Посещений:
НАПРАВЛЕННАЯ НА Cas9 ИММУНО-ТОЛЕРАНТНОСТЬ У ЛЮДЕЙ



Роль регуляторных Т клеток

Cas9-directed immune tolerance in humans—a model to evaluate regulatory T cells in gene therapy?
Dimitrios Laurin Wagner, Lena Peter & Michael Schmueck-Henneresse
Gene Therapy (2021)
Tregs in gene therapy
Взаимодействие между иммунной системой и ген-терапевтическими агентами in vivo в основном предопределяет длительность успеха лечебного вмешательства [1]. С одной стороны, нейтрализующие антитела могут блокировать доставку генов , а цитотоксические Т клетки могут редуцировать эффективность, а также повышать существенно риск безопасности. С др. стороны, иммунная толерантность к трансгенам и компонентам вектора связана с долговременной экспрессией трансгена и клиническими успехами некоторых испытаний [2, 3].
Среди механизмов вызывающих и поддерживающих иммунологическую толерантность к антигенам, разные типы клеток играют центральную роль, такие как вызывающие толерантность моноциты и дендритные клетки, а также регуляторные Т клетки (Tregs). Tregs могут регулировать цитотоксические и др. эффекторные Т клетки (Teff) иммунного ответа, напр., ограничивая ростовые факторы и тем самым подавляя их экспансию или способствуя состоянию дисфункции Teff states (Brief summary in Fig. 1, rev. [4, 5]). Напр., при нацеленной на мышцы AAV терапии, Gernoux et al. показали, что долговременная экспрессия трансгена, ассоциирована одновременно с инфильтрацией Treg клеток в мышцы и истощением Teff [6]. Это согласуется с предыдущими результатами Muller et al., которые описали сходный феномен после мышечных инъекций AAV [3].

Fig. 1: Suppressive actions of regulatory T cells. Regulatory T cells (Treg) are activated following recognition of specific antigens presented by antigen-presenting cells. However, Treg cells also exert a suppressive function irrespective of their antigen-specificity termed as bystander suppression. The mechanism of actions underlying the suppressive function of Tregs can be direct or indirect. Treg cells present with very high basal expression of high affinity CD25, enabling privileged consumption of the IL-2 growth factor and thereby depriving and weakening surrounding conventional effector T cells (Teff) cells. Further, Treg cells mediate specific suppression by depleting peptide-MHC class II-molecule complexes matching their TCR from the surface of antigen-presenting cells via trans-endocytosis and subsequent degradation. As opposed to boosting Teff cells by co-stimulatory signals, Treg cells carry molecules, which were classified as co-inhibitory receptors: e.g., CTLA-4 has high affinity to CD80/CD86 and thereby outcompetes co-stimulatory signals via CD28. Further, Treg cells can disrupt pro-inflammatory mechanisms by eliminating effector cells. Direct cell contact with Treg cells can also be fatal for the respective target cell by induction of the Fas-mediated pathway of apoptosis through ligation by Fas-ligand. In addition, Treg cells use perforin/granzyme dependent cytotoxicity to kill target cells accompanied by adhesion via CD18. Treg cells can also induce suppressive properties in adjacent cells by secreting soluble factors thereby inducing an infectious tolerance. For instance, human Treg cells secrete latent TGFβ thereby promoting a suppressive milieu, as well as shedding of soluble TNFα receptor II, which can neutralize TNFa and prevents its pro-inflammatory signaling. Notably, Tregs can also modulate their environment by secretion of IL-10. IL-2, interleukin 2; CD25, IL-2 receptor a chain; MHC, major histocompatibility complex; TCR, T cell receptor; CTLA-4, cytotoxic T-lymphocyte-associated Protein 4; CD80/CD86, B7, B7-2 type I membrane protein; CD28, co-stimulatory receptor for CD80/86; CD18, Integrin β-2; TGFβ, transforming growth factor; TNFα, tumor necrosis factor; IL-10, interleukin 10.

Treg клетки являются многофункциональными иммуно-супрессивными типами клеток, участвующими в контроле чрезмерной иммунной реакции и регенерации ткани. В то время как, происходящие из тимуса, Tregs клетки отбираются для распознавания собственных антигенов, др. Т клетки могут быть отправлены на периферию, чтобы стать антиген-специфичными Treg клетками [7]. Это было описано для антигенов commensal бактерий и безвредных экзогенных антигенов на поверхности слизистых [8, 9].
Растет число доказательств, подчеркивающих важность трансген- и вектор-специфических Treg клеток для долговременного успеха in vivo генотерапии у животных моделей и людей (rev. [6, 10]. Короче, многие пути были разработаны для специфической индукции Treg клеток, способствующих толерантности в отношении трансгенов [10]: доставка вирусных векторов в печень индуцирует Treg клетки и и может быть использовано для управления толерантностью во время одновременной доставки в др. органы [11, 12]. Недавно эта концепция была успешно применена к мышиным моделям в виде мышечной генотерапии, несмотря на предсуществующий иммунитет против трансгена [13]. Альтернативно, совместное применение AAV с вызывающими толерантность нано-частицами, нагруженными rapamycin, продемонстрировало локальную супрессию иммунной реакции в исследованиях на мышах, эффект, который может быть умножен с помощью Treg-опосредованного эффекта [14]. Оральный прием антигена посредством модифицированных растений был исследован в отношении индукции антиген-специфичных Treg клеток перед применением вектора [15, 16].
Т.к. альтернативой индукции Treg in vivo, является вливание ex vivo размноженных поликлональных Treg клеток, которое, как было установлено, предупреждает вредные проявления иммунитета к вирусным векторам у мышиных моделей [17]. Недавно др. исследование на мышах показало, что in vitro размноженный фактор VIII-антиген-специфических Tregs обнаруживал преимущества по отношению к поликлональным Tregs в отношении супрессии формирования anti-factor VIII специфических антител после избыточной экспрессии FVIII в плазмидах мышей [18]. Кстати, роль и потенциал предсуществующих антиген-специфических Treg клеток для генотерапии не был столь активно исследован на людях.

CRISPR-Cas as a treatment modality to fix broken genes


Бактериальная гид РНК система антивирусной защиты CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated protein) была переориентирована для редактирования генов и стала новым мощным инструментом для разработки могущественной терапии для наследственных болезней [19]. В противоположность обычной генотерапии эта базируется на избыточной экспрессии трансгенов, CRISPR-Cas редактирование генов и производные технологии по редактированию оснований и prime editing делают возможной точную коррекцию патогенных мутаций [20,21,22]. CRISPR-Cas9 системы, происходящие из разных видов бактерий варьируют в отношении своих свойств специфичности и эффективности целенаправленного воздействия на гены [23,24,25,26,27,28]. Наиболее популярные варианты были открыты у Streptococcus pyogenes (SpCas9) и Staphylococcus aureus (SaCas9), последняя оказалась более короткой и обладала поэтому преимуществами доставки AAV [27, 29, 30]. Пре-клинические исследования продемонстрировали долговременную эффективность CRISPR-Cas, базирующейся на in vivo генотерапии у мышей и даже более крупных животных и у не человекообразных приматов, моделирующих различные проявления гематологических болезней и мышечных нарушений [31-37]. Многие из этих подходов базируются на традиционных векторах для генотерапии, включая AAV. Исходя из успешности пре-клинических исследований первая CRISPR-Cas9 in vivo генотерапия, которая начала применяться к пациентам в первой половине 2020, использовала доставку c помощью AAV путем субретинальных инъекций в глаза, чтобы остановить Leber congenital amaurosis, тяжелую форму дистрофии сетчатки. При этом доставка SaCas9 нуклеазной пары использовалась для эксцизии аберрантного сплайс-донора в интроне 26 гена CEP290, тем самым элиминировался скрытый экзон, что приводило к образованию преждевременного стоп-кодона и би-аллельной потере функции в сетчатке (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03872479). Недавно инициировано второе бросающееся в глаза клиническое испытание, в котором липидные наночастицы, содержащие SpCas9 мРНК и single guide (sg)RNAs доставлялись системно к мишени, печени пациентов, страдающих наследственного и благоприобретенного transthyretin amyloidosis (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04601051). Чтобы редуцировать продукцию в печени transthyretin и избежать дальнейших осложнений в виде избыточных transthyretin-отложений в др. органах, исследователи поставили цель разрушить ген transthyretin в печени пациентов, что уже было продемонстрировано в пре-клинических исследованиях на мышах и и крысах [36].

Early evidence for Cas9 immunogenicity in mice


Несмотря на многочисленные успехи преклинических исследований, белки SpCas9 нуклеаз, как было установлено, вызывают антитела и реакции Т клеток у иммунокомпетентных мышей, при доставке c помощью аденовирусов в печень [38] или когда в мышцы вводится трансген с избыточной экспрессией посредством AAV векторов или электропортации [38-40]. Избыточная экспрессия SpCas9 в опухолях, трансплантированных иммуно-компетентным мышам, приводила к отторжению за счет нацеленной на Cas9 реакции Т клеток [41]. Важно, недавно Li et al. продемонстрировали, что иммунизация мышей белком SaCas9 за неделю до генотерапии с введением AAV в печень прдупреждает долговременное выживание гепатоцитов с отредактированным геном in vivo [42] (Fig. 2). Остается выяснить, действитенльно ли классические иммуносупрессанты, используемые в клинике и у модельных крупных животных могут снижать в Т клетках память о реакции после применения AAV [2, 33].

Fig. 2: Immunological risk for anti-Cas9 T cell-mediated rejection of gene edited cells/tissues. CRISPR-Cas9 in vivo gene therapy requires Cas9 expression. Intracellular protein degradation processes lead to peptide presentation of Cas9 fragments on the cellular surface of gene-edited cells that may be recognized by SpCas9-reactive T cells. An excessive effector T cell (Teff) response could impact success of gene therapy. However, in vitro studies demonstrate anti-SpCas9 CD4+ Treg cells could inhibit the proliferation and function of anti-Cas9 Teff cells at high Treg to Teff ratios. Potential solution: Enhancing anti-Cas9 Treg cell responses prior to or during in vivo CRISPR-Cas9 gene-therapy.



Human adults display preexisting adaptive Cas9-immunity


Наиболее популярная Cas9 нуклеазы происходят из факультативных патогенных бактерий, указывающих на то, что большинство людей многократно подвергаются воздействию этих линий благодаря инфекцифям или колонизации [27]. Считается, что такое воздействие может приводить к адаптивной иммунной памяти в отношении Cas9, на это указывает недавнее обнаружение характерного предсуществующего иммунитета к SpCas9 и SaCas9 у взрослых людей [43-45]. Результаты относительно SpCas9-специфических антител всё ещё дебатируются из-за высоких различий между находками Charlesworth et al. (58%), Ferdosi et al. (=8.8%), и Simhadri et al. (5%) [43, 45, 46]. В отношении предсуществующего Т клеточного иммунитета относительно SpCas9 и SaCas9, достигнут консенсус, что большинство здоровых взрослых обладает IFN-γ секретирующими Т клетками? которые обычно обнаруживаются в периферической крови с использованием разных методов, таких как проточная цитометрия для анализа маркеров активации и цитокинов или IFN-γ ELISPOT (Summarized in Table 1) [43, 44, 46]. Как и ожидалось бактериальные антигены, в большинстве своем SpCas9-реактивные T клетки принадлежат к компартменту CD4+ T клеток, несмотря на это, первые исследования также выявили SpCas9-индуцируемую активацию CD8+ T клеток. Сходным образом, SaCas9 белок вызывает Т клеточные реакции у большинства исследованных индивидов [43, 44]. У 6 доноров мы выявили сравнимые реакции Т клеток после воздействия происходящих из Acidaminococcus Cas12a (ранее известных как AsCpf1) [44]. Важно, что обогащенные SpCas9-реактивные Teff клетки были обнаружены, как лизирующие SpCas9 с избыточной экспрессией аутологичные B клетки in vitro [44]. Следовательно, человеческие Cas9-реактивные Т клетки обладают способностью распознавать и элиминировать клетки, экспрессирующие in vivo Cas9. Традиционно, элиминация клеток, экспрессирующих трансген, приписывалась CD8+ T клеткам [2, 47], но субпопуляция CD4+ T клеток также способна выполнять цитотоксические функции [48, 49].

Table 1 Summary of Cas9 directed T cell responses in humans. Full size table

Большая часть in vivo генотерапии нацелена на паренхимные клетки внутри солидных тканей с важной биологической функцией (гепатоциты клетки сетчатки, мышечные волокна), которые экспрессируют MHC class I в обычных условиях. Прямое взаимодействие между CD4+ T клетками и клетками с модифицированным геном маловероятно, хотя экспрессия MHC class II была описана для субнабора паренхимных клеток в условиях воспаления [50-52]. Далее, были описаны CD4+ T клетки с T cell receptors (TCRs), ограниченные MHC class I [48]. Действительно ли, CD4+ T вносят непосредственно вклад в повреждения тканей, модифицированных c помощью клеточной генотерапии, неясно. Глубокая характеризация иммунитета в отношении Cas9 поэтому важна для принятия решения о прямом клиническом воздействии для безопасного применения обусловленного CRISPR-Cas9 целенаправленного воздействия на гены in vivo.

Assessing the entire preexisting SpCas9-specific T cell repertoire


Мониторинг направленного на Cas9 иммунитета перед in vivo генотерапией должно иметь целью выявление пациентов с высокой частотой уже существующей способствующей воспалению T клеточной памяти. Первоначальные исследования использовали полностью рекомбинантные белки, чтобы стимулировать Cas9-специфические T клетки [43, 44], приводя тем самым , скорее всего, к положительной CD4+ T клеточной реакции, т.к. процессинг классического антигена из целых белков, нуждается в эндоцитозе и нагруженных антигеном MHC class II молекулах [53, 54]. Однако, перекрестная ориентация c помощью профессиональных антиген-презентирующих клеток приводит к потреблению антигена SpCas9, процессингу и презентации на MHC class I [55]. Следовательно, в исследовании Charlesworth et al. и в нашем исследовании обнаруживались Cas9-активированные CD8+ T клетки. В качестве альтернативы всем белкам, антиген-специфичческие Т клетки могут быть эффективно стимулированы c помощью библиотеки синтезируемых пептидов (пулов), представленных олигопептидами, представляющими данный интересующий антиген [56]. Недавно, Ferdosi et al. сообщили о 83% из 12 человеческих доноров располагают реакцией IFN-γ + T клеток после стимулирования пулом из 38 in silico предсказанных пептидов для оптимального связывания MHC class I с наиболее распространенным гаплотипом у людей: HLA-A2:01. Чтобы обеспечить беспристрастное обнаружение всего репертуара Cas9-спецфичных Т клеток, SpCas9-покрывающие пептидные пулы, были сгенерированы c помощью JPT Peptide Technologies. Эти пулы пептидов недавно были использованы для обнаружения T клеточных реакций на продукты cryopreserved leukapheresis от пациентов впервые опубликованных результатах по CRISPR-Cas9 multiplex-редактированию генов и трансгенных TCR-обратно возвращенных Т клеток T при противоопухолевой терапии [57]. Далее эта библиотека пептидов заложила основу для картирования неконтролируемых эпитопов, чтобы выявить предполагаемый определенный эпитоп распознавания реакций SpCas9 индуцированных Teff и Treg клеток [56]. Потенциальным недостатком библиотеки пептидов является неограниченны размер пептидов, который может привести к недооценке количества T клеток со специфичностью к более длинным, нешаблонным пептидам, напр., к тем, которые были описаны как мишени для CD8+ Treg [58].
Предопределение прежде сенсибилизации Т клеток посредством активации маркера CD137 указывает на очень высокое, почти повсеместное превалирование SpCas9-реактивных T клеток [43, 44]. Согласно нашим результатам, существенная фракция SpCas9 активированных CD4+ T клеток обладает фенотипом, ассоциированным с Treg клетками [44]. Поскольку бактерии комменсалы, как известно, способствуют Treg кдеткам на иммунологических поверхностях, колонизация Cas9-экспрессирующими бактериальными линиями может индуцировать специфические для Cas9 Treg клетки у людей.

Cas9-reactive Treg cells in humans


Благодаря иммуно-регуляторным функциям Treg клеток, обеспечиваются эндогенных груз-специфичных Treg клеток, также как и перенос груз-специфических Treg клеток, что может служить в качестве мощного воздействия, чтобы улучшить долговременные результаты in vivo генотерапии, без необходимости увеличивать обычное иммуно-супрессивное воздействие [10]. Обогащенные SpCas9-реактинвые Treg клетки человека могут снижать пролиферацию, а также продукцию цитокинов Cas9-реактивными Teff клетками во время in vitro исследований с высоким соотношением Treg к Teff [44]. Следовательно, иммунные мониторинг, как нацеленных на Cas9 эффекторных клеток, так и реакций Treg при CRISPR-Cas клинических испытаниях может предоставить информацию, действительно ли генотерапия, нацеленная на иммунные реакции, является пригодной, супрессивной или вредной активности, исходя из соотношения Teff/Treg в периферической крови. Несбалансированное соотношение Teff/Treg, склоняющееся в направлении высокой частоты воспалительных клеток или выраженной CD8+ T клеточной реакции может сделать возможным риск стратификации для будущих испытаний и в принципе исключить пациентов с высоким риском в отношении Cas9-ассоциированной in vivo генотерапии (Fig. 2). Сходным образом, Teff/Treg соотношение было использовано и для др. клинических показаний, позволяющих предсказывать клинические исходы, напр., после трансплантации аллогенных стволовых клеток [59].


Need for animal models that account for mixed preexisting immunity to Cas9


Поскольку классические модельные животные для генотерапии - включая нечеловеко-образных приматов - не являются хозяевами человеческим commensal бактериям, таким как S. pyogenes, они не могут отражать иммунную сенсибилизацию людей. Поэтому они являются субоптимальными для оценки влияния на иммунитета на CRISPR-Cas при воздействии in vivo. В качестве первой ступени в направлении более сложной модели, Li et al. cгенерировали мышиную модель с предсуществующими Teff клетками с помощью подкожной вакцинации небольшими количествами SaCas9 белка. Спустя неделю после иммунизации, нацеленные на печенть AAV вводили системно. Поскольку редактирование и AAV-обусловленная экспрессия GFP первоначально наблюдалась в гепатоцитах, спустя 12 недель отредактированные по гену клетки элиминировались, преимущественно за счет реакции CD8+ T клеток. Это коррелировало с повреждениями печени, обнаруживаемыми с помощью гистологической проверки, и повышение печеночных энзимов в сыворотке. Интересно, что Li et al. выявили увеличение абсолютных величин Treg клеток только после иммунизации белком SaCas9, , следовательно, увеличение количества Treg вряд ли связано с AAV или др. антигенов. Не было исследовано, действительно ли эти Tregs являются специфичными для SaCas9, это могла бы, до некоторой степени объяснить их неспособность предупреждать отторжение отредактированных по гену клеток. Дальнейшая характеризация этой модели нуждается в определении степени, с которой смешанный предсуществующий иммунитет, касающийся как эффекторных T cells , так и Tregs со специфичностью к Cas9, присутствует. В целом, необходимо больше моделей с предсуществующим иммунитетом к Cas9. Это может быть особенно важным при изучении улучшенных и переносимых векторов или при совместном воздействии, поскольку соотношение между антиге-специфическими Teff/Treg , как было установлено, предсказывает результат иммунного отторжения (высокое: воспаление, низкое: толерантность).

No immunogenicity events reported in immunocompromised patients receiving ex vivo cultured and SpCas9 edited cell products


Риск иммуногенности CRISPR-Cas9 редактирование генов у людей в основном зависит как и куда доставляется система. С момента in vivo терапии Cas9 добавляются уникальные затруднения в виде иммуногенности векторов и факторов хозяина (будут рассмотрены ниже), доставка Cas9 in vitro культивируемые клетки дозволяет больший контроль над residual остатками в финальном продукте. Ex vivo редактирование генов клеточных продуктов вместе с методами временной доставки (плазмидной ДНК, мРНК , белка) ожидаются безопасными в большинстве случаев Cas9 они быстро деградируют и разбавляются в сильно пролиферирующих клетках [60]. Ранние сообщения о клинических испытаниях уже демонстрировали присутствие продуктов SpCas9-отредактированных T клеток и гематопоэтических стволовых клеток у пациентов [57, 61, 62]. Stadtmauer et al. продемонстрировали, что после электропортации CRISPR-Cas комплексов обнаруживаются лишь минимальные остаточные количества SpCas9 белка, обнаруживаемые в продуктах multiplex-отредактированных T клеток, перед вливанием [57]. Два из трех продуктов leukapheresis, которые служат в качестве источника материала, обладающего Cas9-специфическим T клеточным иммунитетом [57]. Xu et al. и Lu et al. использовали ДНК плазмиды для доставки CRISPR-Cas к их соотв. клеточным продуктам и не было выявлено достоверных, связанных с воздействием побочных эффектов после вливания [61, 62]. К сожалению, Cas9-вызываемые иммунные реакции не были измерены у пациентов и клеточные продукты не были оценены в отношении остатков Cas9 белка [61, 62]. Т.к. плазмиды приводят к высокой и длительной экспрессии, чем мРНК и белковые платформы, было бы интересно сравнить с Stadtmauer et al. [63, 64]. Ни одно из этих трех исследований не сравнивало SpCas9-специфические иммунные ответы до и после применения клеточного продукта. Все пациенты страдали от продвинутых злокачественных болезней и получали или lymphodepletion или химиотерапию до вливания клеток.
Эти результаты обнадеживают относительно безопасности, хотя всё ещё очень мало пациентов, которым вводили CRISPR-Cas редактирующую генотерапию и ни одно испытание оказалось неспособным продемонстрировать клиническую эффективность в этом отношении. Кроме того, все пациенты обнаруживали нарушения иммунной системы, обусловленной болезнью и режимом воздействия перед введением клеток. Идущие и будущие исследования ex vivo модифицированных клеточных продуктов д. изучать гуморальные и клеточные иммунные реакции, поскольку этот феномен может вносить вклад в субоптимальные исходы лечения за счет частичной элиминации введенных клеточных продуктов.

Immunogenicity issues of in vivo CRISPR-Cas therapeutics


В целом эффективная in vivo генотерапия д. преодолевать три основых иммунологические затруднения: (1) доставка клеток мишеней без нейтрализации их антителами, (2) избегать обнаружения и элиминации c помощью реакции T клеточной памяти в отношении вектора или груза после доставки (3) предупреждать последующую индукцию иммунных реакций в отношении trans- или откорректированных здоровых генов. Т.о., базирующиеся на CRISPR-Cas9 стратегии и предсуществующий Cas9-вызываемый T клеточный иммунитет могут добавлять проблемы в виде наследственной иммуногенности вирусных векторов [2].
Большинство CRISPR-Cas терапевтических вмешательств имеет целью экспрессировать или Cas9 в клетках мишенях посредством нуклеиновых кислот или упаковки белка утри вирусной капсиды или нано-частиц [65-68]. Следовательно, предсуществующие анти-Cas9 нейтрализующие антитела д. влиять только на успешность, когда Cas9 воздействует внеклеточно или без векторной оболочки, как после непосредственной инъекции в ткань [69].
Клеточный иммунитет к CRISPR-Cas состоит из двух компонентов: (i) прирожденный иммунный контроль, ассоциированный с молекулярными паттернами индуцированных цитокинов и хемоаттрактантов для иммунных клеток. Это способствует и привлекает ключевые медиаторы из (ii) адаптивного иммунного ответа, включая B клетки и T клетки. Напр., последовательности нуклеиновых кислот в геноме AAV вектора запускают TLR9 и индуцируют типа I интерферон [70]. В свою очередь, интерфероны усиливают экспрессию MHC на иммунных клетках и даже на эпителиальных клетках мишенях [50, 70], инициируя тем самым запуск адаптивной иммунной системы и повышая риск детекции Cas9 c помощью предсуществующих memory T клеток. Сходным образом, не модифицированные концы РНК одиночных гид РНК индуцируют интерферон посредством передачи сигналов RIG-1, которая способствует жизнеспособности клеток и снижает эффективность [71]. Удаление 5'-triphosphate концов или химические модификации sgRNA c помощью 2'-O-methyl 3'phosphorothioate мостиков редуцируют прирожденную передачу сигналов и усиливаю геномное редактирование в клетках людей [71, 72].
В противоположность обычной генотерапии, CRISPR-Cas редактирование генов делает возможным длительно длящийся клинический эффект с ограниченным временем экспрессии. В зависимости от иммуногенности, "hit-and-run" подходы особенно многообещающие, благодаря иммунитету Т клеток, и это единственные действуют эффективно, пока антигенные фрагменты располагаются на клеточной поверхности. Оптимизированные методы, такие как доставка временных компонентов c помощью само-инактивирующихся векторов [73-75] или наночастиц [36, 76] может тем самым существенно снизить риск вредных иммунных реакций. Managing immunity to CRISPR-Cas therapых иммунных реакций.

Certain organs including the eye and the central nervous system are considered


ЦНС и глаза являются иммуно-привилегированными с очень низкими уровнями иммуногенности, связанной с событиями в целом, хотя подгруппа пациентов обнаруживает иммуногенность к родственным событиям [77-81]. Cas9 белки могут быть преобразованы путем удаления эпитопов, распознаваемых циркулирующими в крови цитотоксическими CD8+ T клетками [46]. Напротив, Cas системы, выделенные из бактерий, с которыми люди не сталкивались, преодолеть проблему предсуществующего иммунитета [82].
Чтобы задержать и предупредить иммунные реакции в клинике, используются многие иммуно-супрессирующие лекарственные воздействия при использовании вирусных векторов для генотерапии [1]. Природные иммунные реакции могут быть ослаблены с помощью воздействия стероидов после генотерапии глаз [2, 83]. При др. признаках, включая гемофилию, оральная иммуносупрессия неспособна предупредить клеточные иммунные реакции против белков капсид AAV у некоторых пациентов, ограничивая тем самым долговременную экспрессию трансгена. Поэтому, проводятся более интенсивные воздействия по кондиционированию и иммуносупрессии, включая режимы деплеции Т клеток [2, 84, 85]. Напротив, предотвращение процессинга или презентации трансгена или антигенов вектора во время инициальной доставки вирусом гена можно себе представить [86].
В случае, когда одиночная in vivo генотерапия индуцирует недостаточный или преходящий клинический успех, вторичное применение может оказаться необходимым , чтобы оптимизировать результате лечения. Поэтому важно учитывать иммунологические последствия повторной дозы. Moreno et al. полагают, что иммунная ортогональность между Cas9 гомологами и серотипами AAV может быть использована для последовательного применения базирующейся на Cas терапии [87]. В обстоятельном сообщении они продемонстрировали, что иммунные реакции на AAV и Cas гомологи отличаются существенно, несмотря на умеренное сходство белковых последовательностей в определенных эпитопах (SpCas9 -> AsCpf1 = 38% идентичных последовательностей белка, SpCas9 -> SaCas9 = 26% идентичных последовательностей белка) [44]. Это делает возможными серийные раунды повторного использования дозы у мышей, когда используются очень отличающиеся AAV серотипы [87]. Подходит ли эта концепция для людей с предсуществующими поли-клональными иммунными реакциями, необходимо выяснить. Важно, что пептидные последовательности двух ограниченных HLA-A2 immunodominant эпитопов, идентифицированных Ferdosi et al. [46] (HLA-A*02:01; SpCas9_240-248 и SpCas9_615-62) присутствуют в Cas гомологах от др. бактерий и даже в белках неродственных бактерий, хотя всё ещё неясно, присутствуют ли эти фрагменты in vivo [42].

Exploring Cas9-specific Treg cells to facilitate safe and efficient gene editing in vivo


Высокая экспрессия антигенов в печени, как было установлено, истощает Teff и индуцирует Treg клетки, направленные против векторов и трансгенов [11, 88]. Совместная доставка трансгенов в печень, как было установлено, способствует толератности многих др. органов с помощью трансген-специфичных Tregs [2, 13, 89]. Они могут специфически устранять MHC комплексы из антиген-презентирующих клеток [90], но также осуществляют управляемую антигеном супрессию свидетелей (bystander) посредством механизмов, суммированных рнаее (Fig. 1). Подобно печени подход совместной доставки, способствует увеличению количества и миграции Cas9-реактиных Treg клеток, он также может служить в качестве платформы для индукции толерантности независимо от ткани мишени.
Знание структуры антигена, которые помогают определенным Treg клетка осуществить иммунную реакцию на Cas9 могут позволить создать новую иммунотерапию, чтобы способствовать иммунной толерантности при in vivo подходах с долговременной экспрессией Cas9. Ранее мы показали, что anti-Cas9 Teff и Treg клетки могут распознавать определенные фрагменты Cas9, как показывает минимальное клональное перекрывание между их TCR репертуарами [44]. Сходным образом, это было показано как для aeroantigens при алергии, так и при нео-антигенах в раковых тканях [9, 91]. Уникальные возможности д. использоваться , следующим образом,:

(i) Адоптивный перенос Cas9-специфических Treg, генерируемых стратегией поли-клональной экспансии, используемый в клинике [92, 93] или для улучшения частоты, подогнанных протоколов с предварительным антиген-специфичным обогащением перед экспансией. Альтернативно, редактирование генов и перенос Cas9-специфических TCRs в (индуцированные ) Tregs можно себе представить [94-96]. Ранее было показано, что поли-клональные ex vivo размноженные Treg клетки могут предотваращать адаптивные реакции Т клеток на генотерапию [17]. Большой массив доказательств подтверждает, что антиген-специфичные Treg клетки являются более мощными, чем поли-клональные продукты для трансплантации и аутоиммунитета, а также для генотерапии [18, 94, 97, 98]. Антиген-специфичные Cas9-реактивные Treg клетки могут быть размножены в клеточной культуре и совместно введены вместе CRISPR-Cas терапией [97, 98].

(ii) Создание преобразованных Cas вариантов с мутантными эпитопами, чтобы избежать распознавания c помощью предсуществующих Teff, но с сохранением эпитопов, стимулирующих Treg клетки может позволить обойти необходимость в глобальной иммуносупрессии у пациентов с выраженной предсуществующей Т клеточной иммунореактивностью к SpCas9. Соотв., Ferdosi et al. создали невидимые для иммунитета ("immunosilenced") SpCas9 варианты посредством целевых мутаций в двух иммунодоминантных эпитопах, распознаваемых c помощью предсуществующих CD8+ T клеток у HLA-A2+ доноров при сохранении функции и специфичности ([46] и подобно подходу согласно патенту WO 2017/ 081288 Al). Однако, может оказаться необходимым мутирование более двух эпитопов внутри белка Cas9, чтобы избежать всего предсуществующего иммунитета Teff и пока неясно, будет ли такой с многими мутациями Cas9 белок сохранять полную активность и специфичность.
Финальным соображением относительно безопасности индукции и переноса Treg является то, что высокие частоты Cas9-специфичных Treg клеток могут притуплять иммуннные реакции в отношеннии факультативных патогенов, подобных S. pyogenes. Т.о., определенный риск безопасности после Cas9-специфической индукции и вливания Treg клеток может повышать риск инвазивной инфекции. Несмотря на это, большинство взрослых обладают защитными антителами, направленными против оболочечных белков патогенов и T клеточным иммунитетом против др. антигенов. Регулярный анти-микробный иммунитет д. сохраняться, т.к. Treg клетки не блокируют и не подавляют секрецию антител плазматическими клетками.

Final summary and outlook


Gene therapy is currently entering “a modern era”, with rising numbers of clinical trials taking place and the expectation that commercially available products will arrive within this decade [80, 99]. The discovery of CRISPR-Cas9 has significantly amplified the general excitement about gene therapies [19, 100]. As CRISPR-Cas based therapeutics race to the clinics, it is important to remember the history of gene therapy and its prior shortcomings regarding immunogenicity issues [1]. The death of 18-year old Jesse Gelsinger due to an over immune response to a high dose of adenoviral gene therapy vector halted the entire field of gene therapy for at least a decade [101]. Historically, viral gene therapies have struggled with toxicities especially after systemic application of high vector doses, some related to immunogenicity [102, 103]. Recently, two deaths were reported within an AAV trial for X-linked myotubular myopathy which mirrored the symptoms of liver failure observed in Jesse Gelsinger (although full data are not yet available as a peer-reviewed manuscript) [104]. Therefore, the identification of preexisting immunity to Cas homologs is timely and important to guide the design of better and safer clinical trials.
Preexisting immunity to Cas9 is a safety concern for in vivo application of the technology, that is unaccounted for in common model organisms, creating an urgent need for better models to evaluate CRISPR-Cas9 in vivo therapeutics. As Cas9-specific Teff and Treg cells can be enriched from peripheral blood in humans [105], this allows for the evaluation of their effects on the success of gene therapies using advanced in vitro models. Clinically, stringent immune monitoring could provide information on the role of endogenous Cas9-reactive Treg cell repertoires during first in vivo gene therapy trials. Potentially, immunotherapies to boost the frequencies of Cas9-specific Treg cells prior and during gene therapy may represent an attractive platform to promote tolerance. Therefore, CRISPR-Cas therapeutics could become a model in which to study the potential “beneficial alliance” between gene therapy and antigen-specific Treg cells [10].