Т.к. доступны мышиные, собачьи и свиные модели с мутациями dystrophin, поэтому новые терапевтические подходы интенсивно исследовали преклинически путем замещения гена mini- или micro-dystrophins. Преднамеренное укорочение dystrophin с терапевтической целью базируется на двух элементах: во-первых, терапевтический вектор с высокой степенью myotropism и низкой токсичностью и иммуногенностью при системном применении, такой как adeno-associated virus (AAV), который безопасно используется в клинических испытаниях. Во-вторых, благодаря ограниченной способности AAV упаковывать, необходимы укороченные формы dystrophin. Действительно, укороченные формы dystrophin, лишенные экзонов 17-48 достаточны для нормальной подвижности [21], это ведет к широкому кругу mini- и microdystrophin конструкций для терапевтического использования [22] (rev. D. Duan [23]). Напр., минимальная версия dystrophin, лишенная spectrin-like повторов (R) 1-24 [24] в палочковидном домене дистрофина, но сохраняющая шарниры 1 и 4 и полные N- и C-концы, или лишенные R2-15/R18-19/R20-23 и C-конца [25], могут быть упакованы в AAV. У mdx модельных мышей DMD (спонтанная мутация, вносящая стоп-кодон в экзон 23) [26], то первая AAV9-based терапия по добавлению гена улучшала морфологию и функцию сердца, как было показано гистологически снижением фиброза за счет фракционного укорочения функции насоса и по биомаркерам, указывающим на сердечную недостаточность, таким как brain natriuretic пептид. В этом специальном случае специфичный для сердца промотор оказался эффективным как повсеместно экспрессирующийся CMV-промотор [24]. У собак, моделирующих DMD (GRMD, точечная мутация в интронном 6 splice акцепторе привела к потере экзона 7), последний подход (Δ R2-15/R18-19/R20-23/C) восстанавливал ассоциированный с дистрофином комплекс, снижал воспаление и фиброз [25]. Совсем недавно на той же самой модели GRMD была подтверждена эффективность AAV8-microdystrophin (Δ R4- 23/Δ CT) после локального (LR) или внутривенного (iv) введения [27]. Применение LR терапевтического вектора достигло максимума трансдукции (43-59% среди мышечных клеток мишеней), и улучшения функции, тогда как iv инъекции улучшали клинический показатель у GRMD зависимым от дозы способом (with 1 х 1014 вирусных геномов для возобновления качества ходьбы , сравнимого с контрольными собаками) [27].

Между тем три компании разработали AAVs, кодирующие микро-дистрофин: Sarepta использовала &dela;R4-23/&dela;CT microdystrophin, описанный выше, тогда как Solid Biosciences использовали &dela;R2-5/&dela; 18-2/δ CT форму, а Pfizer δR3-18/&dela;CT конструкцию, каждый под контролем специфичного для мышц промотора. Пока проводятся клинические испытания, имеющие целью экспрессию dystrophin. Их результаты, как полагают, откроют новые возможности для коррекции генов.

Как было описано выше, молекулярная терапия делает возможной экспрессию укороченного дистрофина. Однако, беспрецедентные возможности коррекции болезнь-вызывающих мутаций возникают при использовании Crispr-Cas9 технологии (Fig.1). Fig. 1: Sketch of the experimental workflow: Patient cells lacking DMD exon 52 were converted to iPS cells and subsequently to muscle cells.

An intein-split version of Cas9 was encoded into two AAV vectors, together with two gRNAs excising exon 52. Demonstrating that the AAV-Cas9-gRNAs excising exon 51 (AAV-Cas9-gE51) enabled expression of a shortened but stable dystrophin (51-52, the same approach was successfully used in the porcine model of DMD (lacking exon 52), serving as basis for further development of a therapeutic agent.

C началом генерации Cas9-трансгенных мышей [28], которые делают возможными получение точечных альтераций генов, особенно в органах мишенях, с помощью кодирования AAVs соотв. guide RNAs (gRNAs), стало ясно, что неизбежным способом воздействия на наследственные болезни станет изменение с помощью Cas9 -обеспечиваемой коррекции. Хотя определенные ограничения всё-таки существуют, такие как предпочтение non-homologous end-joining (NHEJ) в противовес homology-directed repair (HDR) после ферментативного разреза двунитчатой ДНК с помощью Cas9, или способность к упаковке AAVs, мышечные дистрофии, по-видимому, являются идеальными мишенями для геномного редактирования. DMD мутации, вызывающие DMD, по-видимому, особенно пригодны, т.к. внутренние укорочения белка могут приводить к синтезу укороченного, но стабильного белка с частичным восстановлением функции и медленным прогрессированием болезни, как эт наблюдается при аллеле Becker muscular dystrophy (BMD).

Группа E. Olson впервые показала, что коррекция мутаций потери функции в экзоне 23 у mdx мышиных зигот возможна [29]. Безусловно комбинация Cas9 с одиночной gRNA была использована для нанесения разрезов вблизи мутации, если это сопровождалось добавлением однонитчатого oligodeoxynucleotide, матрицы, то это делало возможным эффективную HDR у7 и NHEJ у 4 из 11 описанных откорректированных mdx мыщей. В то время как HDR коррекция в 41% геномов у мозаичных мышей была достаточной для полного восстановления экспрессии дистрофина в исследуемых мышцах, a 17% уровень HDR коррекции давал 47-60% мышечных волокон, экспрессирующих dystrophin, указывая тем самым на селективные преимущества коррекции мышечных и сателлитных клеток. Перемещение коррекции DMD на постнатальную арену той же самой группой [30] и др. [31-33] продемонстрировали пригодность базирующегося на AAV системного воздействия Cas9, хотя и с др. успехом. Напр., Han с сотр. использовали одиночный AAV, кодирующий Staphylococcus aureus (Sa)Cas9 с двумя гид РНК (guides), вызывающих эксцизию экзонов 21-23, для системной доставки вплоть до 1 Х 1012 vg in mdx/Utr+/- мышей, это приводило к улечшению мышечной силы и снижению фиброза [33]. Напротив, др. Группы использовали два AAVs, содержащих или Sa- [31, 32] или SpCas9 (Streptococcus pyogenes) версии [30], скомбинированные или с одной [30] или двумя guides [31, 32], инъецирующими 1.5 х 1012 [31], 2 х 1012 [32] или 1 х 1013 вирусных геномов [30] системно. Bengtsson et al. Показали эффективность AAV6-Cas9-sgRNA трансдукции, которая улучшала мышечную структуру и функцию у модифицированных mdx мышей (mdx [4cv]) , имеющих nonsense мутацию в экзоне 53 [34]. Во всех случаях наблюдалось достоверное увеличение экспрессии дистрофина и мышечной функции, указывающие, что комбинация AAV, Cas9 и соотв. guides может быть использована для лечения DMD путем удаления мутантного экзона и восстановления интактной рамки считывания мышиного Dmd гена.

Крупные животные, которые лучше отражают клиническую ситуацию, могут иметь др. проблемы, напр., относительно дозы, токсичности и способа введения. Исследование группы Amoasii of the Olson [35] первыми заинтересовавшиеся моделями DMD. В их модели спонтанно исчез экзон 50, обнаруживающей типичные признаки болезни человека, такие как мышечная слабость, атрофия и фиброз. Комбинация 1.2 х 1013 vgs каждого вектора, AAV9-Cas9 и второго AAV9, кодирующего одну gRNA, нацеленную на регион, соседствующий с для экзона 51 сайтом сплайс-акцептора (sgRNA-51) [35], этого было достаточно, чтобы индуцировать экспрессию dystrophin вплоть до 62% после внутримышечной инъекции. Системное введение 1 х 1013 и 1 х 1014 vgs/kg у одной собаки, каждый из которых делал возможным увеличение экспрессии dystrophin, до 70% от контроля в скелетных мышцах и до 92% в сердце при более высоких дозах у собак.

Наша группа использовала модельных свиней DMD, поученных путем целенаправленного замещения DMD экзона 52 кассетой резистентности к neomycin в соматических клетках. Ядра из клеток DMD-52 свиней были затем использованы для somatic cell nuclear transfer (SCNT) [36]. Первоначально мутация DMD-52 вносилась в клетки самцов. Поэтому, все поросята, получаемые после SCNT, были дефицитны по дистрофину и обнаруживали клинические, биохимические и патологические признаки DMD человека, но прогрессировали они в ускоренном темпе [36]. Потенциальным объяснением ускоренной прогрессии патологии DMD у поросят, стала ассоциация с характерными изменениями профиля протеома скелетных мышц [37] и миокарда [38], и быстрый рост мышц за счет гипертрофии мышечных клеток и связанного с этим механического воздействия на сарколемму. Со временем клонированные DMD поросята погибали до достижения половозрелости с максимумом продолжительности жизни 3-4 мес., модель не может быть размножена разведением. Химерные добавления DMD-52 эмбрионов самцов с эмбрионами самок дикого типа приводили к появлению взрослых фенотипических самцов, которые передавали DMD мутацию посредством своих спермиев [39]. В качестве альтернативного подхода мы вносили гетерозиготную DMD-52 мутацию в клетки самок и генерировали с помощью SCNT клинически здоровых самок переносчиков [36], которые и были использованы для разведния с самцами дикого типа, для получения разводимой колонии. Все генотипы потомков, т.e., мужского пола DMD поросята, самки носительницы, а также самцы и самки дикого типа появлялись в соотв. Менделю соотношении в 25% каждый. Т.о., DMD поросята рутинно поставлялись для экспериментов по редактированию генов. Модель характеризовалась высокой гибелью после рождения (45 из 73 DMD поросят погибали в течение первой). Более того, ни одно из животных не жило дольше 105 дней.

Мутации нарушения рамки считывания возникали в результате отсутствия экзона 52 у наших модельных свиней, подходящих для терапии путем индуцированного Cas9 дополнительного пропуска экзона 51, для этого были разработаны две gRNAs и протестированы in vitro. Однако, в попытке комбинировать их с системой AAV вектора, мы уменьшили размер Cas9, как это делалось для получения микро-дистрофинов. Т.к. возможность упаковки rAAVs позволяла поместить максимум ~4.7 kbp [40, 41], тогда как человеческая оптимизированная Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), кодирующая последовательность уже содержала более 4.2 kbp. В комбинации с промотором и последовательностью gRNA, конструкция превышала 5 kbp, что осложняло эффективную продукцию rAAV для переноса всей CRISPR/Cas9 нуклеазной системы.

Разные стратегии для уменьшения размера SpCas9 были исследованы, напр., путем делеции 133 аминокислот несущественной части REC2 доли. Однако, этот укороченный вариант SpCas9 сохраняет менее 50% активности дикого типа [42]. Использование более коротких ортогональных SpCas9 белков, напр., подобно Staphylococcus aureus (SaCas9) [43], нуждаются в более сложных PAM последовательностях, которые затрудняют идентификацию пригодных сайтов мишеней.

Чтобы преодолеть эти ограничения и получить универсальную AAV совместимую Cas9 систему экспрессии, мы разработали extein/intein split-версию Cas9 [44]. Общая структура Cas9 в своей apo- и RNA/DNA связанной holo-form была охарактеризована детально. Белок состоит из двух долей: recognition lobe (REC) и nuclease lobe (NUC). Эта двух-долевая структура Cas9 подвергается существенным конформационным перестройкам после соединения с gRNA/DNA комплексом [42, 45]. Это структурное свойство делает возможным рациональное преобразование Cas9.

Inteins могут аутокаталитически вырезать из белка и ковалентно соединять оставшиеся фланговые регионы (exteins) при этом соединение в пептиде не приводит к образованию рубца [46]. Мы проверяли extein/intein систему DNA polymerase III DnaE из сине-зеленой водоросли Nostoc punctiforme, которая расположена в двух генах. N-intein и C-Intein распознают др. др., сплайсируют сами себя и одновременно соединяют N- и C-терминальные exteins вместе, давая в результате функциональный полной длины белок DnaE [46]. Чтобы обеспечить высокую эффективность сплайсинга необходимы Cys, Ser или Thr остатки на N-конце слияния C-Intein_C-Cas9 [40, 47]. Базируясь на этом, для версии (SpCas9 [1-573] и SpCas9[574-1368]) N- и C-терминальные inteins были вставлены между Glu573 и Cys574. Во всех успешных экспериментах split версия была столь же эффективной, как и дикого типа Cas9 в отношении частоты геномного редактирования.

Использование такого AAV9-intein-split Cas9 подхода с двумя gRNAs в 2 х 1013 vgs/kg, вводимыми внутримышечно выявило мощную, локальную реакцию, уровни белка дистрофина увеличивались до 32% дикого типа, этого оказалось достаточно для улучшения свойств мышечных волокон, таких как , ferret диаметр и пропорция централизованных ядер [48]. Высокая доза AAV9-Cas9-gRNA векторов (2 х 1014 vgs/kg) расширяла экспрессию дистрофина на диафрагму и сердце, достоверно сдвигая Kaplan-Meier кривую доли выживаемости в сторону увеличения. Более того, механизм преждевременной гибели, которая возникает внезапно в природе, и без предварительных признаков сердечной недостаточности, является аритмогенным, т.к область амплитуды низкого возбуждения была больше у нелеченных DMD животных и снижалась при высокой дозе воздействия Cas9-gRNA. Более того, при углубленном анализе передача сигналов кальция на срезах сердца ex vivo и в AAV9-трансдуцированных кардиомиоцитах выявляется расширение потенциала действия и несинхронизированные региональные возбуждения кардиомицитов, соотв.

Эксперименты на свиньях были дополнены людскими induced pluripotent stem cells (iPSCs) от пациентов с Duchenne, несущих DMD дефицит экзона 52, аналогичный тому, что у крупных модельных животных. Здесь миобласты, происходящие из непреобразованных iPSCs. Были неспособны далее дифференцироваться в мышечные волокна, и были лишены признаков мышечного развития, таких как TTN, MYH1 и CDH15. После коррекции iPSCs или после применения AAVs, содержащих Cas9 и человеческие gRNAs, мы оказались способны вызвать дальнейшую дифференцировку миоцитов и экспрессию саркомерных белков.

В свете возникающей новой терапии, возникают вопросы экономических; наша группа исследовала cost of illness (COI) для DMD и более слабой BMD в социо-экономической и клинической перспективе в связи с лечебной и фенотип-модифицирующей терапией [49].

У 363 пациентов с генетически подтвержденной DMD или BMD, были оценены затраты на прямое медицинское обслуживание, косвенные и неформальные затраты на ухаживания и health-related quality of life (HRQOL). Подсчитано ежегодное бремя болезни, включая прямые медицинские и не медицинские, косвенные и неформальные затраты на обслуживание DMD в целом составляет € 65263, которые почти вдвое выше по сравнению с € 36,651 при BMD. Эти затраты сравнимы с недавним международным исследованием, включающим пациентов из Италии, UK и US помимо Германии [50]. Общие ежегодные затраты колебались в пределах от 42140 $ (Italy), 63250$ (Germany), 72870 $ (UK) и 75820$ (US) в 2012. Затраты на неформальный уход, косвенные затраты, вызванные потерей работоспособности пациентов и на лиц, осуществляющих уход, и не медицинские затраты были определены как очень важные факторы затрат. Общая стоимость значительно увеличивалась с прогрессированием заболевания и клинической тяжестью проявлений относительно всех статей затрат, включенных в исследование, тогда как качество жизни, связанное со здоровьем (HRQOL), снижалось с прогрессированием заболевания. Затраты на неформальный уход, косвенные затраты, вызванные потерей производительности и отсутствием на работе пациентов и лиц, осуществляющих уход, и немедицинские затраты были определены как очень важные факторы затрат. Общая стоимость значительно увеличивалась с прогрессированием заболевания и клинической тяжестью отдельного фенотипа относительно всех статей затрат, включенных в исследование, тогда как качество жизни, связанное со здоровьем (HRQOL), снижалось с прогрессированием заболевания. Эти экономические оценки здоровья очень важны для финансирования программ развития редких заболеваний, поскольку ранняя оценка пользы необходима для возмещения затрат на терапию и открывает путь пациентам к новой терапии.

Although Duchenne's muscular dystrophy is a disabling and immobilizing disease with a shortened life span and grave implications with regard to quality of life, the current standard of care has prolonged life expectation by improving care and prophylaxis. A variety of anti-inflammatory and novel pharmacological drugs are studied in clinical trials, such as Vamorolone, NF kB-, myostatin- and histone acetylase inhibitors as well as anti-CTGF antibodies (Fig. 2).

Fig. 2: Effects of DMD treatment: DMD muscle fibres without treatment display hallmarks of muscle decay, such as centralized nuclei, fibrosis, capillary rarefaction and continuous inflammation (no treatment).

Upon current and novel pharmacologic treatment, inflammation and muscle fibre decay may be decelerated, without alteration of the underlying mechanical strain leading to cell death, e.g., by necroptosis. In contrast, therapeutic strategies aiming at dystrophin re-expression (AONs?=?antisense olignucleotides targeting exon skipping) correct the disease-causing deficit of dystrophin, either temporally (AONs), or for prolonged intervals (AAV-microdystrophin) or permanently (AAV-Cas9).

In contrast to these pharmacological approaches, a variety of therapies is aiming at re-expression of dystrophin. As a small molecule, Ataluren is tested in DMD for providing stop-codon readthrough. As antisense oligonucleotide providing exon skipping, eteplirsen gained approval by the FDA. Three different microdystrophins, encoded in AAV vectors, are followed by companies in clinical trials, with results awaited in the coming years.

The latest development comprises the attempt to correct the genetic mutation by AAV-Cas9-gRNA transduction. For that approach, a two-virus system with a suitable Cas9 (being <4.7 kB in size) may be utilized, or a split-intein Cas9, which is distributed evenly with gRNA on 2 AAVs. Both approaches have proven efficacious in large animal models [35, 48]. Off target effects, which were analyzed by gene enrichment and NGS techniques, were not detected. Thus, gene editing by Cas9 and gRNAs for exon snipping may offer a path to future development of a clinically applicable therapeutic option. The development of non-invasive imaging biomarkers, such as multispectral optoacoustic imaging which has been validated in the DMD pig model [51], will support these efforts by allowing longitudinal efficacy monitoring.