией их производства (116). При CAR T клеточной терапии, T клетки могут происходить от пациентов (autologous) или от аллогенных доноров. Использование аутологических Т клеток процесс, требующий больших затрат времени и он зависит от качества и количества аутологичных Т клеток, полученных от пациента. Процесс также требует больших материальных затрат на производство аутологичных Т клеток (117, 118). Одним из важных барьеров на пути использования аллогенных T клеток является присутствие эндогенных MHC class I и TCR на донорских T лимфоцитах, которые вызывают аллореактивность и graft-versus-host disease (GVHD), соотв. Первое зависит от репертуара TCR у реципиента (119, 120).

Чтобы преодолеть HLA барьеры использовали third-party donors-derived T лимфоциты, Poirot et al. первыми оказались способны вызвать нокаут эндогенных TCR с помощью TALEN-опосредованного разрушения T cell receptor alpha constant chain (TRAC) в лентивирусом трансдуцированных CD19 CAR T клетках (121). Эта платформа была в дальнейшем внесена в клинические исследования на двух детях с relapsed refractory CD19 + B cell ALL (122). "Универсальные CAR T клетки" стали теперь производить с помощью нокаута TCR и HLA-I в аллогенных T клетках (123). Более того, Eyquem et al. использовали CRISPR/Cas9, чтобы вставить CAR ген и удалить одновременно TCR ген путем внесения CAR гена в локус TRAC. Они наблюдали регулярную экспрессию CAR в T клетках, усиление потенции Т клеток и снижение терминальной дифференцировки и истощение у модельных мышей с AML (124).

CRISPR/Cas9 технология стала далее использоваться , чтобы соединять аллогенные CAR T клетки и разрушать checkpoint путь. Ren et al. использовали CRISPR/Cas9 технологию, чтобы вызывать нокаут PDCD1, TRAC и beta-2-microglobulin (β2M), который кодирует дополнительную цепочку MHC class I в CD19 или PSCA CAR T клетках. Эти T клетки обладали мощной противоопухолевой активностью и не вызывали GVHD у мышей, моделирующих лейкемию (125). В сходном исследовании целенаправленное воздействие EGFRvIII на CAR T клетки и их triple gene-edited CAR, T клетки обнаруживали усиление профиля на преклинических моделях глиобластомы (126).

Необходимость в нокауте TCR не ограничивается CAR T клеточной терапией. В преобразованных по TCR T клетках, α и β цепочки эндогенного TCR, как было установлено, спариваются с трансгенными TCR α b β цепочками. Это неправильное спаривание нарушает перенаправление T клеток в направлении мишени антигена и также подвергает риску новую аутореактивность. Более того, конкуренция этих 4-х цепочек в связывании с CD3 комплексом мешает транслокации и значит достаточной концентрации трансгенных TCR на клеточной поверхности. Это наряду с др. затруднениями лежит в основе плохой работы TCR-преобразованных T клеток при клинических исследованиях (127, 128). В исследовании Provasi et al., ZFNs были разработаны для затруднения экспрессии генов эндогенных TCR α и β цепочек и для более высокого уровня на клеточной поверхности экзогенных TCR, обладающих превосходящей соседей специфичностью (129). CRISPR/Cas-опосредованное нарушение экспрессии поверхностных TCR в TCR-преобразованных T клетках проложило дорогу клиническим исследованиям (130).

Активность преобразованных T клеток чувствительна к препятствиям, вызываемым естественными регуляторами immune checkpoint. Т.о., идентификация этих регуляторов иммунного КПП (checkpoint), таких как programmed cell death protein 1 (PD-1), cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) и др. подавляющие сигналы, создаст новую точку зрения на иммунотерапию рака (131, 132). Избыточная экспрессия регуляторов иммунного checkpoint и активация их соотв. ингибирующих лигандов (напр., PDL1 и CTLA4 лиганды) в TME может ограничивать персистенцию и функцию TCR-преобразованных и CAR T клеток. Соотв. , это может приводить к вредным клиническим исходам данной стратегии (15). Базирующееся на CRISPR/Cas9 редактирование может быть использовано, чтобы устранить PD-1 и CTLA-4, чтобы повысить эффективность базирующейся на Т клетках иммунотерапии (125).

Нокаут гена PD-1 в Car T клетках с использованием CRISPR технологии впервые осуществлен Su et al., это привело к усилению цитотоксичности без влияния на жизнеспособность Т клеток (133). Заме несколько групп сообщили о сходных результатах с применением разных методов. Hu et al. использовали CRISPR/Cas9 против гена PDCD1, это сопровождалось инсерцией anti CD133 CAR в геном с использованием системы транспозонов piggyback. Они сообщили об усилении пролиферации Т клеток и секреции цитокинов (134). В др. исследовании была разработана система ground-breaking one-step, наз. knock-in and immune-checkpoint knockout (KIKO CAR-T cell), которая базировалась на системе cpfl, чтобы обеспечить одновременный knock-in двух разных CARs и knockout PD-1 и TRAC. Выявлены повешенная продукция цитокина и цитотоксичность и снижение уровней маркеров истощения (135). PD-1 нокаут CAR T клеток также был оценен в отношении глиобластомы, геатоцеллюлярной карциномы и K562 опухолевой линии клеток и был продемонстрировано усиление противоопухолевой активности, уменьшение истощения и усиления поражающей способности в Car T клетках (136-138). CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут PD-1 в T клетках теперь оценивается клинически на метастазирующем non-small-cell раке легкого (139).

Zhang et al. успешно вызывали нокаут lymphocyte activating gene-3 (LAG-3) в CAR T клетках, используя CRISPR/Cas9. Они не отметили существенных изменений в жизнеспособности или иммунных проявлениях в культивируемых CAR T клетках in vitro. Однако, LAG-3 нокаутные CAR T клетки обладали более сильной антиген-специфичной и противоопухолевой активностью в ксенотрансплантатах мышиных моделей (140).

Fas рецептор CD95 соединяется со своим лигандом, который избыточно экспрессируется в опухолевых клетках и вызывает апоптоз Т клеток и потерю ими функции (141). Чтобы повысить резистентность к Fas-вызываемому апоптозу, Ren с колл. генерировали аллогенные универсальные CAR T клетки посредством двойного нокаута эндогенных TCR и HLA class I (HLA-I). После чего они разрушали Fas рецептор, PD1 и CTLA-4 таким же способом и в результате получали разрушение 4-х генов в Т клетках с использованием one-shot системы. Также, генерируя универсальные аллогенные T клетки с множественными негативными регуляторами (i.e., PD-1 и CD95/Fas death receptor) вызывали нокаут (142).

Используя CRISPR/Cas9 , чтобы вызвать нокаут гена Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) в CAR T клетках, наблюдали усиление противоопухолевой активности и жизнеспособности. Нокаут гена GM-CSF не только пышал активность CAR T клеток, но и снижал воспаление нейронов и вероятность CRS (143).

Известно, что целенаправленные воздействия на CD7 в CAR T клетках, которые могут разрушать друг друга, воздействуя на маркеры CD7, присутствующие на самих себе, действие, называемое братоубийственной активностью. Silva et al. показали, что нокаут CD7 в CAR T клетках с использованием CRISPR/Cas9 предупреждает братоубийственную активность, которая сопрвождает CAR T клеточную иммунотерапию (144). Более того, нокаут CD7 и TRAC в CAR T клетках повышает эффективность лечения T cell acute lymphoblastic leukemia (T ALL) (145).

Jung et al. использовали CRISPR/Cas9, чтобы вызывать нокаут Diacylglycerol Kinase (DGK) в CAR T клетках. DGK является ферментом. который метаболизирует diacylglycerol в phosphatidic acid (PA), а нокаут гена DGK усиливает передачу сигналов CD3 и улучшает функцию Т клеток , способствуя передаче сигналов TCRg (146).

Исследования подтвердили, что нокдаун TET2, гена опухолевого супрессора, приводит к эпигенетическим и фенотипическим альтерациям Т клеток, которые могут улучшать клинические результаты (147). Fraietta et al. показали, что использование CRISPR/Cas9 для нокаута CD19 CAR гена в локусе TET2 способствует анти CD19 CAR T клеточной активности (147).

Oncolytic viruses (OVs) обладают высокой тенденцией инфицировать и реплицироваться внутри раковых клеток, чем в нормальных клетках. Базируясь на обнадёживающих естественно возникших OVs, их дальнейшая генетическая манипуляция привела к созданию новой стратегии (148). Эти манипуляции в основном сконцентрировались на усилении избирательности к опухолям, опухолевом тропизме и терапевтической эффективности и снижении их внеопухолевой токсичности и патогенности против нормальных клеток. Они в основном происходят из способности нормальных клеток формировать внутриклеточную анти-вирусные защитные механизмы, которые в основном сопровождаются апоптозом клетки хозяина. В неопластических клетках, с др. стороны, анти-апоптические молекулы избыточно экспрессируются и запрограммированная клеточная гибель затушевывается. Следовательно, антивирусом иммуно-скомпроментированные клетки, превращаются в подходящее место для OVs, чтобы реплицироваться и впоследствии взрывать саму клетку и распространять дальше вирусные частицы локально среди др. раковых клеток (149, 150). Первый и единственный OV, одобренный FDA, это T-VEC (IMLYGIC®) с рекомендацией использования при продвинутой меланоме (151). T-VCE является ослабленным Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) с пониженной патогенностью и повышенной избирательностью к опухолям. Он также преобразован для высвобождения GM-CSF и усиления MHC-обеспечиваемой антигенной презентации (151). Потенциал OV в терапии рака и генетические манипуляции с ним с помощью стратегий, исключающих CRISPR/Cas, рассмотрены в др. работах (152-155).

Генетические манипуляции с OVs с крупными геномами, такими как HSV, Adenovirus (Adv) и Vaccinia Virus (VACV), с помощью традиционных техник трудоемкие и низко эффективные. CRISPR/Cas, с др. стороны, содействует генерации рекомбинантных OV. Она упрощает процесс делеции и инсерции по сравнению с традиционными стратегиями (156).

Чтобы достичь избирательности к опухолям и онколитической эффективности, HSV-1 гены были многократно подвергнуты действию CRISPR/Cas-опосредованного нокаута с помощью как NHEJ (156), так и HDR-обеспечиваемого замещения чужеродными генами (156-158). CRISPR/Cas также оказалась способной обеспечивать множественные нокауты в HSV-1 (158). Использованы различные подходы для дальнейшего улучшения эффективности нокаута, включая обогащение маркерами избирательности и также инкорпорации Scr7, ингибитора NHEJ inhibitor, чтобы повысить соотношение HDR/NHEJ в HSV-1 (157, 158). Все эти исследования выявили низкую активность вне мишени платформы CRISPR/Cas (156-158). HDR-опосредованный knock-in продемонстрировал осуществимость и более эффективную по сравнению с простой гомологичной рекомбинацией в HSV-1 в некоторых исследованиях (156-158).

VACV является еще одним OV с высоким терапевтическим потенциалом с большим количевом законченных и продолжающихся клинических испытаний (159). CRISPR/Cas вызывает одновременно нокаут вирусного N1L, который играет жизненно важную роль в вирулентности VACV и обеспечивает модуляции иммунной реакции в VACV и TRP2, которые являются TAA, внутри N1L локуса (160). Теоретически доставка TRP2 в опухоль и индукция адаптивной иммунной реакции может способствовать превращению VACV в раковую терапевтическую вирусную вакцину. CRISPR/Cas-обусловленный одновременный двойной нокаут двух регулирующих иммунитет генов, N1L и A46R, как было установлено, усиливает индукцию иммунного ответа VACV. Следовательно, sgRNA-наводимая Cas9 может одновременно целенаправленно воздействовать на многие сайты генома VACV (160).

CRISPR/Cas система была использована для получения indels в гене EGFP в рекомбинантном аденовирусном векторе. Наблюдали наследование мутаций в следующее поколение вместе с их безопасностью в терминах внеопухолевой активности (156).

Кроме того, CRISPR/Cas платформа может использоваться для экипировки OVs стимулирующими иммунитет агентами или противоопухолевыми агентами. В исследовании Cai с колл., онколитический Human Simplex Virus 2 (oHSV-2) был вооружен мышиным IL-15 посредством CRISPR/Cas9. Непрерывная внуриопухолевая экспрессия IL-15 усиливает в T клетках противоопухолевую реакцию и также уменьшает массу опухоли. Инкорпорация иммуно-модуляторов в геном OVs приводит к избавлению от необходимости их систематического применения. Благодаря локальному высвобождению стимулянтов иммунитета, эта стратегия впоследствии снижает риск систематических побочных эффектов (161).

Кроме того, OVs могут соединять свой генотерапевтический потенциал доставки и свою прирожденную противиопухолевую активность, чтобы давать синергистический терапевтический эффект. Установив, что CRISPR/Cas-опосредованный нокаут RAS приводит к регрессии опухоли при Rhabdomyosarcoma, Phelps с колл. разработали CRISPR/Cas-обладающую рекомбинантным Myxoma Virus. Этот OV несет специфическую кассету spCas9-2A-Csy4 , сопровождаемую двумя NRAS-нацеленными sgRNAs. Csy4 рибонуклеаза инкорпорируется в расщеп sgRNAs с 3' конца молекулы мРНК. Обнаружена достоверная, хотя и неустойчивая редукция роста опухолевого ксенотрансплантата и рекомендовано дальнейшее улучшение в опухолевой избирательности этого OV (162).

В начале 2018 University of Pennsylvania,в сотрудничестве с Tmunity, запустили первую фазу испытания CRISPR редактирования гена на NY-ESO-1 для целенаправленного воздействия TCR-преобразованных Т клеток в меланоме и у пациентов с меланомой. Эти T клетки были лишены экспрессии TRAC, TRBC и PDCD1 генов посредством CRISPR/Cas9-обусловленного редактирования. Это исследование подтвердило безопасность multiplex CRISPR-Cas9 редактирования генома человека, поскольку ни один из субъектов не обнаруживал cytokine release syndrome (CRS) или др. побочных эффектов. Кроме того, не отмечалось отторжения перенесенных Т клеток из-за предсуществующего иммунитета к Cas9 среди индивидов, далее был одобрен потенциал этой технологии для лечения рака (130).

В то время как Allogene Therapeutics and Cellectis использовали TALEN для продукции нокаутных по TCR и MHC универсальных CARs в своих клинических испытаниях (NCT04093596, NCT04106076, NCT03190278 to name a few), в июле 2019, CRISPR Therapeutics инициировала первое клиническое испытание для оценки CTX110 (NCT04035434). CTX110 это универсальные CD19-нацеленные CAR T клетки. разработанные с использованием CRISPR/Cas9, чтобы вставлять CAR в локус TRAC, приводя к разрушению эндогенного TCR , а также к нокауту B2M и тем самым MHC1 для Refractory/Relapsed B cell злокачественных образований.

При клиническом испытании в Baylor College of Medicine (NCT03690011), T клетки подвергались нокауту эндогенного CD7 посредством технологии CRISPR/Cas9 для получения CD7-нацеленных CARs для подавления братоубийственной активности. Это исследование, разрабатываемое для высокого риска Т-клеточного озлокачествления, пока на стадии рекрутирования пациентов.

Клиническое применение CRISPR/Cas9 платформы не ограничивается созданием базирующейся на клетках терапии. В исследовании, инициированном в середине 2018 (NCT03606486), University of Washington разработал минимально инвазивный тест для детекции рака яичников посредством скрининга cervix pap выборок мазков ассоциированных с опухолью мутаций в TP53 (i.e., наиболее широко распространенной мутации при раке яичников). Команда использовала CRISPR-Duplex секвенирование, которое комбинирует ultra-accurate Duplex Sequencing с CRISPR/Cas9 эксцизией регионов мишени, это привело к обогащению посредством отбора по размеру перед секвенированием созданию библиотеки (163). В др. исследовании в Children's Research Institute (NCT03332030), моздан банк Pluripotent Stem Cell (iPSC) для пациентов с Neurofibromatosis type 1 (NF1) фенотипом. После этого, использовали CRISPR/Cas9 технологию для разработки изогенных NF1 дикого типа (NF1 + / +), NF1 гетерозиготных (NF1 ±) и NF1 гомозиготных (NF1-/-) iPSC линий от индивидуальных пациентов. Эти iPSC линии затем были дифференцированы в клетки ЦНС, имеющими отношение к опухолям . Они были исследованы, чтобы идентифицировать лекарства, которые обладают потенциалом обратить вспять или ослабить болезненный фенотип.

CRISPR связанные с иммунитетом побочные эффекты накладывают ограничения на терапевтическое использование. Система доставки, Cas белок и sgRNA все они могут возбуждать в хозяине врожденную и приобретенную иммунную систему. Пред-существующие антитела против SaCas9 и SpCas9 были найдены у 78 и 58% доноров соотв. Сходным образом, анти-SaCas9 и анти-SpCas9 T клетки были нацелены у 78 и 67% доноров (164). Более того, паттерн рецепторов распознавания может распознавать вторичную структуру sgRNAs и инициировать иммунную реакцию (78). Необходимы дальнейшие исследования (4).

Система CRISPR/Cas9 создает разрывы двойной нити в геноме, которые могут индуцировать p53-опосредованный апоптоз в трансфицированных клетках и снизить жизнеспособность клеток. Дикого типа p53 клетки могут погибать, тогда как мутантные p53 клетки могут быть отобраны. Следовательно, ингибирование P53 может улучшить эффективность геномного редактирования. Чтобы снизить риск, связанный в p53 мутациями в клетках используется клеточная заместительная терапия (165, 166).

При целенаправленном воздействии CRISPR на мишень наблюдается существенный мутагенез в мишени, это делеции и геномные перестройки, которые могут вызывать патогенные эффекты (167). Инкорпорация генов, кодирующих химерные суицидальные рецепторы, рядом с платформой, могут индуцировать зависимый от лекарств апоптоз. Такие рецепторы соединяются с лекарством с помощью своего внеклеточного домена и используют caspase9 эндодомен в качестве эффектора (168). Эта стратегия и сходные с ней стратегии в CAR T клеточной терапии используют суицидальным геном увеличивающуюся безопасность при применении CRISPR обеспечиваемого геномного редактирования клеток в случае непредсказуемых побочных эффектов (169).

Off-target effects (OTEs) всё ещё главные в ограничении использования геномного редактирования в клинике (170). Разработка соотв. gRNA, отбор более специфических нуклеаз и ограничение времени экспозиции активной нуклеазы - это три первичные стратегии снижения OTEs.

Разработка соотв. gRNA может значительно снизить OTEs и вероятность разрезов вне мишени (171). Укорочение 5' конца gRNAs и химические модификации сайтов crRNA для ослабления гибридизации с последовательностями вне мишени возможно изменят используемые gRNA благодаря улучшению специфичности (172, 173).

Выбор нуклеазы др. известный подход, посредством которого увеличивается специфичность. Cpf1 и fnCas9 описаны, как обладающие более высокой специфичностью, чем SpCas9 (174, 175). Изменения аминокислотных остатков для снижения OTEs привели к созданию белков Cas9 с высокой точностью, таких как SpCas9-HF1, eSpCas9 и HypaCas9. Механизм действия этих измененных Cas9 белков может быть изменен с помощью изменений в нуклеазном домене способа активации (HNH домен) или с помощью изменений силы связывания с ДНК мишенью (176-178). В попытке сконструировать SpCas9, которая сможет распознавать широкий набор последовательностей PAM, было создано несколько Cas белков со сниженными OTEs (179, 180). Др. форма нуклеаз была разработана путем слияния dCas с FOK1 доменом расщепления, которое генерирует химерный белок, нуждающийся в димеризации для расщепления ДНК. Т.к. две тесно расположенные последовательности распознавания нуждаются в двух самостоятельных sgRNAs, этот подход теоретически повышает специфичность (181). Существует сходная стратегия с использованием nickase Cas9, которая содержит мутацию в одном из двух нуклеазных доменов Cas9 белка. Такая nCas9, которая наводится двумя отдельными sgRNA, разрезает только одну нить ДНК (Figure 4A) (182).

FIGURE 4 Some strategies to solve CRISPR system limitations. (a) Systems that need dimerization to cleave both strands: 1. dCas-FOK1 2. nCas9. (b) Cas9 variants' activity can be switched on and off by cell-permeable molecules: (1) Intein-Cas9 is activated by excision of the intein bound to a specific position in Cas9. A cell-permeable small molecule induces this excision (189, 211). (2) Split-Cas9 is a Cas9 molecule that has been split into two fragments, and these two can be dimerized via drug-binding dimerization domains and a cell-permeable drug (212). (3) Degron-Cas9 is formed by binding a destabilizing domain (degron) to Cas9 protein. Previous studies have introduced a different type of degron that can bind to the protein of interest and decrease the stability of that protein in the presence or absence of specific small molecules. Degron domains can also be fused to the RBP-effector complex to regulate its stability and activity of the CRISPR system as a result (190, 213-216).

Ограниченное время экспозиции CRISPR нуклеазы является третьей важной стратегией снижения OTEs, это может сопровождаться снижением эффективности действия на мишень (171). Integrase-дефицитный лентивирусный вектор, рибонуклеопротеиновые (RNP) комплексы и Cas9 мРНК , все они затрагивают систему доставки и приводят к укорочению экспозиции Cas9 (183-185). Несмотря на многие преимущества, использование систем RNP доставки, связано с иммунными побочными эффектами (186). Др. стратегии для ограничения времени экспозиции связаны: (i) с использованием doxycycline-индуцибельного промотора, контролирующего экспрессию Cas9; (ii) с созданием Cas9-intein, Cas9-degron и split Cas, чтобы регулировать активность Cas9 посредством проникающих в клетки соединений (Figure 4B); (iii) с получением само-ограничивающихся конструкций, состоящих из Cas9, которые целенаправлено воздействуют на систему gRNA; и (iv) с использованием натурального ингибитора Cas9 (e.g., AcrIIA4) (187-193).

Альтернативная Cas13 была разработана в ответ на многочисленные затруднения с Cas9-based CRISPR системой, включая риск токсичности вне мишени, воздействия на транскрипты дикого типа и высокий молекулярный вес. Cas13 соединяется и разрезает однонитчатые РНК скорее, чем ДНК; , следовательно, они снижает риск токсичности вне мишени и альтерации транскриптов дикого типа. Более того, подтип Cas13d, как известно, является одним из самых низкомолекулярных энзимов среди Cas. Т.о., она может быть внесена в клетки мишени с большей легкостью посредством вирусных векторов. Итак, эти нацеленные на РНК Cas энзимы должны приводить к большей способности соединяться с транскрптомом, а РНК регуляторы функционируют в раковых клетках (194). Кроме того, многие типы др. связанных с CRISPR нуклеаз используются, включая Cpf1 и fnCas9 и нуклеазы, которые образуются при изменении аминокислотных остатков в SpCas9 (SpCas9-HF1, eSpCas9 и HypaCas9) (174, 175). Использование этих нуклеаз для лечения рака и их возможные преимущества будут изучены в будущем.

Недавним новшеством в CRISPR-based системах стало появление новых обнадеживающих подходов к терапии рака. Напр., CDetection, в качестве базирующейся на CRISPR/Cas12b системы детекции ДНК, которая разработана легкой и точной и чувствительной детекции ДНК. Генетическая изменчивость, включая и Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), также рассматривается как участвующая в этиологии рака (особенно спорадических раков) (195, 196). Поскольку ассоциации с разными SNPs при разных раках хорошо известны, а точная детекция ДНК и использование генотипирования SNP помогут ранней диагностике первичных раков. Эта система точной детекции ДНК, как полагают, будет способна выявлять около 20000 известных болезней человека. связанных с точковыми мутациями (197).

Итак, clustered regularly interspaced short palindromic repeats система продемонстрировала значительные преимущества по сравнению с др. инструментами редактирования генома, благодаря своей аккуратности, эффективности и строгой специфичности. Принимая во внимание, что рак вызывается избыточным накоплением мутаций, которые ведут к активации онкогенов и инактивации генов опухолевых супрессоров, CRISPR/Cas9 система предпочтительна для геномного редактирования и лечения при опухолях. Мы рассмотрели новые подходы к CRISPR геномному редактированию, инструментам обнаружения, сортировки и предпочтительных мишеней для последующих вмешательств и преодоления узких мест при лечении рака, таких как эпигенетические альтерации и резистентность к лекарствам. Более того, мы рассмотрели прорывы, связанные с CRISPR системой в области иммунотерапии рака, такие как идентификация иммунной системы, взаимодействующей с опухолями, продукция универсальных Chimeric Antigen Receptor T клеток, подавление ингибиторов имунного checkpoint, и Oncolytic Virotherapy.